引用本文： 王洋, 姚殿波, 吴硕东. 姜黄素能够抑制脂多糖诱导的内源性 β-葡萄糖醛酸酶的表达上调. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(8): 917-922. doi: 10.7507/1007-9424.201903082 复制
胆管色素结石在中国非常常见[1]，因其病变复杂和复发率高，成为较难治愈的一种良性胆道疾病[2]。研究结石形成的机制，探索预防或干预结石形成的有效方法具有重要的临床意义[3]。胆管色素结石以胆红素钙为主要成分，细菌感染是促进其形成的重要因素[4]。胆道细菌感染后，胆汁中除了外源性 β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase，β-GD）的活性增高以外，内源性 β-GD 的活性也明显增高，而且有研究[5]提示，内源性 β-GD 在胆色素结石形成中的作用时间可能相对更长。笔者团队[6]之前的研究发现，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可刺激肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 表达的上调，具有明显的浓度依赖性，此外，c-myc 在 LPS 诱导的内源性 β-GD 的表达上调中起着重要作用。进一步探索干预 c-myc 和内源性 β-GD 表达的有效措施，将可能有助于我们今后寻找干预胆管色素结石形成或复发的有效方法。姜黄素通过抗炎、抗氧化、减慢钙的沉积速率和矿化结节的形成、抑制破骨细胞样细胞形成等作用，可以抑制肾结石形成过程中的相应环节，具有预防草酸钙肾结石的潜质[7]。此外，多种肿瘤细胞增殖或凋亡相关研究[8-9]表明，姜黄素可抑制 c-myc 的转录或表达，并且具有浓度依赖性。结合笔者团队之前的研究发现，笔者推测，姜黄素亦可能抑制胆管色素结石的形成，而且可能与抑制由 LPS 刺激的肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 表达的上调有关。因此，本研究旨在探讨姜黄素对 LPS 刺激的肝内胆管上皮细胞中内源性β-GD 表达的影响，为控制胆管色素结石形成和预防结石复发提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验细胞、主要材料、试剂和设备
1.1.1 实验细胞
人肝内胆管上皮细胞系（HIBEpiC）及上皮细胞专用培养基购自美国 Sciencell 公司。人肝内胆管上皮细胞系 HIBEpiC 细胞常规培养于加入 10% 胎牛血清的上皮细胞专用培养基中，置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中恒温培养，48～72 h 进行传代。实验细胞均为活力良好的对数生长期细胞。
1.1.2 主要试剂、材料和设备
二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG（A0208）、二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG（A0216）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（P0012S）、RIPA 裂解液（P0013B）和极超敏 ECL 化学发光试剂盒（P0018F）均购自上海碧云天生物技术有限公司；DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒（ZLI-9019）购自北京中杉金桥生物技术公司；LPS（14011S）购自美国 Cell signaling 公司；姜黄素（C1386）购自美国 Sigma 公司；胎牛血清（10099133）购自 Gibco 公司；一抗 c-myc（ab32072）和 β-GD（ab166904）均购自美国 AbCam 公司；一抗 β-actin（sc-70319）购自美国 Santa Cruz 公司。CO2 细胞培养箱为美国 Thermo 公司产品。垂直电泳装置、转膜仪、凝胶成像及分析系统为美国 Bio-Rad 公司产品。
1.2 实验分组
1.2.1 LPS 刺激实验
取对数生长期的 HIBEpiC 细胞进行分组：空白对照组（0 h 组）及 7 个不同刺激时点组，调整细胞密度为 1×104个/mL，在 5 个不同刺激时点组的培养基中加入 100 μg/mL 的 LPS 分别刺激 1、3、6、18 及 24 h，另外取 2 份 LPS 刺激 24 h 的培养基，在 LPS 刺激 24 h 后更换为无 LPS 培养基，分别继续培养 18 h 和 24 h。每个刺激时间点设有 5 个复孔。收集所有培养基内细胞，提取蛋白，进行检测。
1.2.2 姜黄素干预实验
取对数生长期的 HIBEpiC 细胞进行分组：空白对照组、LPS 组、LSP+低浓度姜黄素组、LSP+中浓度姜黄素组及 LSP+高浓度姜黄素组，调整细胞密度为 1×104个/mL。除空白对照组细胞不加入任何试剂、LPS 组仅加入 100 μg/mLLPS 外，其余 3 组在培养基中加入 100 μg/mL 的 LPS 的同时，分别给予 20（低浓度）、40（中浓度）和 80（高浓度）μmol/L 姜黄素干预。每个组别设有5 个复孔。细胞培养 24 h 后收集细胞提取蛋白，进行检测。
1.3 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测目的蛋白的表达
采用蛋白免疫印迹法检测目的蛋白的表达：使用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化收集各组 HIBEpiC 细胞。以 RIPA 蛋白裂解液裂解细胞后提取总蛋白，以 BCA 法测定蛋白浓度。将蛋白样品与蛋白加样缓冲液按 4∶1 混合后 100 ℃ 煮沸5 min。取 50 μg 蛋白上样，行 8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，采用全湿法转膜至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，以含 5% 脱脂奶粉的 Tris 缓冲液加 Tween-20（Tris-Buffered Saline with 0.1% Tween-20，TBST）室温封闭 1 h 后，分别加入目的蛋白的一抗：β-GD（1∶1 000）、c-myc（1∶1 000）及 β-actin（1∶3 000），4 ℃ 孵育过夜。次日以 TBST 洗膜后，加入山羊抗兔 IgG 二抗（1∶5 000）或山羊抗小鼠 IgG 二抗（1∶5 000），室温摇床孵育 2 h。再以 TBST 洗膜后，采用 ECL 法显影。采用 ImageJ 软件测定目的条带和相应β-actin 条带的灰度值，然后进行蛋白半定量分析，目的条带灰度值与相应组别的 β-actin 条带灰度值的比值即为目的蛋白的相对表达量。目的蛋白的一抗信息见表1。
表1
目的蛋白的一抗
1.4 统计学方法
采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析。每个样本的结果为 5 次独立实验的均值。各实验组和空白对照组细胞中 c-myc 和 β-GD 蛋白的表达水平比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比较采用 SNK 法。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 LPS 诱导 c-myc 和内源性 β-GD 的表达上调，具有时间依赖性
总体而言，LPS 作用 0～24 h 期间，人正常肝内胆管细胞中内源性 β-GD 和 c-myc 的表达水平随着 LPS 作用时间的延长呈增加趋势，且各时点组的β-GD 和 c-myc 的表达水平与 0 h 组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05），见图1a。LPS 作用时间为 18 h 时，c-myc 的表达水平达到最大值（图1b）；而 LPS 作用时间为 24 h 时，内源性 β-GD 的表达水平达到最大值（图1c）。在 LPS 作用 24 h、更换为无 LPS 的培养基后，在无 LPS 刺激下继续培养 18 h 和 24 h，结果发现：c-myc 的表达水平略有回升，而内源性 β-GD 的表达水平略有下降，但是两者仍明显高于正常肝内胆管细胞中内源性 β-GD 和 c-myc 表达的基础水平（P<0.05），见图1b 和图1c。该检测结果提示，在人肝内胆管细胞中，LPS 可刺激细胞内 c-myc 和内源性 β-GD 的表达水平增加，且具有时间依赖性；在 LPS 停止刺激 24 h 后，肝内胆管细胞中的 c-myc 和内源性 β-GD 仍可保持高表达。
图1
示单纯 LPS 刺激不同时点组及不同浓度姜黄素联合 LPS 作用组细胞中 c-myc 和 β-GD 蛋白的表达水平
a：单纯 LPS 刺激不同时点组细胞中 c-myc 和 β-GD 表达的电泳结果；b：单纯 LPS 刺激不同时点组细胞中 c-myc 的表达水平结果，与0 h 组比较，*
2.2 姜黄素有效抑制 LPS 诱导的 c-myc 和内源性 β-GD 的表达上调，具有浓度依赖性
在 LPS（100 μg/mL）刺激人正常肝内胆管细胞的同时，给予不同浓度（20、40 和 80 μmol/L）姜黄素干预后，结果发现，空白对照组、LPS 组、LPS+低浓度姜黄素组、LPS+中浓度姜黄素组及 LPS+高浓度姜黄素组间两两比较，c-myc 和 β-GD 的表达水平的差异均具有统计学意义（P<0.05）。3 种浓度姜黄素干预下，可使得 LPS 刺激下肝内胆管细胞中c-myc 的表达水平低于肝内胆管细胞（无 LPS 刺激）的正常表达水平；而且，当姜黄素浓度达到40 μmol/L 及以上时，β-GD 的表达水平也低于肝内胆管细胞（无 LPS 刺激）的正常表达水平（图1d–1f）。该结果提示，姜黄素可有效抑制 LPS 诱导的 c-myc 和 β-GD 的表达上调，具有浓度依赖性，姜黄素干预可能会成为抑制肝内胆管结石形成或复发的有效措施。
3 讨论
肝内胆管结石在西方国家少见，发病率为 0.6%～1.3%，但其在中国却非常常见，发病率达到 38.0%，是威胁我国人民群众健康的常见疾病[1]。胆管切开取石或胆道镜下取石、肝切除等治疗方法仅能最大限度清除结石，却不能有效预防结石复发。结石复发患者不得不再次接受手术或内镜取石治疗，其治疗风险及难度均增加，同时也增加了患者的痛苦[2]。因此，研究结石形成的机制，探索预防结石形成或复发的有效方法具有重要的临床意义[3]。
肝内胆管结石绝大多数为胆红素结石，胆色素钙是其主要成分。β-GD 是一种重要的生物活性蛋白酶，在胆色素钙形成过程中起着重要作用。β-GD 可通过水解结合型胆红素而生成游离型的胆红素，促进后者与钙质结合形成胆色素钙[10]。β-GD 有内源性和外源性之分，外源性 β-GD 即是细菌感染繁殖产生的 β-GD，而内源性 β-GD 是机体自身组织细胞产生、合成并分泌的。著名的 Maki 学说认为，细菌感染繁殖产生的外源性 β-GD 是胆红素钙形成的主要机制[11]。细菌感染促进胆色素结石形成，而随着胆汁的排空，感染程度下降，外源性 β-GD 的活性逐渐下降，而内源性 β-GD 的活性却可较长时间地保持在较高水平，这暗示内源性 β-GD 在胆色素结石形成中作用时间可能相对更长[5]。因此，对内源性 β-GD 活性的调节机制的研究将有助于我们探索干预肝内胆管结石形成或复发的有效措施[12-13]。
笔者团队之前对内源性 β-GD 相关的调节机制进行了初步探索。最初，利用胆色素结石模型探索胆石成因，结果发现，胆色素结石形成过程中，血 LPS 水平和胆汁中内源性 β-GD 的活性显著增高，提示两者可能与胆色素结石形成密切相关[14]。另外，笔者团队利用体内实验[15-16]还证明，LPS 可诱导肝脏内源性 β-GD 转录水平的升高。近期，笔者团队[6]通过体外细胞实验证明，LPS 可刺激肝细胞或肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 表达水平增加，并且具有明显的浓度依赖性。另外，通过检测还发现，肝细胞或肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 的分泌也相应增加[17]。这些结果提示了，LPS 刺激后内源性 β-GD 表达上调，相应地肝细胞或肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 分泌亦增加，这可能是胆色素结石患者胆汁中内源性 β-GD 活性增加的一个重要原因。笔者团队的研究[6]还发现，LPS 可诱导 c-myc 蛋白的表达上调，而利用 c-myc siRNA 有效抑制 c-myc 的表达后，可抑制 LPS 诱导的内源性 β-GD 的表达上调，提示 LPS 可通过 c-myc 刺激内源性 β-GD 表达水平的增加，进而促进肝内胆管结石的形成。本次实验中，笔者团队通过进一步检测发现，LPS 刺激肝内胆管细胞内 c-myc 和内源性 β-GD 的表达上调具有时间依赖性，而且在 LPS 停止刺激后，肝内胆管细胞中 c-myc 和内源性 β-GD 仍可保持一段时间的高表达。由此，本实验结果提示，LPS 刺激后的 c-myc 和内源性 β-GD 表达上调，在胆色素结石形成中可能作用时间较长[5]。因此，探索干预 LPS 诱导的肝内胆管细胞 c-myc 和内源性 β-GD 表达上调的有效措施具有重要意义。
姜黄素是在姜科植物姜黄等根茎中提取得到的黄色色素，在传统医学中有悠久的应用历史。姜黄素具有保肝、抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤等多方面的作用[18-20]。研究[9, 21-22]提示，姜黄素对多种肿瘤细胞增殖或凋亡的影响与其抑制 c-myc 的转录或表达有关，并且具有浓度依赖性。而笔者团队之前的研究[6]发现，LPS 可通过上调 c-myc 的表达而刺激肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 的表达上调，亦具有明显的浓度依赖性。因此可推测，姜黄素对于 LPS 刺激的肝内胆管上皮细胞中 c-myc 的表达上调也可能有抑制作用，可能进而抑制内源性 β-GD 的表达。本实验结果表明，姜黄素有效抑制了 LPS 诱导的 c-myc 和内源性 β-GD 的表达上调，具有浓度依赖性，结合之前的实验结果，笔者认为，姜黄素可抑制 LPS 诱导的内源性 β-GD 的表达上调，而且推测这可能与抑制 c-myc 的表达有关。当然，本次实验尚不能充分证明笔者的推测，在后续实验中笔者团队拟应用 c-myc 质粒转染等方法，促使姜黄素干预下 c-myc 的表达上调，进而检测内源性 β-GD 表达水平的变化，可进一步充分证明 c-myc 在姜黄素抑制 LPS 诱导的胆管细胞内源性 β-GD 表达中的作用。
对于 c-myc 的表达调节机制，目前有研究[23]提示，c-myc 为 miR-34 家族的作用靶蛋白，miR-34 能够直接作用于 c-myc 的 3´非编码区，从而抑制c-myc 的表达。LPS/Toll 样受体 4（Toll-like receptors 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear transcription factor kappa B，NF-κB）为经典的炎症通路，在炎症性疾病中，NF-κB 亦通过上调 miR-34a 的表达水平参与疾病的发生[24]。姜黄素可上调 miR-34a 的表达[25]，可推测，姜黄素可能是通过上调 miR-34a 而直接抑制 c-myc 的表达，进而抑制肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 的表达。对于其上游的 TLR4、NF-κB 等信号调节因子，姜黄素是否亦发挥相应的抑制作用还有待于进一步验证[26]。此外，本实验还发现，姜黄素在浓度达 20 μmol/L 时已有效抑制了 LPS 诱导的肝内胆管上皮细胞中 c-myc 的表达，使其显著低于细胞的正常表达水平，但内源性 β-GD 的表达抑制却较缓慢，在姜黄素浓度达 40 μmol/L 时内源性β-GD 的表达水平才低于细胞正常表达水平，提示除了 c-myc，可能还存在其他调节因子或蛋白等参与 LPS 诱导的胆管细胞中内源性 β-GD 表达的调节，等待我们去进一步探索。在姜黄素干预下，可使得 LPS 刺激后肝内胆管细胞中内源性 β-GD 和c-myc 的表达水平低于肝内胆管细胞（无 LPS 刺激）的正常表达水平，可以推测，姜黄素干预可能会成为抑制肝内胆管结石形成或复发的有效措施。另外，合成的姜黄素类似物亦可抑制 β-GD 的活性，而且一些姜黄素类似物的抑制作用甚至更强[27]，可能发展成为干扰胆管色素结石形成的有效试剂。对于给药途径，最近实验[28-29]证明，胆道局部灌注给药可更有效抑制胆道炎症以及下调内源性β-GD 的活性，这可能发展成为今后控制胆管色素结石复发的主要干预途径。
总之，本实验结果表明，LPS 可刺激肝内胆管上皮细胞中 c-myc 和内源性 β-GD 表达的上调，具有时间依赖性，并可保持其较长时间的高表达状态；姜黄素可有效抑制 c-myc 和内源性 β-GD 的表达上调，具有浓度依赖性。姜黄素具有抑制 LPS 诱导的内源性 β-GD 表达上调的能力，可能因此具有抑制肝内胆管胆色素结石形成的能力。本实验结果为防止肝胆管色素结石形成或复发的相关研究提供了一个新的可能思路。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：王洋、姚殿波和吴硕东共同完成本实验的科研选题以及研究方案设计；王洋参与完成实验并撰写草稿；姚殿波和吴硕东参与文章审核及投稿。
志谢：沈阳迪安医学检验所有限公司病理科王翠芳在文章修稿过程中对于讨论部分书写修改给予了特别帮助，特此感谢。
胆管色素结石在中国非常常见[1]，因其病变复杂和复发率高，成为较难治愈的一种良性胆道疾病[2]。研究结石形成的机制，探索预防或干预结石形成的有效方法具有重要的临床意义[3]。胆管色素结石以胆红素钙为主要成分，细菌感染是促进其形成的重要因素[4]。胆道细菌感染后，胆汁中除了外源性 β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase，β-GD）的活性增高以外，内源性 β-GD 的活性也明显增高，而且有研究[5]提示，内源性 β-GD 在胆色素结石形成中的作用时间可能相对更长。笔者团队[6]之前的研究发现，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可刺激肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 表达的上调，具有明显的浓度依赖性，此外，c-myc 在 LPS 诱导的内源性 β-GD 的表达上调中起着重要作用。进一步探索干预 c-myc 和内源性 β-GD 表达的有效措施，将可能有助于我们今后寻找干预胆管色素结石形成或复发的有效方法。姜黄素通过抗炎、抗氧化、减慢钙的沉积速率和矿化结节的形成、抑制破骨细胞样细胞形成等作用，可以抑制肾结石形成过程中的相应环节，具有预防草酸钙肾结石的潜质[7]。此外，多种肿瘤细胞增殖或凋亡相关研究[8-9]表明，姜黄素可抑制 c-myc 的转录或表达，并且具有浓度依赖性。结合笔者团队之前的研究发现，笔者推测，姜黄素亦可能抑制胆管色素结石的形成，而且可能与抑制由 LPS 刺激的肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 表达的上调有关。因此，本研究旨在探讨姜黄素对 LPS 刺激的肝内胆管上皮细胞中内源性β-GD 表达的影响，为控制胆管色素结石形成和预防结石复发提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验细胞、主要材料、试剂和设备
1.1.1 实验细胞
人肝内胆管上皮细胞系（HIBEpiC）及上皮细胞专用培养基购自美国 Sciencell 公司。人肝内胆管上皮细胞系 HIBEpiC 细胞常规培养于加入 10% 胎牛血清的上皮细胞专用培养基中，置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中恒温培养，48～72 h 进行传代。实验细胞均为活力良好的对数生长期细胞。
1.1.2 主要试剂、材料和设备
二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG（A0208）、二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG（A0216）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（P0012S）、RIPA 裂解液（P0013B）和极超敏 ECL 化学发光试剂盒（P0018F）均购自上海碧云天生物技术有限公司；DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒（ZLI-9019）购自北京中杉金桥生物技术公司；LPS（14011S）购自美国 Cell signaling 公司；姜黄素（C1386）购自美国 Sigma 公司；胎牛血清（10099133）购自 Gibco 公司；一抗 c-myc（ab32072）和 β-GD（ab166904）均购自美国 AbCam 公司；一抗 β-actin（sc-70319）购自美国 Santa Cruz 公司。CO2 细胞培养箱为美国 Thermo 公司产品。垂直电泳装置、转膜仪、凝胶成像及分析系统为美国 Bio-Rad 公司产品。
1.2 实验分组
1.2.1 LPS 刺激实验
取对数生长期的 HIBEpiC 细胞进行分组：空白对照组（0 h 组）及 7 个不同刺激时点组，调整细胞密度为 1×104个/mL，在 5 个不同刺激时点组的培养基中加入 100 μg/mL 的 LPS 分别刺激 1、3、6、18 及 24 h，另外取 2 份 LPS 刺激 24 h 的培养基，在 LPS 刺激 24 h 后更换为无 LPS 培养基，分别继续培养 18 h 和 24 h。每个刺激时间点设有 5 个复孔。收集所有培养基内细胞，提取蛋白，进行检测。
1.2.2 姜黄素干预实验
取对数生长期的 HIBEpiC 细胞进行分组：空白对照组、LPS 组、LSP+低浓度姜黄素组、LSP+中浓度姜黄素组及 LSP+高浓度姜黄素组，调整细胞密度为 1×104个/mL。除空白对照组细胞不加入任何试剂、LPS 组仅加入 100 μg/mLLPS 外，其余 3 组在培养基中加入 100 μg/mL 的 LPS 的同时，分别给予 20（低浓度）、40（中浓度）和 80（高浓度）μmol/L 姜黄素干预。每个组别设有5 个复孔。细胞培养 24 h 后收集细胞提取蛋白，进行检测。
1.3 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测目的蛋白的表达
采用蛋白免疫印迹法检测目的蛋白的表达：使用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化收集各组 HIBEpiC 细胞。以 RIPA 蛋白裂解液裂解细胞后提取总蛋白，以 BCA 法测定蛋白浓度。将蛋白样品与蛋白加样缓冲液按 4∶1 混合后 100 ℃ 煮沸5 min。取 50 μg 蛋白上样，行 8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，采用全湿法转膜至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，以含 5% 脱脂奶粉的 Tris 缓冲液加 Tween-20（Tris-Buffered Saline with 0.1% Tween-20，TBST）室温封闭 1 h 后，分别加入目的蛋白的一抗：β-GD（1∶1 000）、c-myc（1∶1 000）及 β-actin（1∶3 000），4 ℃ 孵育过夜。次日以 TBST 洗膜后，加入山羊抗兔 IgG 二抗（1∶5 000）或山羊抗小鼠 IgG 二抗（1∶5 000），室温摇床孵育 2 h。再以 TBST 洗膜后，采用 ECL 法显影。采用 ImageJ 软件测定目的条带和相应β-actin 条带的灰度值，然后进行蛋白半定量分析，目的条带灰度值与相应组别的 β-actin 条带灰度值的比值即为目的蛋白的相对表达量。目的蛋白的一抗信息见表1。
表1
目的蛋白的一抗
1.4 统计学方法
采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析。每个样本的结果为 5 次独立实验的均值。各实验组和空白对照组细胞中 c-myc 和 β-GD 蛋白的表达水平比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比较采用 SNK 法。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 LPS 诱导 c-myc 和内源性 β-GD 的表达上调，具有时间依赖性
总体而言，LPS 作用 0～24 h 期间，人正常肝内胆管细胞中内源性 β-GD 和 c-myc 的表达水平随着 LPS 作用时间的延长呈增加趋势，且各时点组的β-GD 和 c-myc 的表达水平与 0 h 组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05），见图1a。LPS 作用时间为 18 h 时，c-myc 的表达水平达到最大值（图1b）；而 LPS 作用时间为 24 h 时，内源性 β-GD 的表达水平达到最大值（图1c）。在 LPS 作用 24 h、更换为无 LPS 的培养基后，在无 LPS 刺激下继续培养 18 h 和 24 h，结果发现：c-myc 的表达水平略有回升，而内源性 β-GD 的表达水平略有下降，但是两者仍明显高于正常肝内胆管细胞中内源性 β-GD 和 c-myc 表达的基础水平（P<0.05），见图1b 和图1c。该检测结果提示，在人肝内胆管细胞中，LPS 可刺激细胞内 c-myc 和内源性 β-GD 的表达水平增加，且具有时间依赖性；在 LPS 停止刺激 24 h 后，肝内胆管细胞中的 c-myc 和内源性 β-GD 仍可保持高表达。
图1
示单纯 LPS 刺激不同时点组及不同浓度姜黄素联合 LPS 作用组细胞中 c-myc 和 β-GD 蛋白的表达水平
a：单纯 LPS 刺激不同时点组细胞中 c-myc 和 β-GD 表达的电泳结果；b：单纯 LPS 刺激不同时点组细胞中 c-myc 的表达水平结果，与0 h 组比较，*
2.2 姜黄素有效抑制 LPS 诱导的 c-myc 和内源性 β-GD 的表达上调，具有浓度依赖性
在 LPS（100 μg/mL）刺激人正常肝内胆管细胞的同时，给予不同浓度（20、40 和 80 μmol/L）姜黄素干预后，结果发现，空白对照组、LPS 组、LPS+低浓度姜黄素组、LPS+中浓度姜黄素组及 LPS+高浓度姜黄素组间两两比较，c-myc 和 β-GD 的表达水平的差异均具有统计学意义（P<0.05）。3 种浓度姜黄素干预下，可使得 LPS 刺激下肝内胆管细胞中c-myc 的表达水平低于肝内胆管细胞（无 LPS 刺激）的正常表达水平；而且，当姜黄素浓度达到40 μmol/L 及以上时，β-GD 的表达水平也低于肝内胆管细胞（无 LPS 刺激）的正常表达水平（图1d–1f）。该结果提示，姜黄素可有效抑制 LPS 诱导的 c-myc 和 β-GD 的表达上调，具有浓度依赖性，姜黄素干预可能会成为抑制肝内胆管结石形成或复发的有效措施。
3 讨论
肝内胆管结石在西方国家少见，发病率为 0.6%～1.3%，但其在中国却非常常见，发病率达到 38.0%，是威胁我国人民群众健康的常见疾病[1]。胆管切开取石或胆道镜下取石、肝切除等治疗方法仅能最大限度清除结石，却不能有效预防结石复发。结石复发患者不得不再次接受手术或内镜取石治疗，其治疗风险及难度均增加，同时也增加了患者的痛苦[2]。因此，研究结石形成的机制，探索预防结石形成或复发的有效方法具有重要的临床意义[3]。
肝内胆管结石绝大多数为胆红素结石，胆色素钙是其主要成分。β-GD 是一种重要的生物活性蛋白酶，在胆色素钙形成过程中起着重要作用。β-GD 可通过水解结合型胆红素而生成游离型的胆红素，促进后者与钙质结合形成胆色素钙[10]。β-GD 有内源性和外源性之分，外源性 β-GD 即是细菌感染繁殖产生的 β-GD，而内源性 β-GD 是机体自身组织细胞产生、合成并分泌的。著名的 Maki 学说认为，细菌感染繁殖产生的外源性 β-GD 是胆红素钙形成的主要机制[11]。细菌感染促进胆色素结石形成，而随着胆汁的排空，感染程度下降，外源性 β-GD 的活性逐渐下降，而内源性 β-GD 的活性却可较长时间地保持在较高水平，这暗示内源性 β-GD 在胆色素结石形成中作用时间可能相对更长[5]。因此，对内源性 β-GD 活性的调节机制的研究将有助于我们探索干预肝内胆管结石形成或复发的有效措施[12-13]。
笔者团队之前对内源性 β-GD 相关的调节机制进行了初步探索。最初，利用胆色素结石模型探索胆石成因，结果发现，胆色素结石形成过程中，血 LPS 水平和胆汁中内源性 β-GD 的活性显著增高，提示两者可能与胆色素结石形成密切相关[14]。另外，笔者团队利用体内实验[15-16]还证明，LPS 可诱导肝脏内源性 β-GD 转录水平的升高。近期，笔者团队[6]通过体外细胞实验证明，LPS 可刺激肝细胞或肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 表达水平增加，并且具有明显的浓度依赖性。另外，通过检测还发现，肝细胞或肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 的分泌也相应增加[17]。这些结果提示了，LPS 刺激后内源性 β-GD 表达上调，相应地肝细胞或肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 分泌亦增加，这可能是胆色素结石患者胆汁中内源性 β-GD 活性增加的一个重要原因。笔者团队的研究[6]还发现，LPS 可诱导 c-myc 蛋白的表达上调，而利用 c-myc siRNA 有效抑制 c-myc 的表达后，可抑制 LPS 诱导的内源性 β-GD 的表达上调，提示 LPS 可通过 c-myc 刺激内源性 β-GD 表达水平的增加，进而促进肝内胆管结石的形成。本次实验中，笔者团队通过进一步检测发现，LPS 刺激肝内胆管细胞内 c-myc 和内源性 β-GD 的表达上调具有时间依赖性，而且在 LPS 停止刺激后，肝内胆管细胞中 c-myc 和内源性 β-GD 仍可保持一段时间的高表达。由此，本实验结果提示，LPS 刺激后的 c-myc 和内源性 β-GD 表达上调，在胆色素结石形成中可能作用时间较长[5]。因此，探索干预 LPS 诱导的肝内胆管细胞 c-myc 和内源性 β-GD 表达上调的有效措施具有重要意义。
姜黄素是在姜科植物姜黄等根茎中提取得到的黄色色素，在传统医学中有悠久的应用历史。姜黄素具有保肝、抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤等多方面的作用[18-20]。研究[9, 21-22]提示，姜黄素对多种肿瘤细胞增殖或凋亡的影响与其抑制 c-myc 的转录或表达有关，并且具有浓度依赖性。而笔者团队之前的研究[6]发现，LPS 可通过上调 c-myc 的表达而刺激肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 的表达上调，亦具有明显的浓度依赖性。因此可推测，姜黄素对于 LPS 刺激的肝内胆管上皮细胞中 c-myc 的表达上调也可能有抑制作用，可能进而抑制内源性 β-GD 的表达。本实验结果表明，姜黄素有效抑制了 LPS 诱导的 c-myc 和内源性 β-GD 的表达上调，具有浓度依赖性，结合之前的实验结果，笔者认为，姜黄素可抑制 LPS 诱导的内源性 β-GD 的表达上调，而且推测这可能与抑制 c-myc 的表达有关。当然，本次实验尚不能充分证明笔者的推测，在后续实验中笔者团队拟应用 c-myc 质粒转染等方法，促使姜黄素干预下 c-myc 的表达上调，进而检测内源性 β-GD 表达水平的变化，可进一步充分证明 c-myc 在姜黄素抑制 LPS 诱导的胆管细胞内源性 β-GD 表达中的作用。
对于 c-myc 的表达调节机制，目前有研究[23]提示，c-myc 为 miR-34 家族的作用靶蛋白，miR-34 能够直接作用于 c-myc 的 3´非编码区，从而抑制c-myc 的表达。LPS/Toll 样受体 4（Toll-like receptors 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear transcription factor kappa B，NF-κB）为经典的炎症通路，在炎症性疾病中，NF-κB 亦通过上调 miR-34a 的表达水平参与疾病的发生[24]。姜黄素可上调 miR-34a 的表达[25]，可推测，姜黄素可能是通过上调 miR-34a 而直接抑制 c-myc 的表达，进而抑制肝内胆管上皮细胞中内源性 β-GD 的表达。对于其上游的 TLR4、NF-κB 等信号调节因子，姜黄素是否亦发挥相应的抑制作用还有待于进一步验证[26]。此外，本实验还发现，姜黄素在浓度达 20 μmol/L 时已有效抑制了 LPS 诱导的肝内胆管上皮细胞中 c-myc 的表达，使其显著低于细胞的正常表达水平，但内源性 β-GD 的表达抑制却较缓慢，在姜黄素浓度达 40 μmol/L 时内源性β-GD 的表达水平才低于细胞正常表达水平，提示除了 c-myc，可能还存在其他调节因子或蛋白等参与 LPS 诱导的胆管细胞中内源性 β-GD 表达的调节，等待我们去进一步探索。在姜黄素干预下，可使得 LPS 刺激后肝内胆管细胞中内源性 β-GD 和c-myc 的表达水平低于肝内胆管细胞（无 LPS 刺激）的正常表达水平，可以推测，姜黄素干预可能会成为抑制肝内胆管结石形成或复发的有效措施。另外，合成的姜黄素类似物亦可抑制 β-GD 的活性，而且一些姜黄素类似物的抑制作用甚至更强[27]，可能发展成为干扰胆管色素结石形成的有效试剂。对于给药途径，最近实验[28-29]证明，胆道局部灌注给药可更有效抑制胆道炎症以及下调内源性β-GD 的活性，这可能发展成为今后控制胆管色素结石复发的主要干预途径。
总之，本实验结果表明，LPS 可刺激肝内胆管上皮细胞中 c-myc 和内源性 β-GD 表达的上调，具有时间依赖性，并可保持其较长时间的高表达状态；姜黄素可有效抑制 c-myc 和内源性 β-GD 的表达上调，具有浓度依赖性。姜黄素具有抑制 LPS 诱导的内源性 β-GD 表达上调的能力，可能因此具有抑制肝内胆管胆色素结石形成的能力。本实验结果为防止肝胆管色素结石形成或复发的相关研究提供了一个新的可能思路。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：王洋、姚殿波和吴硕东共同完成本实验的科研选题以及研究方案设计；王洋参与完成实验并撰写草稿；姚殿波和吴硕东参与文章审核及投稿。
志谢：沈阳迪安医学检验所有限公司病理科王翠芳在文章修稿过程中对于讨论部分书写修改给予了特别帮助，特此感谢。
