目的 探索體外構(gòu)建人外泌汗腺樣結(jié)構(gòu)的方法。 方法 取自愿捐獻的正常腋部全層皮膚，分離培養(yǎng)汗腺腺上皮細胞，倒置相差顯微鏡下觀察。將汗腺腺上皮細胞以2 × 105 個/cm2 密度接種至Matrigel 凝膠下（A 組）、凝膠上（B 組）、凝膠中（C 組），進行三維立體培養(yǎng)，激光掃描共聚焦顯微鏡、HE 染色及免疫組織化學(xué)染色觀察有無汗腺樣結(jié)構(gòu)形成。 結(jié)果 原代汗腺分泌部上皮細胞接種后24 h 可見細胞貼壁，貼壁細胞呈梭形，2 ～ 3 d 后細胞呈多克隆麥粒樣生長，14 d 后細胞融合呈鋪路石樣生長，融合后的汗腺腺上皮細胞呈扁平多角形，中間有較大圓形核；第1 代細胞形態(tài)與原代極為相似；第2 代細胞形態(tài)不規(guī)則，多數(shù)伸出長偽足；第3 代細胞多呈星形狀，細胞體積大，與鄰近細胞相互融合。A 組汗腺腺上皮細胞三維立體培養(yǎng)11 d 形成管腔結(jié)構(gòu)；B 組汗腺腺上皮細胞立體培養(yǎng)8 h，細胞胞漿伸長呈絲狀，與鄰近細胞相連呈管腔或半管腔形，但細胞增殖不明顯；C 組汗腺腺上皮細胞三維立體培養(yǎng)2 ～ 3 d，細胞分裂增生，增生細胞彼此緊密排列成管腔結(jié)構(gòu)，中間可見明顯腔隙，隨新生細胞增多，管腔結(jié)構(gòu)逐漸演變?yōu)椴灰?guī)則球形結(jié)構(gòu)。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察示C 組形成球形結(jié)構(gòu)，細胞團中央有管腔結(jié)構(gòu)；球形結(jié)構(gòu)HE 染色示為管腔結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)染色示角蛋白18、癌胚抗原表達陽性，與汗腺分泌部管狀結(jié)構(gòu)極為相似。 結(jié)論 汗腺腺上皮細胞在Matrigel 凝膠中三維立體培養(yǎng)可形成汗腺樣結(jié)構(gòu)。
研究肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）對培養(yǎng)的人外泌汗腺上皮細胞（human eccrine sweat gland epithelial cells，hESGc）的促增殖作用，以及細胞內(nèi)磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2，p-ERK1/2）蛋白的表達。 方法 在無血清角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基（keratinocyte serum free medium，KSFM）中培養(yǎng)hESGc，取第1 代細胞進行實驗。免疫組織化學(xué)染色檢測C-met 表達。MTT 法檢測HGF 對hESGc 的促增殖作用，實驗分為3 組：空白組、對照組和實驗組?？瞻捉M僅含200 μL KSFM；對照組于96 孔板以2 × 103 個/ 孔接種hESGc，并加入200 μL KSFM；實驗組于96 孔板以2 × 103 個/ 孔接種hESGc 并加入200 μLKSFM 后，再分別加入不同濃度（2、20、40、80 ng/mL）HGF。實驗組于加入各濃度HGF 前以及加入后2、4 d，觀察細胞增殖情況。實驗組于加入40 ng/mL HGF 后即刻，5、30、90 和120 min，采用Western blot 方法檢測細胞內(nèi)p-ERK1/2表達規(guī)律。 結(jié) 果 hESGc 抗-C-met 免疫組織化學(xué)染色胞漿可見陽性染色，細胞核染色為藍色。MTT 法檢測示40、80 ng/ mLHGF 對hESGc 具有顯著促增殖作用（P lt; 0.05）。在含40 ng/mL HGF 的KSFM中培養(yǎng)2 d，吸光度（A）值為0.239 3 ±0.070 9，增殖率為74.2%，對照組A 值為0.137 4 ± 0.029 0；培養(yǎng)4 d，40 ng/mL HGF 實驗組A 值為0.287 8 ± 0.074 3，增殖率為74.8%，對照組A 值為0.164 6 ± 0.035 0，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。在含80 ng/mL HGF 的KSFM中培養(yǎng)2 d，A 值為0.212 3 ± 0.059 2，增殖率為54.5%；培養(yǎng)4 d，80 ng/mL HGF 實驗組A 值為0.231 0 ± 0.056 7，增殖率為40.3%；與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。p-ERK1/2 在40 ng/mL HGF 刺激5 min 后表達達高峰，相對積分吸光度值（relative integral absorbance，RIA）為0.593 2 ± 0.192 2，較刺激后即刻增加8.1 倍（P lt; 0.01）；刺激30、90 及120 min 后RIA 與刺激后即刻比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt; 0.05） 結(jié)論 HGF 可促進hESGc 增殖，并能引起ERK1/2蛋白磷酸化。
目的 探討外胚葉發(fā)育不全（ectodysplasin，EDA）基因信號途徑與汗腺發(fā)育及修復(fù)的關(guān)系。方法 通過對近期國內(nèi)外相關(guān)文獻的回顧，了解EDA基因的生物學(xué)特性、信號傳導(dǎo)途徑和促進汗腺發(fā)育的分子機制。結(jié)果 大量實驗證實EDA基因在胎兒發(fā)育早期參與了胚胎皮膚汗腺的形態(tài)和功能發(fā)生。結(jié)論 EDA基因?qū)ζつw汗腺的發(fā)生和結(jié)構(gòu)的形成以及皮膚生理功能的維持具有重要意義，可為實現(xiàn)基因調(diào)控皮膚受損汗腺的完美修復(fù)找到一條新路。
目的總結(jié)肛周化膿性汗腺炎的臨床特點、診斷及治療方法。 方法回顧性分析我院肛腸外科2013年1月至2015年12月期間收治的13例肛周化膿性汗腺炎患者的臨床資料。 結(jié)果全部病例均行外科手術(shù)治療，術(shù)中切開所有瘺管，徹底清除瘺管壁，術(shù)后給予抗炎、換藥等治療。手術(shù)時間（50±6）min，住院時間平均16.3 d，傷口愈合時間平均45.6 d。隨訪半年，1例患者4個月后局部復(fù)發(fā)再次入院，以同樣手術(shù)方式治療后治愈。其余患者均治愈，未復(fù)發(fā)，無失禁，愈合后肛周切口形成瘢痕，無感染。 結(jié)論肛周化膿性汗腺炎診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)及病理學(xué)檢查，誤診率高，治療以手術(shù)為主。早期診斷，及時治療，手術(shù)徹底，是治愈肛周化膿性汗腺炎、降低復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。
目的探討人體外泌汗腺組織體外三維培養(yǎng)方法，并對構(gòu)建的三維組織進行形態(tài)學(xué)分析。 方法取整形手術(shù)患者自愿捐贈的正常腹部全層皮膚，經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化分離人體外泌汗腺組織，以含5 ng/mL重組人EGF、25 mg/mL牛垂體提取物、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的無血清角質(zhì)細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。待原代細胞達80%融合后，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL；取0.3 mL細胞懸液與0.3 mL Matrigel基底膜基質(zhì)混勻培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。培養(yǎng)14 d后，取標本行冰凍切片，HE染色觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)染色檢測細胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）和CK19抗原表達。 結(jié)果倒置相差顯微鏡觀察示，經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化后大量汗腺組織游離；貼壁后3～5 d長出汗腺細胞，細胞持續(xù)分裂達2～3周，形成圍繞汗腺組織塊的環(huán)狀單層；3～4周后細胞衰老。汗腺細胞接種于Matrigel基底膜基質(zhì)中2～3 d，細胞開始分裂，隨后形成小細胞團、管狀結(jié)構(gòu)以及類球狀結(jié)構(gòu)；約2周時混合培養(yǎng)物開始液化，培養(yǎng)終止。HE染色示部分細胞形成中空管狀結(jié)構(gòu)，管壁由1～2層細胞構(gòu)成，類似于在體汗腺的分泌部和導(dǎo)管部；免疫組織化學(xué)染色見培養(yǎng)的汗腺細胞CK7和CK19表達均呈陽性。 結(jié)論人汗腺細胞接種于Matrigel基底膜基質(zhì)三維培養(yǎng)，形成的組織結(jié)構(gòu)模擬了在體汗腺的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。
目的探討miRNA-203轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人表皮干細胞向汗腺細胞分化的可能性及機制。 方法取包皮環(huán)切術(shù)獲得的人正常包皮組織5例，采用0.25%胰蛋白酶-EDTA聯(lián)合消化法分離表皮和真皮，應(yīng)用Ⅳ型膠原差速貼壁法純化人表皮干細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況，行β1整合素（integrin β1，ITGB1）、角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）、CK1、CK10、CK18、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）免疫細胞化學(xué)染色鑒定。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將miRNA-203模擬物導(dǎo)入人表皮干細胞（實驗組），轉(zhuǎn)染對照miRNA模擬物作為對照組。免疫細胞化學(xué)染色法對轉(zhuǎn)染后細胞行ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA單克隆抗體檢測鑒定；實時熒光定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后72 h的細胞中miRNA-203、P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA mRNA相對表達量；Western blot法檢測P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA蛋白相對表達量；并對miRNA-203的mRNA表達與P63的mRNA和蛋白表達分別行Pearson相關(guān)分析。 結(jié)果轉(zhuǎn)染前人表皮干細胞CK19、ITGB1陽性表達，轉(zhuǎn)染后CK1、CK10、CK18、CEA陽性表達。實驗組轉(zhuǎn)染后細胞miRNA-203 mRNA相對表達量顯著高于轉(zhuǎn)染前（P＜0.05）。實驗組轉(zhuǎn)染后細胞CK1、CK10、CK18、CEA mRNA及蛋白的相對表達量均高于轉(zhuǎn)染前及對照組，而P63、CK19、ITGB1 mRNA及蛋白的相對表達量均低于轉(zhuǎn)染前和對照組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。上述指標對照組與轉(zhuǎn)染前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染前后miRNA-203的mRNA表達量與P63的mRNA和蛋白相對表達量均成負相關(guān)，轉(zhuǎn)染前相關(guān)系數(shù)分別為—0.91（t=3.862，P=0.042）及—0.96（t=5.971，P=0.009）；轉(zhuǎn)染后相關(guān)系數(shù)分別為—0.92（t=4.283，P=0.031）及—0.95（t=5.842，P=0.011）。 結(jié)論miRNA-203能誘導(dǎo)人表皮干細胞分化為汗腺細胞，其作用可能是通過靶向抑制P63來實現(xiàn)的。
目的探討表皮干細胞（epidermal stem cells，ESCs）誘導(dǎo)分化為汗腺細胞（sweat gland cells，SGCs）過程中表型的改變及其通路的調(diào)控機制。 方法取健康成人包皮，采用中性蛋白酶消化后高濃度Ⅳ型膠原黏附法分離培養(yǎng)獲得ESCs，行β1整合素、角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）及p63免疫熒光染色法鑒定；取健康成人全層皮膚，采用Ⅱ型膠原酶消化法分離提取汗腺組織，體外增殖培養(yǎng)SGCs，行CK7、CK18、CK19和癌胚抗原（carcinoembryonicantigen，CEA）免疫熒光法鑒定。取第2代ESCs分為4組：A組將ESCs及SGCs兩種細胞通過Ttranswell共培養(yǎng)系統(tǒng)共培養(yǎng)，B組通過單純添加汗腺上清液培養(yǎng)ESCs，C組在A組基礎(chǔ)上加入濃度為60 ng/mL的EGF，D組在A組基礎(chǔ)上加入濃度為10 mmol/L的PD98059。分別通過倒置相差顯微鏡進行細胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細胞術(shù)檢測ESCs表型陽性率及Western blot檢測分化過程中的信號通路機制。 結(jié)果經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光染色鑒定，提示培養(yǎng)細胞為ESCs和SGCs。倒置相差顯微鏡觀察示，A、C、D組培養(yǎng)后細胞形態(tài)變化相似，9 d后細胞開始出現(xiàn)扁平多角形結(jié)構(gòu)改變；B組形態(tài)變化較慢，培養(yǎng)12 d后與其他3組結(jié)構(gòu)相似。流式細胞術(shù)結(jié)果示，與B組比較，A組Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)共培養(yǎng)后，ESCs的β1整合素陽性率顯著下調(diào)、CEA陽性率顯著上調(diào)（P<0.05）；C組加入EGF可降低共培養(yǎng)系統(tǒng)中ESCs的β1整合素下調(diào)和CEA上調(diào)，D組加入PD98059可增強共培養(yǎng)系統(tǒng)中ESCs的β1整合素下調(diào)和CEA上調(diào)，A、C、D組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Western blot檢測示，4組均有較高水平細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）表達，但B組明顯低于其他3組（P<0.05）；磷酸化-ERK表達A組最高、C組最低，各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論處于SGCs生長環(huán)境中時，通過Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)共培養(yǎng)，ESCs可經(jīng)誘導(dǎo)分化為SGCs，其表型發(fā)生相應(yīng)改變；通過對絲裂原活化蛋白激酶/ERK通路的控制，可以調(diào)節(jié)ESCs的分化方向和程度。
目的構(gòu)建預(yù)測乳腺大汗腺癌（breast apocrine carcinoma，BAC）患者總生存情況的列線圖。方法從監(jiān)測、流行病學(xué)和最終結(jié)果（Surveillanc，Epidemiology，and End Results，SEER）數(shù)據(jù)庫中選擇2010–2016年期間診斷為BAC的患者，按7∶3比例隨機分為訓(xùn)練集和驗證集；另收集2010年1月1日至2018年12月31日期間國藥東風總醫(yī)院收治的BAC患者對列線圖進行外部驗證。采用單因素和多因素Cox回歸模型來確定影響B(tài)AC患者總生存期的風險因素并以此構(gòu)建列線圖預(yù)測模型。用C指數(shù)和受試者操作特征曲線下面積（area under curve，AUC）評價列線圖對BAC患者3、5年總生存情況的區(qū)分能力，采用校準曲線評估列線圖的預(yù)測情況與實際發(fā)生情況的接近程度。結(jié)果從SEER數(shù)據(jù)庫中共納入符合本研究條件的BAC患者649例（其中訓(xùn)練集454例、內(nèi)部驗證集195例），納入了國藥東風總醫(yī)院的21例BAC患者（外部驗證集）。多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，BAC患者的年齡、T分期、M分期、S分期、手術(shù)方式及化療是與BAC患者預(yù)后有關(guān)的重要影響因素（P<0.05），基于這些因素構(gòu)建的列線圖預(yù)測模型在訓(xùn)練集、內(nèi)部驗證集和外部驗證集中的C指數(shù)值分別為0.76、0.77和0.88，校準曲線顯示列線圖預(yù)測的3年和5年總生存率與實際3年和5年總生存率均接近理想曲線。列線圖模型評估BAC患者的3年和5年總生存期的AUC（95%CI）在訓(xùn)練集分別為0.84（0.78，0.89）和0.76（0.71，0.83），在內(nèi)部驗證集分別為0.81（0.73，0.91）和0.84（0.77，0.91），在外部驗證集分別為0.80（0.70，0.91）和0.84（0.76，0.91）。結(jié)論本研究基于SEER數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的預(yù)測BAC患者總生存情況的列線圖對BAC患者預(yù)后預(yù)測具有一定的價值。