【摘要】目的探討β-連環(huán)蛋白異常表達(dá)和c-myc陽性表達(dá)在肝門部膽管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及其機(jī)理。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法對(duì)42例肝門部膽管癌及10例膽管良性病變組織中的β-連環(huán)蛋白和c-myc蛋白進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果β-連環(huán)蛋白在10例膽管良性病變組織中均呈正常表達(dá)，且c-myc均呈陰性表達(dá)； 而在42例膽管癌患者中30例癌組織細(xì)胞胞漿內(nèi)的β-連環(huán)蛋白的異常表達(dá)率明顯高于膽管良性病變組織，且異常表達(dá)率與肝門部膽管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.05），而與肝門膽管癌大小、分化程度和侵襲狀況無關(guān)（Pgt;0.05）。膽管癌中c-myc表達(dá)陽性率與肝門膽管癌的大小、侵襲狀況及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（Pgt;0.05），而與肝門部膽管癌的分化程度密切相關(guān)（P＜0.05）。β-連環(huán)蛋白異常表達(dá)與 c-myc陽性表達(dá)在肝門部膽管癌中呈顯著的正相關(guān)性（r=0.324,P＜0.01）。結(jié)論肝門部膽管癌細(xì)胞中存在β-連環(huán)蛋白異常表達(dá)和c-myc蛋白陽性表達(dá)的現(xiàn)象，與膽管癌的一些生物學(xué)行為密切相關(guān)。β-連環(huán)蛋白的異常表達(dá)可能是肝門部膽管癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理之一。
目的探討生長(zhǎng)抑素類似物8肽（SS8）對(duì)人原發(fā)性肝癌細(xì)胞凋亡和cmyc蛋白表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞SMMC7721，用10 μg/ml SS8處理后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡率和cmyc蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，SS8使實(shí)驗(yàn)組S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)減少、G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加，兩組細(xì)胞的凋亡率分別為6.1%和14.2%，差異有顯著性意義（P＜0.05）。經(jīng)SS8作用24 h后，實(shí)驗(yàn)組cmyc蛋白表達(dá)水平為0.833±0.035，與對(duì)照組相比差異無顯著性意義（P＞0.10），而在SS8作用48、72、96、120和144 h后，實(shí)驗(yàn)組cmyc蛋白表達(dá)水平分別為0.818±0.04、0.721±0.029、0.669±0.026、0.648±0.045和0.642±0.028，較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論SS8有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721凋亡和降低cmyc蛋白表達(dá)的作用。
目的 設(shè)計(jì)、構(gòu)建并篩選出轉(zhuǎn)染至人骨肉瘤細(xì)胞系OS-9901，對(duì)c-myc 沉默效果最佳的復(fù)制缺陷型重組腺病毒質(zhì)粒pAd-c-myc- 短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）包裝出表達(dá)c-myc-shRNA 的重組腺病毒，并測(cè)定其滴度。 方法 設(shè)計(jì)有shRNA 結(jié)構(gòu)的3 對(duì)單鏈寡核苷酸（ss oligos），經(jīng)變性退火為雙鏈寡核苷酸（ds oligos），插入穿梭質(zhì)粒pENTR/U6 載體，測(cè)序正確后，經(jīng)LipofectamineTM2000 陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)入人骨肉瘤細(xì)胞系OS-9901，采用RTPCR篩選對(duì)c-myc 沉默效果最佳的穿梭質(zhì)粒pENTR/U6-shRNA，然后與腺病毒骨架質(zhì)粒行同源重組，篩選出正確重組子。采用293A 細(xì)胞包裝出表達(dá)c-myc-shRNA 的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，觀察其細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），采用病毒顆粒法（viral particles，VP）和50% 組織培養(yǎng)感染劑量法（50% tissue culture infective dose，TCID50）測(cè)定病毒滴度。 結(jié) 果 電泳驗(yàn)證后的ds oligos 插入穿梭質(zhì)粒pENTR/U6 載體，測(cè)序結(jié)果提示構(gòu)建的pENTR/U6-shRNA 質(zhì)粒正確。從3 對(duì)ds oligos 通過RT-PCR 方法篩選出對(duì)c-myc 沉默效果最佳的穿梭質(zhì)粒pENTR/U6-shRNA，經(jīng)Pac Ⅰ酶切線性化后同源重組成功構(gòu)建了介導(dǎo)c-myc-shRNA 復(fù)制缺陷型重組腺病毒，CPE 和空泡現(xiàn)象 3 d 開始出現(xiàn)，6 d 更加明顯。采用VP法測(cè)定的第1 代腺病毒滴度為5.23 × 109 VP/mL，經(jīng)3 ～ 4 代擴(kuò)增后可達(dá)2.26 × 1012 VP/mL。TCID50 證實(shí)病毒滴度為10-3.8/0.1 mL。 結(jié)論 通過RNA 干擾技術(shù)，體外成功構(gòu)建了介導(dǎo)shRNA-c-myc 復(fù)制缺陷型重組腺病毒。
目的 探討能否通過局部應(yīng)用c-myc shRNA抑制慢性增生性膽管炎(CPC)增殖相關(guān)基因的表達(dá)而抑制CPC的過度增殖行為和成石潛力。方法 經(jīng)十二指腸乳頭向膽總管逆行插入5-0尼龍縫合線建立CPC動(dòng)物模型(CPC組)。c-myc shRNA治療組在CPC組基礎(chǔ)上向膽總管內(nèi)分別注入3種c-myc shRNA即分別為c-myc shRNA-1、c-myc shRNA-2及c-myc shRNA-3，另設(shè)陰性對(duì)照組和假手術(shù)組。應(yīng)用HE、Massion和PAS/AB染色觀察膽管組織病理學(xué)變化，免疫組化法檢測(cè)c-myc蛋白表達(dá)，免疫熒光法檢測(cè)5-溴脫氧尿核苷(BrdU)蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)(RT)-PCR檢測(cè)c-myc、Mucin 3和Procollagen Ⅰ mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)Ki-67蛋白的表達(dá)，改良Fisherman法檢測(cè)β-葡萄糖醛酸酶(β-G)的活性。結(jié)果?、倥cCPC組及陰性對(duì)照組比較，c-myc shRNA治療組的膽管黏膜上皮(HE染色)、黏膜下酸性黏液腺體(PAS/AB染色中藍(lán)色)和膽管壁膠原纖維(Massion染色藍(lán)染)的過度增生程度明顯減弱，BrdU蛋白表達(dá)也明顯減弱。②c-myc、Mucin 3和Procollagen Ⅰ mRNA,c-myc蛋白，Ki-67蛋白,以及β-G活性在c-myc shRNA治療組均明顯低于CPC組及陰性對(duì)照組(Plt;0.05)，但均高于假手術(shù)組(Plt;0.05)。結(jié)論 c-myc shRNA治療能夠有效地抑制CPC的過度增殖行為和成石潛力，可能會(huì)有助于預(yù)防膽管再狹窄和肝內(nèi)膽管結(jié)石的術(shù)后復(fù)發(fā)。
目的 乙型肝炎病毒 X（hepatitis B virus X protein，HBx）蛋白通過調(diào)控蛋白編碼基因表達(dá)而廣泛參與人原發(fā)性肝細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱肝癌）的發(fā)生和進(jìn)展。本研究將 HBx 的調(diào)控功能拓展到非編碼 RNA 領(lǐng)域，探討 HBx 能否調(diào)控宿主肝癌細(xì)胞內(nèi) microRNA（miRNA）的表達(dá)，進(jìn)而參與肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及惡性轉(zhuǎn)化。 方法 利用高通量芯片分析及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）鑒定 HBx 在肝癌細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)的 miRNA 表達(dá)變化。通過系列蛋白和 mRNA 表達(dá)分析，細(xì)胞周期及凋亡實(shí)驗(yàn)以及螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)來檢測(cè) miR-16 家族表達(dá)抑制后 HepG2 肝癌細(xì)胞的生物學(xué)變化。 結(jié)果 芯片分析結(jié)果顯示，HBx 在 HepG2 細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)了大量的 miRNAs 表達(dá)變化，其中 miR-16 家族的低表達(dá)能在 HepG2、SK-HEP-1 及 Huh7 肝癌細(xì)胞中得到重復(fù)。同時(shí)，HBx 顯著上調(diào) miR-16 家族的靶基因 CCND1 的表達(dá)。c-myc 介導(dǎo)了 HBx 相關(guān) miR-16 家族沉默，外源表達(dá)的 miR-16/15a 能通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展和誘導(dǎo)凋亡而抑制 HepG2-hbx（穩(wěn)定表達(dá) HBx）細(xì)胞的增殖、克隆形成及非貼壁生長(zhǎng)能力。反之，沉默 miR-16 表達(dá)能促進(jìn) HepG2 細(xì)胞的周期進(jìn)展和生長(zhǎng)。 結(jié)論 HBx 能在體外改變肝癌細(xì)胞的 miRNA 表達(dá)譜，尤其是沉默 miR-16 家族表達(dá)。c-myc 高表達(dá)介導(dǎo)了 HBx 下調(diào) miR-15a/16 的過程且是 HBx 促進(jìn) HepG2 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化所必須的。因此，miR-16 家族可能成為 HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)。
目的探索姜黃素對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)后肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞中內(nèi)源性 β-葡萄糖醛酸酶（β-glucoronidase，β-GD）和 c-myc 表達(dá)的影響。方法① 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HIBEpiC 細(xì)胞進(jìn)行分組：空白對(duì)照組（0 h 組）及 7 個(gè)不同刺激時(shí)點(diǎn)組，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×104個(gè)/mL，5 個(gè)不同刺激時(shí)點(diǎn)組在培養(yǎng)基中加入 100 μg/mLLPS 分別刺激 1、3、6、18 及 24 h，另外取 2 份培養(yǎng)基，在 LPS 刺激 24 h 后更換為無 LPS 培養(yǎng)基，分別繼續(xù)培養(yǎng) 18 h和 24 h。② 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HIBEpiC 細(xì)胞進(jìn)行分組：空白對(duì)照組、LPS 組、LPS+低濃度姜黃素組、LPS+中濃度姜黃素組及 LPS+高濃度姜黃素組，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×104個(gè)/mL。除空白對(duì)照組細(xì)胞不加入任何試劑、LPS 組僅加入 100 μg/mL LPS 外，其余 3 組在培養(yǎng)基中加入 100 μg/mL LPS 的同時(shí)，分別給予 20、40 和 80 μmol/L姜黃素干預(yù)。采用 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞中 c-myc 和內(nèi)源性 β-GD 的表達(dá)水平。結(jié)果① 人正常肝內(nèi)膽管細(xì)胞中的內(nèi)源性 β-GD 和 c-myc 的表達(dá)水平隨著 LPS 作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，各時(shí)點(diǎn)組的 β-GD 和 c-myc 的表達(dá)水平與 0 h 組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。② 空白對(duì)照組、LPS 組、LPS+低濃度姜黃素組、LPS+中濃度姜黃素組及 LPS+高濃度姜黃素組間兩兩比較，c-myc 和 β-GD 的表達(dá)水平的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論姜黃素可抑制 LPS 誘導(dǎo)的內(nèi)源性 β-GD 表達(dá)的上調(diào)，而且其抑制機(jī)制可能與抑制 c-myc 的表達(dá)有關(guān)。
目的 探討VEGF 和c-myc在膽管癌組織中的表達(dá)和二者之間的相關(guān)性及其在膽管癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用。 方法 應(yīng)用免疫組化ABC法對(duì)38例膽管癌組織和20例正常膽管組織中VEGF 和c-myc的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果 VEGF 和c-myc在膽管癌組織中的表達(dá)陽性率分別為84.2%（32/38）和65.8%（25/38），明顯高于正常膽管組織中的表達(dá)陽性率〔50.0%（10/20）和20.0%（4/20）〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）； VEGF與c-myc的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.99, P＜0.01），二者的協(xié)同表達(dá)與膽管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與腫瘤的分級(jí)無關(guān)。 結(jié)論 VEGF可能在膽管癌形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中與c-myc基因有協(xié)同作用，且與膽管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
目的采用可溶性支架將原癌基因c—myc反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染靜脈移植物，觀察其對(duì)靜脈移植物內(nèi)c—myc蛋白和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）蛋白產(chǎn)物表達(dá)的影響。方法50只新西蘭大耳白兔建立兔頸外靜脈頸總動(dòng)脈旁路移植模型后隨機(jī)分成5組，每組10只。對(duì)照組：無支架；組1：植入單純可溶性支架；組2：植入正義c—myc寡核苷酸可溶性支架；組3：植入反義c—myc寡核苷酸可溶性支架；組4：植入不匹配c—myc寡核苷酸可溶性支架。于靜脈移植后7d、28d和90d取出靜脈移植物，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)其c—myc蛋白和PCNA蛋白的表達(dá)。結(jié)果對(duì)照組、組1、組2、組4靜脈移植術(shù)后7d、28d、90d時(shí)靜脈移植物內(nèi)膜和中膜內(nèi)可見大量c—myc蛋白和PCNA蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞，與同時(shí)間點(diǎn)組3比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0．01）。28d、90d時(shí)5組靜脈移植物內(nèi)c—myc蛋白的表達(dá)與同組7d時(shí)比較明顯增強(qiáng)（P〈0．01）。結(jié)論可溶性支架轉(zhuǎn)染c—myc反義寡核苷酸可顯著抑制靜脈移植物內(nèi)c—myc蛋白和PCNA蛋白的表達(dá)。