華西醫(yī)學(xué)期刊出版社
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找到 關(guān)鍵詞 包含"IGF-1" 10條結(jié)果
  • IGF-1 促原代人胚骨骼肌成肌細(xì)胞體外增殖與分化的研究

    【摘 要】 目的 為更好地將成肌細(xì)胞應(yīng)用于組織工程構(gòu)建,探討IGF-1 對(duì)原代人胚骨骼肌成肌細(xì)胞體外增殖與分化的作用與機(jī)制。 方法 通過核素3H-TdR 摻入法測(cè)定不同濃度IGF-1(1、2、4、8、16 和32 ng/mL)作用下成肌細(xì)胞的每分鐘射線脈沖數(shù)(count per minute,CPM)值,根據(jù)濃度-CPM 值量效曲線確定IGF-1 促增殖的適宜濃度。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入該濃度的IGF-1 用于實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,對(duì)照組細(xì)胞僅接受生長(zhǎng)培養(yǎng)基。分別觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組生長(zhǎng)曲線,比較兩組細(xì)胞增殖周期的變化。運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)及核素?fù)饺敕y(cè)定適宜濃度IGF-1 作用下,成肌細(xì)胞增殖周期的變化。另選取不同濃度IGF-1(0、5、10、15、20、25、30 ng/mL)作用于成肌細(xì)胞,觀察4 d 后成肌細(xì)胞融合率,通過融合率-IGF-1濃度- 量效曲線確定IGF-1 促進(jìn)成肌細(xì)胞融合的最佳濃度,并將其用于實(shí)驗(yàn)組,而未接受該濃度IGF-1 的成肌細(xì)胞作為對(duì)照組,分別測(cè)定兩組細(xì)胞融合率與磷酸肌酸激酶(creatine kinase,CK)含量并進(jìn)行比較。 結(jié)果 5 ng/mL 的IGF-1 為促成肌細(xì)胞增殖最佳濃度。對(duì)照組成肌細(xì)胞倍增時(shí)間為96 h;實(shí)驗(yàn)組成肌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線左移,倍增時(shí)間縮短為60 h。對(duì)照組DNA G1、S 期與G2M 期各亞周期所占時(shí)間分別是70.03、25.01 與0.96 h,實(shí)驗(yàn)組為22.66、16.47 與20.87 h。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組成肌細(xì)胞CPM 峰值出現(xiàn)的時(shí)間分別是48 h 與96 h,與生長(zhǎng)曲線流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定結(jié)果一致。IGF-1 促進(jìn)分化研究顯示20 ng/mL IGF-1 為促成肌細(xì)胞分化最佳濃度。實(shí)驗(yàn)組成肌細(xì)胞融合率較對(duì)照組提高30%,CK 合成量提高2 000 mU/mL。 結(jié)論 IGF-1 對(duì)成肌細(xì)胞的增殖與分化均具有促進(jìn)作用,是通過減少 G1 期成肌細(xì)胞數(shù)量,增加S 期與G2M 期細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。20 ng/mL IGF-1 能明顯增加成肌細(xì)胞融合率CK 合成。

    發(fā)表時(shí)間:2016-09-01 09:09 導(dǎo)出 下載 收藏 掃碼
  • TGF-β1和 IGF-1共同轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究

    【摘 要】 目的 探討應(yīng)用TGF-β1 和IGF-1 基因轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs 后,目的基因分泌情況及向軟骨細(xì)胞的分化效果,為構(gòu)建新型的組織工程軟骨種子細(xì)胞提供思路。 方法 6 周齡健康雄性Wistar 大鼠2 只,體重約150 g。擴(kuò)增、提取質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1,酶切、電泳鑒定并測(cè)序。采用密度梯度離心法和貼壁分離法,分離、純化Wistar 大鼠BMSCs,倒置相差顯微鏡觀察原代和傳代BMSCs 形態(tài)學(xué)改變,免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志。將TGF-β1 和IGF-1 基因單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染第3 代BMSCs,按轉(zhuǎn)染情況分為5 組:未轉(zhuǎn)染組(A 組)、轉(zhuǎn)染空載體組(B 組)、轉(zhuǎn)染TGF-β1 組(C 組)、轉(zhuǎn)染IGF-1 組(D 組)、TGF-β1 與 IGF-1 共轉(zhuǎn)染組(E 組)。對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行篩選,MTT 法測(cè)定篩選后細(xì)胞的增殖活性,RTPCR和Western blot 法檢測(cè)篩選后細(xì)胞的表達(dá)。 結(jié)果 電泳顯示IGF-1 和TGF-β1 兩目的基因條帶,基因測(cè)序與Gene-Bank cDNA序列相符。大鼠BMSCs 原代細(xì)胞接種24 h 后可見少量貼壁突起細(xì)胞,4、5 d 開始形成典型的BMSCs 簇狀增生,9、10 d 細(xì)胞生長(zhǎng)即可達(dá)80% ~ 90% 融合;傳代后細(xì)胞形態(tài)較均一。免疫熒光法檢測(cè)BMSCs 的CD29、CD44 呈陽(yáng)性反應(yīng),CD34、CD45 呈陰性反應(yīng)。轉(zhuǎn)染24 h 后有少量細(xì)胞死亡,篩選3 周后細(xì)胞克隆形成,至第4 周細(xì)胞可傳代,多數(shù)細(xì)胞變成多邊形,部分細(xì)胞邊界不清,呈圓形,核偏位,核周顆粒明顯。MTT 法測(cè)定A、B、C、D、E 組細(xì)胞在490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度(A )值,分別為0.432 ± 0.038、0.428 ± 0.041、0.664 ± 0.086、0.655 ± 0.045 和0.833 ± 0.103。A、B 組與C、D、E 組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.01),但A、B 組以及C、D、E 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。RT-PCR 和Western blot 檢測(cè)目的基因和蛋白的表達(dá)量,TGF-β1 表達(dá)以C 組最多,分別為0.925 0 ± 0.022 0、124.341 7 ± 2.982 0,E 組次之,分別為0.771 7 ±0.012 0、101.766 7 ± 1.241 0(P lt; 0.01);IGF-1 表達(dá)以E 組最多,分別為1.020 0 ± 0.026 0、128.171 7 ± 9.152 0, D 組次之,分別為0.465 0 ± 0.042 0、111.045 0 ± 6.248 0(P lt; 0.01);II 型膠原表達(dá)以E 組最多,分別為0.980 0 ± 0.034 0、120.355 0 ±12.550 0,C 組次之,分別為0.720 0 ± 0.026 0、72.246 7 ± 7.364 0(P lt; 0.01)。 結(jié)論 通過TGF-β1 和IGF-1 基因共同轉(zhuǎn)染BMSCs 修復(fù)軟骨缺損是一個(gè)較有前景的發(fā)展方向,對(duì)組織工程軟骨應(yīng)用于臨床具有重要意義。

    發(fā)表時(shí)間:2016-09-01 09:09 導(dǎo)出 下載 收藏 掃碼
  • 體外轉(zhuǎn)染人IGF-1基因重組腺病毒載體對(duì)兔椎間盤髓核細(xì)胞凋亡的影響

    目的探討體外轉(zhuǎn)染人IGF-1(human IGF-1,hIGF-1)基因腺病毒載體(Ad-hIGF-1)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的兔椎間盤髓核細(xì)胞凋亡的影響。 方法取8只健康成年家兔(雌雄不限,體重2.0~2.5 kg)椎間盤髓核,以Ⅱ型膠原酶消化法分離培養(yǎng)髓核細(xì)胞。取第2代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期髓核細(xì)胞,根據(jù)培養(yǎng)條件不同分為3組。空白組:以含10%PBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng);TNF-α組:在空白組培養(yǎng)基中加入100 ng/mL TNF-α;Ad-hIGF-1組:在TNF-α組培養(yǎng)基中加入感染復(fù)數(shù)為50的Ad-hIGF-1。熒光顯微鏡下觀察Ad-hIGF-1組病毒轉(zhuǎn)染情況。各組培養(yǎng)48 h后,行RT-PCR及Western blot檢測(cè)hIGF-1 mRNA和蛋白表達(dá),TUNEL法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果熒光顯微鏡下觀察示,Ad-hIGF-1組細(xì)胞發(fā)出綠色熒光,提示轉(zhuǎn)染成功。RT-PCR及Western blot檢測(cè)示,Ad-hIGF-1組可見hIGF-1 mRNA及蛋白表達(dá)條帶,而空白組和TNF-α組均未見。TUNEL法檢測(cè)示,TNF-α組、Ad-hIGF-1組及空白組細(xì)胞凋亡率分別為34.24% ± 4.60%、6.59% ± 1.03%、0.40% ± 0.15%;流式細(xì)胞儀檢測(cè)示,TNF-α組、Ad-hIGF-1組、空白組早期凋亡率分別為22.16% ± 2.69%、5.03% ± 0.96%、0.49% ± 0.05%,晚期凋亡率分別為13.96% ± 4.86%、10.68% ± 3.42%、0.29% ± 0.06%;以上檢測(cè)指標(biāo)TNF-α組均顯著高于空白組、Ad-hIGF-1組(P lt; 0.05),Ad-hIGF-1組高于空白組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05)。 結(jié)論hIGF-1基因?qū)NF-α體外誘導(dǎo)的兔髓核細(xì)胞凋亡有抑制作用。

    發(fā)表時(shí)間:2016-08-31 04:05 導(dǎo)出 下載 收藏 掃碼
  • 靜水壓聯(lián)合IGF-1干預(yù)對(duì)山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞絲狀肌動(dòng)蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

    目的 探討靜水壓聯(lián)合IGF-1對(duì)體外單層培養(yǎng)的山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞絲狀肌動(dòng)蛋白(filamentous actin,F(xiàn)-actin)的影響,分析靜水壓、IGF-1與F-actin的關(guān)系變化對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為改變的影響。 方法取4只1月齡山羊雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)盤,采用酶消化法分離培養(yǎng)顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞,以Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色鑒定。取第2、3代細(xì)胞根據(jù)干預(yù)方法不同分為4組:A組以完全培養(yǎng)基培養(yǎng),作為對(duì)照;B組以強(qiáng)度0.2 MPa、頻率1 Hz的靜水壓作用3 h;C組以含10 ng/mL IGF-1的完全培養(yǎng)基培養(yǎng);D組采用靜水壓與IGF-1聯(lián)合培養(yǎng),方法同B、C組。于干預(yù)后24、72 h行免疫熒光染色觀察F-actin變化,測(cè)定單個(gè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。 結(jié)果經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及免疫組織化學(xué)染色鑒定,所培養(yǎng)細(xì)胞為顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞。干預(yù)24 h時(shí)A、C組細(xì)胞熒光染色強(qiáng),保持了細(xì)胞正常形態(tài),且分布清晰;B組F-actin排列紊亂;D組F-actin變細(xì),排列混亂。72 h時(shí)A、C組F-actin排列整齊;B組F-actin排列紊亂、模糊不清,部分F-actin斷裂,形成偽足;D組F-actin變細(xì),排列紊亂、斷裂。隨時(shí)間延長(zhǎng),A、B、D組熒光強(qiáng)度均呈增強(qiáng)趨勢(shì),兩時(shí)間點(diǎn)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05);C組兩時(shí)間點(diǎn)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.284,P=0.781)。干預(yù)24 h,C組熒光強(qiáng)度最高,B組最低,與A、D組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05)。72 h時(shí),B、D組熒光強(qiáng)度顯著低于A、C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05);B、D組間及A、C組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。 結(jié)論靜水壓可以引起山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞F-actin發(fā)生斷裂及重排,IGF-1上調(diào)F-actin的表達(dá);靜水壓聯(lián)合IGF-1誘導(dǎo)產(chǎn)生的F-actin斷裂、重排可能引起細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。

    發(fā)表時(shí)間:2016-08-31 04:07 導(dǎo)出 下載 收藏 掃碼
  • 殼聚糖轉(zhuǎn)染胰島素樣生長(zhǎng)因子基因促進(jìn)兔關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究

    目的 探討殼聚糖(chitosan,CS)介導(dǎo)IGF-1 基因(igf-1)局部轉(zhuǎn)染對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的作用。 方 法 3 月齡健康雄性大耳白家兔12 只,體重2.0 ~ 2.5 kg,隨機(jī)分為對(duì)照組和干預(yù)組(n=6)。其中對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左側(cè)為正常對(duì)照組,右側(cè)為生理鹽水對(duì)照組;干預(yù)組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左側(cè)為CS 干預(yù)組,右側(cè)為CS/igf-1 干預(yù)組。后3 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別制備兔膝關(guān)節(jié)外側(cè)髁軟骨缺損模型,正常對(duì)照組不制備。CS/igf-1 干預(yù)組于術(shù)后當(dāng)日關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射CS/igf-1 復(fù)合物0.5 mL,每周2 次,共4 周;CS 干預(yù)組注射等體積CS 溶液;正常對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組注射等體積生理鹽水。術(shù)后28 d,取關(guān)節(jié)軟骨組織,分別行組織學(xué)觀察和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖基因表達(dá)。 結(jié)果 HE染色及甲苯胺藍(lán)染色示,CS/igf-1 干預(yù)組及CS 干預(yù)組損傷部位均有明顯軟骨性修復(fù),前者明顯優(yōu)于后者,同時(shí)均可見纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn);生理鹽水對(duì)照組僅見大量纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),未見明顯軟骨性修復(fù)。正常對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組、CS 干預(yù)組、CS/igf-1 干預(yù)組Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖基因相對(duì)含量均依次增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05)。 結(jié)論 CS/igf-1 復(fù)合物可增加軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖基因的表達(dá),促進(jìn)損傷軟骨修復(fù)。

    發(fā)表時(shí)間:2016-09-01 09:04 導(dǎo)出 下載 收藏 掃碼
  • 可磷酸化短肽偶聯(lián)殼聚糖介導(dǎo)兔關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的基因治療

    目的探討可磷酸化短肽(phosphorylatable short peptide,pSP)偶聯(lián)殼聚糖(chitosan,CS)(pSP-CS),攜載IGF-1和IL-1受體拮抗劑(IL-1 receptor antagonist,IL-1Ra)基因,局部轉(zhuǎn)染促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的作用。 方法構(gòu)建pBudCE4.1-IL-1Ra、pBudCE4.1-IGF-1及pBudCE4.1-IL-1Ra+IGF-1質(zhì)粒,以pSP偶聯(lián)CS形成pSP-CS,將以上重組質(zhì)粒分別與其復(fù)合形成pSP-CS/質(zhì)粒DNA(pDNA)復(fù)合物。取3月齡健康雄性新西蘭大耳白兔30只,體重2.0~2.5 kg,雙側(cè)后肢隨機(jī)分為5組(n=12)。假手術(shù)組(A組)僅暴露股骨外側(cè)髁關(guān)節(jié)面,pSP-CS/pBudCE4.1干預(yù)組(B組)、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra干預(yù)組(C組)、pSP-CS/pBudCE4.1-IGF-1干預(yù)組(D組)、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra+IGF-1干預(yù)組(E組)制備膝關(guān)節(jié)外側(cè)髁軟骨缺損模型。術(shù)后1周,各干預(yù)組給予對(duì)應(yīng)pSP-CS/pDNA復(fù)合物,共7周;A組注射等量生理鹽水。術(shù)后觀察動(dòng)物一般情況,8周時(shí)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,取關(guān)節(jié)腔灌洗液ELISA分析IL-1Ra及IGF-1含量;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)缺損區(qū)軟骨組織聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP-3)、MMP抑制劑1(MMP inhibitor 1,TIMP-1)mRNA表達(dá);阿爾辛藍(lán)-過碘酸雪夫(alcian blue-periodic acid/schiff,ABPAS)染色及Aggrecan免疫組織化學(xué)染色鑒定損傷區(qū)新生細(xì)胞的軟骨細(xì)胞表型,分析Aggrecan染色吸光度(A)值。 結(jié)果實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后無感染及死亡。各干預(yù)組關(guān)節(jié)腔灌洗液中檢測(cè)到大量外源蛋白IGF-1和IL-1Ra,其中D、E組IGF-1含量以及C、E組IL-1Ra含量顯著高于A組(P<0.05)。E組Aggrecan和TIMP-1 mRNA表達(dá)上調(diào),MMP-3 mRNA表達(dá)下調(diào),明顯優(yōu)于C、D組(P<0.05)。C、D、E組缺損處出現(xiàn)不同程度軟骨性修復(fù),AB-PAS染色及Aggrecan免疫組織化學(xué)染色均為陽(yáng)性,且E組作用明顯優(yōu)于C、D組(P<0.05);B組缺損處僅被大量纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),未見明顯軟骨性修復(fù)。 結(jié)論pSP-CS是一種較理想的基因載體,可攜載治療基因有效進(jìn)入兔關(guān)節(jié)軟骨組織;IL-1Ra與IGF-1協(xié)同作用明顯促進(jìn)損傷軟骨修復(fù)。

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  • 微骨折技術(shù)聯(lián)合IGF-1修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

    目的探討微骨折技術(shù)聯(lián)合IGF-1治療兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的療效。 方法4~6月齡新西蘭大白兔24只,體重2.5~3.5 kg,雌雄不限,隨機(jī)分為4組(n=6):微骨折技術(shù)聯(lián)合重組人IGF-1(recombinant human IGF-1,rhIGF-1)組(A組)、微骨折技術(shù)對(duì)照組(B組)、rhIGF-1 對(duì)照組(C組)和空白對(duì)照組(D組)。各組于大白兔雙后肢髕股關(guān)節(jié)股骨側(cè)關(guān)節(jié)面中心制備8 mm×6 mm全層關(guān)節(jié)軟骨缺損,A、B組同時(shí)行微骨折術(shù)。術(shù)后A、C組每側(cè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.1 mL rhIGF-1(0.01 μg/μL),每周3次,連續(xù)4周;B、D組對(duì)應(yīng)注射等量生理鹽水。術(shù)后觀察各組動(dòng)物一般情況,于4、12、24 周處死取材,行大體、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察,按照Wakitani 等評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)行組織學(xué)評(píng)分;24 周時(shí)采用改良羥脯氨酸(hydroxyproline,HPR)法測(cè)定各組修復(fù)組織和正常兔后肢髕股關(guān)節(jié)軟骨的膠原含量,同時(shí)A、B組行透射電鏡和掃描電鏡觀察。 結(jié)果各組動(dòng)物均存活至實(shí)驗(yàn)完成。大體觀察示,隨時(shí)間延長(zhǎng),A組缺損區(qū)域逐漸修復(fù),24周時(shí)修復(fù)組織與鄰近正常軟骨無區(qū)別;B組修復(fù)組織較平整,與正常軟骨界線模糊;C、D組修復(fù)組織不平整,與鄰近正常軟骨界線仍清晰。組織學(xué)染色顯示與大體觀察一致,A組24周時(shí)修復(fù)組織與正常軟骨細(xì)胞無明顯區(qū)別;B組見較多的橢圓形類軟骨細(xì)胞,基質(zhì)染色較淺;C、D組見少許小梭形纖維細(xì)胞。術(shù)后4、12、24周參照Wakitani等評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),A組明顯優(yōu)于其余各組(P<0.05)。電鏡觀察示,術(shù)后24周A組修復(fù)組織表面光滑,可見軟骨陷窩,軟骨細(xì)胞位于陷窩內(nèi),含有糖原顆粒,周圍可見膠原纖維,明顯優(yōu)于B組。膠原含量檢測(cè)結(jié)果顯示,A組修復(fù)組織的膠原含量明顯高于其他組(P<0.05),但仍低于正常軟骨組織(P<0.05)。 結(jié)論微骨折技術(shù)聯(lián)合IGF-1治療兔關(guān)節(jié)軟骨缺損,可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨缺損以透明軟骨形式修復(fù)。

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  • 慢病毒介導(dǎo)的多基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染BMSCs注射治療食蟹猴膝關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究

    目的通過慢病毒介導(dǎo)環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2, COX-2)-siRNA、聚蛋白多糖酶1(Aggrecanase-1)-siRNA、IGF-1基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染BMSCs,將其注射至食蟹猴骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)模型關(guān)節(jié)腔,探討對(duì)OA相關(guān)炎性因子及關(guān)節(jié)軟骨的影響。 方法取髖關(guān)節(jié)OA患者自愿捐贈(zèng)骨髓組織,分離培養(yǎng)BMSCs。采用基因重組技術(shù)構(gòu)建COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siRNA和IGF-1過表達(dá)基因的慢病毒載體,以最佳感染復(fù)數(shù)40轉(zhuǎn)染第3代BMSCs(病毒組),以空慢病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)作為對(duì)照(空病毒組),以正常BMSCs作為正常對(duì)照組。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),并行細(xì)胞計(jì)數(shù);取轉(zhuǎn)染培養(yǎng)1周細(xì)胞,RT-PCR檢測(cè)COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA的表達(dá)。取健康3歲食蟹猴9只,按照Hulth造模法于右膝制備OA模型后,隨機(jī)分為3組(n=3)。模型制備術(shù)后6周,病毒組及空病毒組右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別注射對(duì)應(yīng)的1 mL BMSCs(約1×107個(gè)),空白對(duì)照組注射1 mL生理鹽水。以左膝作為正常對(duì)照組。注射后觀察動(dòng)物一般情況;1、4、6周取雙膝關(guān)節(jié)液,ELISA檢測(cè)前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)、IL-1、Aggrecanase-1、IGF-1濃度;6周時(shí)MRI及大體觀察檢查膝關(guān)節(jié)軟骨改變,并取材行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)染色觀察,以及RT-PCR檢測(cè)COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA表達(dá)。 結(jié)果轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)曲線無明顯差異。RT-RCR檢測(cè),與空病毒組、正常對(duì)照組比較,病毒組COX-2、Aggrecanase-1表達(dá)明顯降低,IGF-1表達(dá)明顯增加(P<0.05)。細(xì)胞注射后各組動(dòng)物均存活至實(shí)驗(yàn)完成。注射后1、4、6周,病毒組PGE2、Aggrecanase-1、IL-1濃度明顯低于空病毒組、空白對(duì)照組,但I(xiàn)GF-1濃度明顯增高(P<0.05);但3組以上指標(biāo)濃度均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。MRI檢查示,與正常對(duì)照組比較,病毒組、空病毒組及空白對(duì)照組關(guān)節(jié)面均出現(xiàn)異常高密度影,但病毒組區(qū)域最小。大體觀察及組織學(xué)觀察見,病毒組、空病毒組及空白對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨符合早期OA改變,但病毒組修復(fù)程度優(yōu)于空病毒組及空白對(duì)照組,根據(jù)改良Pineda評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)評(píng)分亦較低,比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫組織化學(xué)染色示,病毒組細(xì)胞質(zhì)染色較空病毒組及空白對(duì)照組深,偶爾可見棕黃色顆粒,軟骨細(xì)胞較多。RT-PCR檢測(cè),與空病毒和空白對(duì)照組相比,病毒組COX-2、Aggrecanase-1 mRNA表達(dá)明顯降低,IGF-1 mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05)。 結(jié)論慢病毒介導(dǎo)的多基因轉(zhuǎn)染BMSCs可以有效抑制食蟹猴早期OA模型膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)COX-2和Aggrecanse-1的表達(dá),增強(qiáng)IGF-1的表達(dá),降低膝關(guān)節(jié)內(nèi)炎性因子濃度,有效保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。

    發(fā)表時(shí)間:2016-10-02 04:55 導(dǎo)出 下載 收藏 掃碼
  • 瑞香素聯(lián)合IGF-1對(duì)大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響

    目的初步研究瑞香素(dephnetin,DAP)聯(lián)合 IGF-1 基因轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)成軟骨分化的影響。方法采用酶消化法分離培養(yǎng)大鼠 ADSCs。取第 3 代 ADSCs 以 IGF-1 基因轉(zhuǎn)染作為實(shí)驗(yàn)組,未轉(zhuǎn)染的 ADSCs 作為對(duì)照組。兩組細(xì)胞分別用不同濃度 DAP(0、30、60、90 μg/mL)處理,培養(yǎng) 72 h 后采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 8(cell counting kit 8,CCK-8)法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性;培養(yǎng) 14 d 分別采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和 Western blot 檢測(cè)Ⅱ型膠原和蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA 和蛋白表達(dá),并行甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色觀察。結(jié)果CCK-8 法檢測(cè)示,隨 DAP 作用濃度增加,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞吸光度(A)值均逐漸增加(P<0.05);相同 DAP 濃度下,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞A值顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和 Western blot 檢測(cè)示,隨 DAP 作用濃度增加,對(duì)照組細(xì)胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 的 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量無明顯變化,各濃度組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 的 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸增加,其中 60、90 μg/mL DAP 濃度組顯著高于 0 μg/mL DAP 濃度組(P<0.05)。相同 DAP 濃度下,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 的 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。甲苯胺藍(lán)染色示,隨 DAP 作用濃度增加,對(duì)照組內(nèi)和實(shí)驗(yàn)組內(nèi)細(xì)胞著色無明顯差異;相同 DAP 濃度下,實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)胞著色略深。Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色示,隨 DAP 作用濃度增加,對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)著色無明顯差異;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)著色逐漸加深,其中 60、90 μg/mL DAP 濃度組明顯深于 0 μg/mL DAP 濃度組。相同 DAP 濃度下,實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)胞著色明顯加深。結(jié)論DAP 對(duì)大鼠 ADSCs 增殖有一定促進(jìn)作用;單獨(dú)使用 DAP 誘導(dǎo)大鼠 ADSCs 向軟骨細(xì)胞分化作用極微弱,但 DAP 聯(lián)合 IGF-1 基因轉(zhuǎn)染有明顯協(xié)同作用,促進(jìn) ADSCs 成軟骨分化。

    發(fā)表時(shí)間:2019-06-04 02:16 導(dǎo)出 下載 收藏 掃碼
  • 慢病毒介導(dǎo)的 IGF-1 與 PDGF 基因?qū)θ送俗冏甸g盤髓核組織的影響

    目的觀察比較人正常和退變髓核的細(xì)胞學(xué)和生物學(xué)差異,并研究 IFG-1 和 PDGF 對(duì)人退變髓核的修復(fù)作用。方法取患者自愿捐贈(zèng)的人退變及正常髓核組織,一部分制作成組織切片,進(jìn)行 HE 染色觀察髓核退變前后形態(tài)變化,免疫組織化學(xué)染色觀察Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、B 淋巴細(xì)胞瘤 2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān) X(Bcl-2 associate X,Bax)蛋白表達(dá);另一部分髓核組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),Western blot 檢測(cè)Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。然后進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),分為 4 組,A 組為退變髓核細(xì)胞;B、C、D 組分別用 IGF-1 基因慢病毒顆粒、PDGF 基因慢病毒顆粒和攜帶 IGF-1、PDGF 雙基因的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染退變髓核細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 21 d,倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞 IGF-1 和 PDGF 陽(yáng)性率,免疫組織化學(xué)染色和 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。結(jié)果HE 染色示,正常組中央髓核組織可見大量脊索細(xì)胞和少量類軟骨細(xì)胞;而退變組髓核細(xì)胞明顯減少,且髓核組織內(nèi)可見大量纖維軟骨組織。免疫組織化學(xué)染色示,退變組Ⅰ型膠原、Bax 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著高于正常組,Ⅱ型膠原、Bcl-2 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著低于正常組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot 檢測(cè)示,退變組Ⅱ型膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常組(t=65.493,P=0.000)?;蜣D(zhuǎn)染后 21 d,與 A 組比較,B、C、D 組細(xì)胞活性增加,形態(tài)變得較為規(guī)則。流式細(xì)胞儀檢測(cè)示 B、D 組 IGF-1 陽(yáng)性率較 A 組明顯增高,C、D 組PDGF 陽(yáng)性率較 A 組明顯增高(P<0.05)。免疫組織化學(xué)染色觀察示,A、B、C、D 組Ⅱ型膠原蛋白陽(yáng)性染色情況依次為(±)、(+)、(+)、(++)。Western blot 檢測(cè)示,A、B、C、D 組Ⅱ型膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量依次增加,各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論IGF-1 與 PDGF 均能逆轉(zhuǎn)椎間盤髓核細(xì)胞的退變且二者具有協(xié)同作用,為其今后應(yīng)用于臨床治療椎間盤退變性疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    發(fā)表時(shí)間:2020-07-27 07:36 導(dǎo)出 下載 收藏 掃碼
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