目的 探討人椎間盤細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分子表型差異，分析hBMSCs 經(jīng)TGF-β3 和BMP-7 聯(lián)合誘導(dǎo)后能否分化為軟骨細(xì)胞和髓核細(xì)胞。 方法 取9 例自愿捐贈(zèng)者髂嵴骨髓20 ～ 40 mL 分離培養(yǎng)hBMSCs。取第4 代hBMSCs 行三維微球培養(yǎng)。根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入的生長(zhǎng)因子不同，實(shí)驗(yàn)分成 4 組，分別為加入10 ng/mL TGF-β3 組（A 組）、200 ng/mL BMP-7 組（B 組）、同時(shí)加入兩種生長(zhǎng)因子組（C 組）以及空白對(duì)照組（D 組）。于培養(yǎng)后21 d，行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)觀察；于培養(yǎng)后4、21 d 進(jìn)行PCR 檢測(cè)Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型膠原、蛋白多糖和SOX9 基因的表達(dá)。 結(jié)果 培養(yǎng)后21 d，HE 染色示A 組和C 組細(xì)胞呈軟骨細(xì)胞樣形態(tài)特征，甲苯胺藍(lán)染色及免疫組織化學(xué)染色Ⅱ型膠原表達(dá)呈陽(yáng)性。B 組和D 組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，PCR 檢測(cè)示培養(yǎng)后21 d，A、C 組SOX9、蛋白多糖、Ⅰ型膠原及Ⅱ型膠原表達(dá)較4 d 時(shí)明顯增加（P lt; 0.05）。B、D 組Ⅰ型膠原表達(dá)較4 d 時(shí)明顯增加（P lt; 0.05），SOX9、蛋白多糖及Ⅱ型膠原較4 d 時(shí)無(wú)明顯變化（P gt;0.05）。其中僅A組Ⅹ型膠原表達(dá)呈陽(yáng)性。 結(jié)論 TGF-β3 和BMP-7 聯(lián)合應(yīng)用能促進(jìn)hBMSCs 分化更接近于椎間盤細(xì)胞，可能為椎間盤組織工程提供種子細(xì)胞。
目的 探討TGF-β3 基因修飾后退變髓核細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)以及植入兔退變椎間盤后對(duì)退變椎間盤的影響。 方法 將重組腺病毒載體Ad-TGF-β3 與第2 代退變髓核細(xì)胞按10 ∶ 1 比例混合培養(yǎng)轉(zhuǎn)染（Ad-TGF-β3 組），待細(xì)胞融合后傳代，MTT 檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖活性，Western blot 檢測(cè)TGF-β3 蛋白含量，免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)染細(xì)胞Ⅱ型膠原染色陽(yáng)性率；采用病毒空載體轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞（Adv 組）和未經(jīng)轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞（空白組）作為對(duì)照。取30 只新西蘭兔，體重3.2 ～ 3.5 kg，雌雄不限，通過(guò)針刺L3、4、L4、5 和L5、6 椎間盤制備椎間盤退變模型。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照隨機(jī)數(shù)字法分為3 組，轉(zhuǎn)染細(xì)胞組（A 組，n=12）、退變細(xì)胞組（B 組，n=12）和空白對(duì)照組（C 組，n=6）。A、B 組將100 μL 濃度為1 × 105 個(gè)/mL 對(duì)應(yīng)細(xì)胞懸液注射入退變椎間盤，C 組同法注入等量PBS。注射后6、10、14 周取A、B 組各4 只、C 組2 只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，取L3、4、L4、5 和L5、6 椎間盤行組織學(xué)觀察，RT-PCR 檢測(cè)Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA 表達(dá)。 結(jié)果 Ad-TGF-β3轉(zhuǎn)染后髓核細(xì)胞活性明顯改善；轉(zhuǎn)染后3、7、14 d，TGF-β3在髓核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)逐漸升高；Ad-TGF-β3 組髓核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)棕黃色Ⅱ型膠原陽(yáng)性染色，陽(yáng)性率顯著高于Adv 組及空白組（P lt; 0.05）。組織學(xué)觀察示，A 組椎間盤退變程度較B、C組明顯減輕。6、10、14 周A組Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA表達(dá)顯著高于B、C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 TGF-β3 基因修飾退變髓核細(xì)胞后可明顯改善細(xì)胞生物活性，轉(zhuǎn)染后髓核細(xì)胞植入兔體內(nèi)可明顯增加退變椎間盤的基質(zhì)分泌。
【摘 要】 目的 通過(guò)將轉(zhuǎn)染TGF-β3c2s2 基因的兔BMSCs 移植于兔耳瘢痕模型，觀察轉(zhuǎn)基因BMSCs 對(duì)創(chuàng)面愈合后增生性瘢痕形成的影響。 方法 成年健康日本大耳白兔20 只，體重1.7 ～ 2.5 kg，雌雄不拘。取第3 代兔BMSCs，經(jīng)Ad-TGF-β3c2s2 在感染復(fù)數(shù)150 下轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)孵育24 h 后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL 備用。將純化、濃縮的Ad-TGF-β3c2s2顆粒，DMEM/F12（不含F(xiàn)BS）稀釋為1×108 pfu/mL 備用。于20 只日本大耳白兔雙側(cè)兔耳分別制備兩個(gè)2 cm × 2 cm 大小的腹側(cè)全層皮膚、軟骨缺損創(chuàng)面。將每只兔的4 個(gè)創(chuàng)面隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A組）、Ad-TGF-β3c2s2 組（B組）、BMSCs 組（C組）和BMSCs/Ad-TGF-β3c2s2 組（D 組），并以自身正常皮膚作為正常對(duì)照（E 組）。將備好的細(xì)胞及病毒液分別按創(chuàng)面分組進(jìn)行局部移植。于術(shù)后21、45、90 d 行大體觀察、瘢痕硬度和厚度測(cè)定、HE 染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果 大體觀察：A、B、C 組上皮化后創(chuàng)面均逐漸形成不同程度的瘢痕，傷后45 d 瘢痕增生程度達(dá)高峰，明顯高出皮膚表面，持續(xù)至90 d，D 組在觀察期內(nèi)均無(wú)明顯高出周圍皮膚的瘢痕形成。術(shù)后45 d 和90 d，A、B、C 組瘢痕厚度和硬度明顯高于D 組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01），而B(niǎo) 組低于A、C 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）；D 組愈合后創(chuàng)面厚度和硬度與正常皮膚接近。HE 染色觀察：A、C 組傷后45 d 可見(jiàn)淺層組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，膠原纖維粗大，呈交錯(cuò)網(wǎng)織狀排列；B 組和D組結(jié)構(gòu)與正常皮膚接近，但較E 組膠原排列致密，表皮較A、C 組??；90 d 各組結(jié)構(gòu)與45 d 相似。BrdU 免疫組織化學(xué)觀察，傷后21、45 d，C、D 組均能見(jiàn)到散在分布、胞核染色陽(yáng)性的棕色細(xì)胞，A、B、E 組均為陰性。 結(jié)論 創(chuàng)面局部移植人TGF- β3c2s2 基因修飾的BMSCs，具有抑制創(chuàng)面愈合后增生性瘢痕的作用。