目的體外評估PKH26標記對山羊髓核細胞生物學功能的影響，并結合活體熒光成像系統(tǒng)評價種子細胞在裸鼠體內的生物學行為。 方法取1歲齡山羊椎間盤分離髓核組織，通過酶消化法獲取原代細胞，倒置相差顯微鏡下觀察，傳代獲取第1代髓核細胞，行PKH26熒光標記，熒光顯微鏡下觀察標記后的細胞熒光強度，并行甲苯胺藍和Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色觀察，錐蟲藍染色比較標記前后細胞活性，MTT法檢測標記前后細胞增殖特性，實時熒光定量PCR檢測細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖基因表達。將標記后的髓核細胞接種至一體化纖維化-髓核支架的髓核部分，纖維環(huán)部分作為陰性對照，體外培養(yǎng)3 d后植入5只6周齡雄性裸鼠體內，培養(yǎng)6周后活體成像技術檢測髓核細胞-支架復合物在體內的熒光強度及范圍。結果 倒置相差顯微鏡觀察示原代髓核細胞簇狀生長，呈卵圓形，第1代髓核細胞呈類軟骨樣細胞形態(tài)；標記后的第1代髓核細胞甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色均呈陽性；標記后熒光強度均勻，標記前后細胞活性均在95%以上；標記前后細胞生長曲線比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）；實時熒光定量PCR檢測示標記前后細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原和蛋白聚糖基因相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）?；铙w成像技術顯示體內髓核支架有強烈熒光，纖維環(huán)支架未見熒光。結論 PKH26標記對髓核細胞的活性、增殖及細胞表型的表達無明顯影響，結合體內活體熒光成像系統(tǒng)可以追蹤細胞在體內的生物學行為。
目的 觀察PKH26 與BrdU 體外雙重標記兔BMSCs 的生物學特性，并體外構建組織工程心肌補片。 方法 取6 月齡新西蘭大白兔分離培養(yǎng)BMSCs，并用細胞膜熒光染料PKH26 和細胞核標記物BrdU 對BMSCs 進行標記，通過倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、流式細胞儀、MTT 法觀察細胞生長狀態(tài)和熒光標記前后細胞生物學特性的變化；ALP、茜素紅、油紅O 染色及骨鈣素、Ⅰ型膠原蛋白等免疫細胞化學技術檢測，觀察和評價標記前后BMSCs 體外分化為成骨細胞和成脂細胞的能力。將標記細胞與小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）復合后共培養(yǎng)5 ～ 7 d 構建組織工程心肌補片，在倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡和掃描電鏡下觀察細胞在SIS 上的生長情況，并做活體及石蠟包埋HE 染色觀察。 結果 標記后細胞生長狀態(tài)良好，基本生長特性無明顯改變；熒光顯微鏡下可見標記后細胞膜上紅色熒光呈顆粒狀分布；細胞表面干細胞標志性抗原表達與標記前無明顯差異。標記后的BMSCs 成骨誘導后，ALP、茜素紅染色陽性，細胞表達骨鈣素及Ⅰ型膠原蛋白；成脂誘導后，細胞胞漿內出現(xiàn)明顯的脂滴。標記細胞與SIS 共培養(yǎng)5 ～ 7 d 后，標記細胞生長狀態(tài)良好，在材料上呈現(xiàn)出多層細胞結構。活體及石蠟包埋后HE 染色可見細胞生長狀態(tài)良好。 結論 兔BMSCs 能被PKH26 和BrdU 穩(wěn)定標記；標記的細胞在體外具有自我更新和多向分化的能力；標記的BMSCs 與SIS 體外復合培養(yǎng)可以構建組織工程心肌補片。
目的 探討熒光染料PKH26 在構建組織工程骨中作為細胞示蹤劑的可行性。 方法 取1 周齡新西蘭大白兔骨髓分離培養(yǎng)BMSCs，以PKH26 標記第3 代BMSCs，熒光顯微鏡觀察并采用流式細胞儀檢測標記率；以成骨誘導培養(yǎng)基誘導標記后BMSCs 向成骨細胞分化，倒置相差顯微鏡觀察誘導后7、14 d 細胞形態(tài)變化，并于14 d 采用鈣鈷法檢測ALP 活性，茜素紅礦化結節(jié)染色觀察誘導結果。將PKH26 標記的BMSCs 接種于生物衍生骨材料，48 h 后熒光顯微鏡觀察細胞與材料的復合情況；將細胞- 材料復合物植入成年新西蘭大白兔雙后肢肌袋，14、28 d 后熒光顯微鏡觀察標記細胞的轉歸。 結果 熒光顯微鏡觀察PKH26 標記的BM SCs 呈球形，呈現(xiàn)均勻分布的紅色熒光；培養(yǎng)24 h 后細胞貼壁伸展，輪廓清晰可見。流式細胞儀檢測細胞染色陽性率達97.2%。經成骨誘導后，細胞由長梭形變?yōu)槎噙呅位蛄⒎叫?，ECM 分泌增多，ALP 及茜素紅染色均呈陽性反應。PKH26 標記細胞與生物衍生骨材料復合培養(yǎng)48 h 后，熒光顯微鏡觀察可見材料表面及內部發(fā)出紅色熒光。標記細胞- 支架材料復合物植入肌袋后14 d，在植入區(qū)可見發(fā)出紅色明亮熒光的標記細胞； 術后28 d，在植入區(qū)仍可見發(fā)出紅色熒光的細胞，但數(shù)量較14 d 時少，熒光強度也較弱。 結論 PKH26 標記BMSCs 可作為一種體外構建組織工程骨及短期體內示蹤的有效手段。