目的 通過基因工程手段從大鼠脊髓中獲取Nogo-66、NEP1-40基因并實現(xiàn)其蛋白的體外表達。 方法 從幼年大鼠的脊髓組織中，通過RT-PCR技術獲得Nogo-66、 NEP1-40基因，將目的基因通過基因連接反應與T載體連接，重組質粒進行基因序列測序，構建PQE30-GST和目的基因的高表達質粒，異丙基βD硫代半乳糖(isopropylthiogalactoside,IPTG)誘導表達，Ni柱純化，Western-blot法檢測純化的目的蛋白。 結果 成功獲得大鼠Nogo-66、NEP1-40基因，加上兩端的酶切位點和保護性堿基，大小分別為215 bp和137 bp。序列測序顯示基因突變率為0，表達質粒構建雙酶切(BamH Ⅰ-和Hind Ⅲ)可見目的基因的條帶，經IPTG誘導表達，獲得帶GST標簽的融合蛋白Nogo-66和NEP1-40，相對分子質量分別為33.2×103和30.3×103。蛋白純化結果理想，經Westernblot分析證實抗原性正確。 結論 Nogo-66、NEP1-40蛋白可通過基因工程手段獲得體外高效表達，這將對其功能的研究及脊髓損傷疫苗的研究提供基礎。
目的 探討NEP1-40（Nogo extracellular peptide residues 1-40）基因修飾對神經干細胞（neural stem cells，NSCs）移植后存活和分化的影響。 方法 從孕18 d Wistar大鼠胚胎大腦皮質中分離獲得原代NSCs并進行體外培養(yǎng)。采用慢病毒載體將NEP1-40基因導入第3代NSCs內完成NEP1-40基因修飾。將30只成年雌性SD大鼠在T9水平進行脊髓右側半切后隨機分為脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）組（B組）、NSCs移植組（C組）、NEP1-40基因修飾NSCs組（D組），每組各10只，傷后7 d在損傷局部分別植入NSCs基礎培養(yǎng)基、NSCs懸液及NEP1-40基因修飾的NSCs；另取10只SD大鼠僅行T9椎板切除設為假手術組（A組）。移植后8周，取損傷段脊髓組織行辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）神經示蹤、巢蛋白（Nestin）免疫熒光染色及神經絲蛋白200（neurofilament 200，NF-200）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）、髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）免疫組織化學染色，評價神經纖維再生情況及移植細胞存活和分化情況。 結果 移植后8周，A、B、C、D組HRP陽性染色神經纖維束分別為（85.17 ± 6.97）、（12.17 ± 2.79）、（33.58 ± 5.47）、（59.25 ± 7.75）個，B、C、D組顯著少于A組（P lt; 0.01）；但C、D組顯著高于B組，D組顯著高于C組，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）。Nestin免疫熒光染色示，A組未見明顯Nestin熒光信號，B組僅可見少量散在熒光信號，C、D組有較強熒光信號。免疫組織化學染色定量分析示，NF-200陽性細胞數(shù)及MBP積分吸光度（IA）值A組最高，D組次之，C組較少，B組最少，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）；GFAP陽性細胞數(shù)B組最多，D組次之，C組較少，A組最少，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）；C、D組間NF-200、GFAP、MBP陽性細胞百分比比較差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結論 NEP1-40基因修飾對NSCs移植后的分化無明顯誘導性，但能促進移植細胞存活、分化及神經元軸突再生，為研究NSCs移植治療SCI提供了新思路。
【摘 要】 目的 構建NEP1-40（Nogo extra cellular peptide residues 1-40）基因慢病毒表達載體，為后續(xù)轉染目的細胞奠定基礎，并實現(xiàn)在細胞中高效、穩(wěn)定表達。 方法 從含有 NEP1-40 基因的 cDNA 文庫中，利用PCR 方法釣取NEP1-40 基因編碼區(qū)片段。將目的基因與酶切線性化的載體pGC-FU 進行定向連接，其產物轉化細菌感受態(tài)細胞。對長出的克隆先進行菌落PCR 鑒定，再對PCR 鑒定陽性的克隆進行測序和比對分析，比對正確的克隆即為構建成功的目的質粒。將構建成功的目的質粒和兩種輔助包裝質粒共轉染293T 細胞，包裝成慢病毒，熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉染293T細胞后熒光表達情況，采用Western blot 檢測NEP1-40 及綠色熒光蛋白融合蛋白表達情況。 結果 PCR 產物經電泳分析表明成功獲取NEP1-40 基因cDNA 克隆，測序提示慢病毒轉染質粒連接構建正確；熒光表達檢測顯示293T 細胞中產生慢病毒顆粒；Western blot 顯示NEP1-40 在細胞內穩(wěn)定表達。 結論 成功構建NEP1-40 基因慢病毒表達載體，為后續(xù)轉染目的細胞后從分子水平探討NEP1-40 基因功能奠定了實驗基礎。
目的通過慢病毒載體將 NEP1-40（Nogo extracellular peptide residues 1-40）及神經營養(yǎng)因子 3（neurotrophin 3，NT-3）雙基因轉染入神經干細胞（neural stem cells，NSCs）內進行表達，探討 NEP1-40 及 NT-3 雙基因轉染 NSCs 的可行性，為 NSCs 體內實驗奠定基礎。方法將 SD 大鼠胚胎室管膜區(qū) NSCs 采用空載慢病毒載體（A 組）、NEP1-40 慢病毒載體（B 組）、NT-3 慢病毒載體（C 組）及 NEP1-40 和 NT-3 慢病毒載體（D 組）進行轉染，以未轉染病毒的細胞作為對照組（E 組）。用感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為 5、10、15 的慢病毒載體分別轉染 24、48、72 h，熒光顯微鏡觀察轉染后細胞內熒光表達情況，確定慢病毒載體的最佳 MOI 和收樣時間。再分別通過實時熒光定量 PCR 及 Western blot，檢測轉染后細胞中 NEP1-40 及 NT-3 基因的表達，以及細胞和培養(yǎng)基中 NEP1-40 及 NT-3 蛋白的表達。結果熒光顯微鏡觀察示，MOI 為 10 時 NEP1-40 和 NT-3 基因慢病毒載體在 NSCs 內轉染率最高，最佳時間為轉染 48 h 時。實時熒光定量 PCR 及 Western blot 檢測示，B、D 組 NEP1-40 mRNA 相對表達量和蛋白相對表達量均顯著高于 A、C 組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；A、C 組間及 B、D 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。C、D 組 NT-3 mRNA 相對表達量和蛋白相對表達量均顯著高于 A、B 組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；A、B 組間和 C、D 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論通過慢病毒載體可將 NEP1-40 及 NT-3 雙基因成功轉染入 NSCs 內，在 NSCs 內穩(wěn)定表達，且兩種目的基因在表達過程中無相互拮抗或促進作用。