目的 設計、構建并篩選出轉染至人骨肉瘤細胞系OS-9901，對c-myc 沉默效果最佳的復制缺陷型重組腺病毒質粒pAd-c-myc- 短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）包裝出表達c-myc-shRNA 的重組腺病毒，并測定其滴度。 方法 設計有shRNA 結構的3 對單鏈寡核苷酸（ss oligos），經變性退火為雙鏈寡核苷酸（ds oligos），插入穿梭質粒pENTR/U6 載體，測序正確后，經LipofectamineTM2000 陽離子脂質體介導入人骨肉瘤細胞系OS-9901，采用RTPCR篩選對c-myc 沉默效果最佳的穿梭質粒pENTR/U6-shRNA，然后與腺病毒骨架質粒行同源重組，篩選出正確重組子。采用293A 細胞包裝出表達c-myc-shRNA 的復制缺陷型重組腺病毒，觀察其細胞病變效應（cytopathic effect，CPE），采用病毒顆粒法（viral particles，VP）和50% 組織培養(yǎng)感染劑量法（50% tissue culture infective dose，TCID50）測定病毒滴度。 結 果 電泳驗證后的ds oligos 插入穿梭質粒pENTR/U6 載體，測序結果提示構建的pENTR/U6-shRNA 質粒正確。從3 對ds oligos 通過RT-PCR 方法篩選出對c-myc 沉默效果最佳的穿梭質粒pENTR/U6-shRNA，經Pac Ⅰ酶切線性化后同源重組成功構建了介導c-myc-shRNA 復制缺陷型重組腺病毒，CPE 和空泡現象 3 d 開始出現，6 d 更加明顯。采用VP法測定的第1 代腺病毒滴度為5.23 × 109 VP/mL，經3 ～ 4 代擴增后可達2.26 × 1012 VP/mL。TCID50 證實病毒滴度為10-3.8/0.1 mL。 結論 通過RNA 干擾技術，體外成功構建了介導shRNA-c-myc 復制缺陷型重組腺病毒。
引用本文： 王棟琪,劉淼,王民,張銀剛. 沉默c-myc 重組腺病毒載體的構建. 中國修復重建外科雜志, 2008, 22(8): 969-973. doi: 復制