引用本文： 宋志芳, 刘德伍, 彭燕, 李津, 章志伟, 宁璞, 刘移峰. miRNA-203转染诱导人表皮干细胞向汗腺细胞分化的研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(3): 343-350. doi: 10.7507/1002-1892.20150073 复制
严重烧伤、创伤常造成皮肤组织广泛缺损，创面修复后，因汗腺缺失或其分泌管道被瘢痕组织堵隔而丧失了分泌汗液的功能，导致患者体温调节功能障碍。如何修复汗腺等附属器以实现皮肤的功能重建，是目前医学研究热点[1]。近期研究表明miRNA与皮肤再生修复相关[2-3]，作为表皮及毛囊特有的miRNA-203伴随着表皮分化的开始而表达，即在富含表皮干细胞的表皮基底层低表达，而在富含角质形成细胞的基底上层高表达，提示其可能在皮肤发育中起着增殖和分化的开关作用[4-5]。Nissan等[6]发现miRNA-203能调控胚胎干细胞向角朊细胞的早期定向分化。miRNA-203能否诱导人表皮干细胞向汗腺细胞分化，目前尚不清楚。本研究设计合成了miRNA-203模拟物，通过脂质体转染将其导入人表皮干细胞，探索体外诱导表皮干细胞向汗腺细胞分化的可能性，为实现创面的功能愈合提供新思路与理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
0.25 %胰蛋白酶-EDTA、EGF、角质细胞无血清培养基（keratinocyte serum free medium，K-SFM）、FBS、Ⅳ型胶原、Opti-MEM培养基（GIBCO公司，美国）；兔抗人β1整合素（integrin β1，ITGB1）、角蛋白1（cytokeratin 1，CK1）、CK10、CK19、CK18、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、P63（Abgent公司，美国）；辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔二步法免疫组织化学检测试剂盒（PV-9000）、山羊抗兔IgG-HRP二抗、兔抗人β肌动蛋白一抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；FAM标记的人miRNA-203模拟物及FAM标记的对照miRNA（上海吉玛制药技术有限公司）；Trizol、脂质体Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen公司，美国）；mirVanaTM miRNA纯化试剂盒（Ambion公司，美国）；互补DNA反转录试剂盒、SYBR Green荧光定量试剂盒（TaKaRa公司，日本）；Super-Bradford 蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）。
CK40型倒置相差显微镜、CKX41型倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；CO2培养箱（Thermo公司，德国）；FACSCalibur 流式细胞仪（BD 公司，美国）；分光光度计（NanoDrop公司，美国）；7900 HT型荧光定量RT-PCR仪（ABI公司，美国）；Image Pro-plus 6.0图像分析软件（Media Cyberneties公司，美国）；电泳仪、电转仪（北京六一仪器厂）。
1.2 人表皮干细胞的分离培养及鉴定
取2013年9月－11月在南昌大学第一附属医院泌尿外科行包皮环切术的5例患者正常包皮组织标本，年龄18～40岁；患者均知情同意，研究方案经医院医学伦理委员会审核批准。采用0.25%胰蛋白酶-EDTA联合消化法分离表皮与真皮，应用Ⅳ型胶原快速黏附法[7]筛选获得人表皮干细胞，在由EGF、K-SFM组成的培养基中进行体外培养，之后定期换液，倒置相差显微镜观察细胞分离即刻及培养3 d的生物学特性。细胞生长至90%融合时进行消化传代，取第2代细胞进行后续实验。采用HRP标记的山羊抗兔二步法免疫组织化学检测试剂盒行CK19、ITGB1、CK1、CK10、CK18、CEA免疫细胞化学染色鉴定。
1.3 细胞转染及相关检测
1.3.1 实验分组
取第2代人表皮干细胞，按说明书运用脂质体 Lipofectamine 2000转染试剂进行转染。根据人源miRNA-203序列，设计并合成其双链模拟物，实验组和对照组分别转染FAM标记的人miRNA-203模拟物（n=5）及FAM标记的对照miRNA（n=5）。转染6 h后倒置荧光显微镜下观察转染情况，FACSCalibur 流式细胞仪检测转染效率，重复3次。转染72 h后倒置相差显微镜观察两组细胞形态变化。
1.3.2 转染后免疫细胞化学染色观察
两组细胞转染后，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱孵育72 h，以PV-9000二步法行ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA免疫细胞化学染色观察，按试剂盒说明书进行操作。
1.3.3 实时荧光定量RT-PCR检测
取转染前及实验组、对照组转染72 h后的细胞，采用Trizol法分别提取总RNA，用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检总RNA的质量。使用 mirVanaTM miRNA纯化试剂盒对总RNA进行纯化，纯化后重新定量。① miRNA-203的mRNA表达检测：每个样本各取2 μg总RNA，采用互补DNA反转录试剂盒合成总互补DNA，反转录产物采用SYBR Green荧光定量试剂盒和荧光定量RT-PCR仪行PCR。人miRNA-203及内参照U6的反转录引物和PCR引物均购自上海吉玛制药技术有限公司，引物序列见表 1。PCR反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火l min，40个循环。每个样本重复PCR反应3 次。采用Δ 循环阈值（Ct）法处理结果，计算相对表达量2-ΔΔCt。② P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA的mRNA表达检测：每个样本各取2 μg总RNA，以OligdT为反转录引物，应用互补DNA反转录试剂盒合成总互补DNA。采用引物设计软件Primer Premier 5.0设计P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA及内参照β-actin的PCR引物，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表 1。反转录产物采用SYBR Green荧光定量试剂盒和荧光定量RT-PCR仪行PCR。每个样本重复PCR反应3次。PCR反应条件及表达量计算方法同① 。
表1
实时荧光定量RT-PCR引物序列及产物大小
Table1.
Real-time fluorescence quantitative RT-PCR primer sequences and product sizes
1.3.4 Western
blot检测提取转染前及实验组和对照组转染72 h后细胞的总蛋白，用二辛丁酸法进行蛋白定量，100℃变性10 min，各取50 μg行PAGE凝胶电泳，转移至硝酸纤维滤膜上，封闭。分别加入兔抗人P63一抗、兔抗人ITGB1一抗、兔抗人CK19一抗、兔抗人CK1一抗、兔抗人CK10一抗、兔抗人CK18一抗、兔抗人CEA一抗、兔抗人β-actin一抗（稀释比均为1∶200），4℃孵育过夜；TTBS液冲洗后加入羊抗兔IgG-HRP二抗（稀释比为1∶5 000），室温孵育2 h；TTBS液冲洗后曝片，胶片用扫描仪扫描成像，Image Pro-plus6.0图像分析软件进行灰度分析，结果以目的蛋白与β-actin的灰度值比值表示。实验重复3次。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；对miRNA-203的mRNA表达与P63的mRNA和蛋白表达分别行Pearson相关分析；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 人表皮干细胞形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜观察示，快速黏附于Ⅳ型胶原的细胞群细胞呈圆形，分散较均匀，细胞体积较小，细胞核大，核质比大，折光性较强（图 1 a）；孵育3 d后，细胞贴壁牢固并形成明显克隆，符合表皮干细胞特征（图 1 b）。免疫细胞化学染色示，CK19、ITGB1呈棕黄色阳性表达，CK1、CK10、 CK18、CEA呈阴性表达，符合表皮干细胞特征。见图 2。
图1
人表皮干细胞形态学观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ 细胞分离即刻细胞培养3 d 图 2 人表皮干细胞免疫细胞化学染色观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ CK19 ITGB1 CK1 CK10 CK18 CEA 图 3 两组细胞转染6 h后倒置荧光显微镜观察（×100） ⓐ 实验组 ⓑ 对照组 图 4 两组细胞转染6 h后流式细胞仪检测 ⓐ 实验组 ⓑ 对照组 图 5 两组细胞转染72 h后倒置相差显微镜观察形态变化（×100） ⓐ 实验组 ⓑ 对照组
Figure1.
Morphological observation of human epidermal stem cell (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ Cells at immediate after separated Cells cultured for 3 days Fig. 2 Immunohistochemistry staining of human epidermal stem cells (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ CK19 ITGB1 CK1 CK10 CK18 CEA Fig. 3 Inverted fluorescence microscope observation of cells transfected for 6 hours in 2 groups (×100) ⓐ Experimental group ⓑ Control group Fig. 4 Flow cytometry detection of cells transfected for 6 hours in 2 groups ⓐ Experimental group ⓑ Control group Fig. 5 The morphological changes of cells transfected for 72 hours observed by inverted phase contrast microscope (×100) ⓐ Experimental group ⓑ Control group
2.2 细胞转染及转染效率
倒置荧光显微镜观察示，实验组和对照组均可见多数细胞胞质内有荧光显示（图 3）；流式细胞仪检测示，实验组和对照组转染后荧光细胞比例分别为41.58%±0.54%和40.84%±0.67%，两组比较差异无统计学意义（t=1.937，P=0.089），见图 4。
倒置相差显微镜观察示，实验组细胞转染72 h后，细胞大小不一致，分散不均匀，细胞核小，核质比小，且无明显克隆形成，符合角质形成细胞特征（图 5 a）；而对照组细胞转染72 h后仍有克隆形成，符合表皮干细胞特征，转染前后无显著差异（图 5 b）。
2.3 转染后免疫细胞化学染色观察
实验组细胞转染72 h后免疫细胞化学染色示CK1、CK10、CK18、CEA呈棕黄色阳性表达，CK19、ITGB1呈阴性表达，符合角质形成细胞及汗腺细胞特征（图 6）；而对照组与转染前比较无变化。
图6
实验组细胞转染72 h后免疫细胞化学染色观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ CK1 ⓑ CK10 ⓒ CK18 ⓓ CEA ⓔ CK19 ⓕ ITB1 图 7 Western blot法检测各组细胞各蛋白表达 Mr：相对分子质量 1：实验组 2：转染前 3：对照组 ⓐ P63 ⓑ CK19 ⓒ ITGB1 ⓓ CK1 ⓔ CK10 ⓕ CK18 ⓖ CEA
Figure6.
Immunocytochemical staining of cells in experimental group transfected for 72 hours (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ CK1 ⓑ CK10 ⓒ CK18 ⓓ CEA ⓔ CK19 ⓕ ITB1 Fig. 7 The protein expression of cells by Western blot analysis Mr: Relative molecular mass 1: Experimental group 2: Before transfection 3: Control group ⓐ P63 ⓑ CK19 ⓒ ITGB1 ⓓ CK1 ⓔ CK10 ⓕ CK18 ⓖ CEA
2.4 实时荧光定量RT-PCR检测
实验组细胞转染72 h后，miRNA-203及CK1、CK10、CK18、CEA mRNA的相对表达量均高于转染前及对照组，而P63、CK19、ITGB1 mRNA的相对表达量均低于转染前和对照组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。对照组与转染前比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
实时荧光定量RT-PCR检测各组各基因表达（n=5，2.5 Western blot检测
实验组细胞转染72 h后，CK1、CK10、CK18、CEA蛋白相对表达量均高于转染前及对照组，而P63、CK19、ITGB1蛋白相对表达量均低于转染前和对照组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。对照组与转染前比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 3、图 7。
表3
Western blot检测各组各蛋白表达（n=5，2.6 miRNA-203和P63表达的相关性分析
转染前后miRNA-203 mRNA表达量与P63的mRNA和蛋白相对表达量均成负相关，转染前相关系数分别为-0.91（t=3.862，P=0.042）及-0.96（t=5.971，P=0.009）；转染后相关系数分别为-0.92（t=4.283，P=0.031）及-0.95（t=5.842，P=0.011）。
3 讨论
目前对大面积烧伤患者皮肤缺损的修复主要为创面修复，对皮肤功能重建问题仍未解决[8]。患者存活后常由于汗腺缺失，体温调节功能严重受损，生活质量显著降低[9]。因此，如何实现皮肤附件的功能修复与重建是烧伤创面修复与组织再生研究的热点及难点[10]。干细胞技术的建立和发展为解决这一难题提供了新的思路，通过干细胞移植诱导再生汗腺是其中的重要方法之一[11-12]。胚胎学上，表皮干细胞与汗腺在发育学上有共同的起源，均起源于外胚层上皮，外胚层上皮细胞通过分裂增殖并内陷在表皮嵴形成上皮细胞索，细胞索的近端发育成导管，末端发育为分泌部，构成汗腺[13]。因此有可能 利用 表皮 干细胞向汗腺细胞定向分化再生汗腺。
miRNA-203是长19～22 nt非编码单链RNA，能与靶mRNA3’UTR区结合在转录后水平抑制蛋白质的合成，达到负性调控基因表达的目的[14]。miRNA-203是首个发现在表皮及毛囊表达最丰富的miRNA。若miRNA-203 生物合成所需的Dicer酶或DGCR8基因被敲除，以致miRNA-203合成缺失，可导致皮肤屏障功能缺陷、毛囊发育不良、表皮基底层细胞过度增殖[15-16]，表明miRNA-203对皮肤发育和功能维持具有重要作用。本研究根据人源miRNA-203序列，设计并合成其双链模拟物，利用脂质体转染将miRNA-203模拟物分子导入人离体表皮干细胞中，通过倒置荧光显微镜下观察、流式细胞仪检测及转染前后miRNA-203的实时荧光定量RT-PCR测定均表明转染成功。对转染前后的细胞于倒置相差显微镜下观察形态变化，通过免疫细胞化学染色、实时荧光定量RT-PCR及Western blot技术检测转染前后细胞ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA的变化，发现转染后的细胞CK1、CK10、CK18、CEA高表达，而ITGB1、CK19低表达。已有研究证实ITGB1、CK19表达水平的高低与细胞克隆形成能力即细胞增殖力成正相关，是表皮干细胞的特征蛋白；CK1、CK10是成熟表皮即高分化的角质形成细胞的特征蛋白[17-18]；而CEA、CK18常被作为汗腺上皮标记物[19]。本实验结果表明，miRNA-203能在体外诱导人表皮干细胞向汗腺上皮细胞及角质形成细胞分化。
同时，本研究发现转染后表皮干细胞P63mRNA及蛋白的表达较转染前显著降低，且与miRNA-203 mRNA的相对表达量成负相关，即miRNA-203与P63两者呈现相互排斥的表达模式，提示在表皮中P63可能是miRNA-203的靶基因。P63基因作为一种转录因子，与细胞周期、 细胞增殖和发育及细胞凋亡的关系密切[20]，在上皮组织尤其是表皮的形态发生中起着独特作用[21]。已有研究证实在胚胎发育阶段，P63能决定外胚层的某些细胞向上皮干细胞方向分化，且是最早启动外胚层层化的分化标志物和外胚层感应复层化指令的分子开关。在表皮成熟阶段，P63通过促进细胞周期中的G1/S期转化，起着维持表皮及其他复层上皮组织中干细胞增殖潜能的作用[22]。而P63表达下调是表皮干细胞进行分化的必要条件[23]。miRBase数据库显示成熟的miRNA-203基因序列为5’-GUGAAAUGUUUAGGACCACUA-G-3’，而P63的mRNA3’非翻译区基因序列为5’-GAGAAUGAGUCCUUGAUUUCAAA-3’，生物学信息表明，miRNA-203基因序列与P63的mRNA3’非翻译区匹配，P63基因可能是miRNA-203的靶基因，miRNA-203通过P63的3’非翻译区靶位点介导直接参与调控P63。因此，结合本实验结果，提示miRNA-203诱导表皮干细胞向汗腺细胞分化的一个重要机制可能是其通过转录后水平抑制靶基因P63的表达，限制表皮干细胞增殖潜能，从而促进表皮干细胞分化为汗腺细胞。
综上述，本研究利用miRNA-203诱导表皮干细胞表型转化尤其是向汗腺上皮细胞分化，为构建具有生理功能的人工皮肤提供了新的思路和重要的实验基础。若能在体内通过上调miRNA-203的表达优化创面表皮及附属器的形成，对实现创面从解剖修复到功能修复具有重要意义。但如何成功构建出功能性组织工程皮肤，其中涉及的机制及信号通路等还有待进一步研究。
严重烧伤、创伤常造成皮肤组织广泛缺损，创面修复后，因汗腺缺失或其分泌管道被瘢痕组织堵隔而丧失了分泌汗液的功能，导致患者体温调节功能障碍。如何修复汗腺等附属器以实现皮肤的功能重建，是目前医学研究热点[1]。近期研究表明miRNA与皮肤再生修复相关[2-3]，作为表皮及毛囊特有的miRNA-203伴随着表皮分化的开始而表达，即在富含表皮干细胞的表皮基底层低表达，而在富含角质形成细胞的基底上层高表达，提示其可能在皮肤发育中起着增殖和分化的开关作用[4-5]。Nissan等[6]发现miRNA-203能调控胚胎干细胞向角朊细胞的早期定向分化。miRNA-203能否诱导人表皮干细胞向汗腺细胞分化，目前尚不清楚。本研究设计合成了miRNA-203模拟物，通过脂质体转染将其导入人表皮干细胞，探索体外诱导表皮干细胞向汗腺细胞分化的可能性，为实现创面的功能愈合提供新思路与理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
0.25 %胰蛋白酶-EDTA、EGF、角质细胞无血清培养基（keratinocyte serum free medium，K-SFM）、FBS、Ⅳ型胶原、Opti-MEM培养基（GIBCO公司，美国）；兔抗人β1整合素（integrin β1，ITGB1）、角蛋白1（cytokeratin 1，CK1）、CK10、CK19、CK18、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、P63（Abgent公司，美国）；辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔二步法免疫组织化学检测试剂盒（PV-9000）、山羊抗兔IgG-HRP二抗、兔抗人β肌动蛋白一抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；FAM标记的人miRNA-203模拟物及FAM标记的对照miRNA（上海吉玛制药技术有限公司）；Trizol、脂质体Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen公司，美国）；mirVanaTM miRNA纯化试剂盒（Ambion公司，美国）；互补DNA反转录试剂盒、SYBR Green荧光定量试剂盒（TaKaRa公司，日本）；Super-Bradford 蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）。
CK40型倒置相差显微镜、CKX41型倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；CO2培养箱（Thermo公司，德国）；FACSCalibur 流式细胞仪（BD 公司，美国）；分光光度计（NanoDrop公司，美国）；7900 HT型荧光定量RT-PCR仪（ABI公司，美国）；Image Pro-plus 6.0图像分析软件（Media Cyberneties公司，美国）；电泳仪、电转仪（北京六一仪器厂）。
1.2 人表皮干细胞的分离培养及鉴定
取2013年9月－11月在南昌大学第一附属医院泌尿外科行包皮环切术的5例患者正常包皮组织标本，年龄18～40岁；患者均知情同意，研究方案经医院医学伦理委员会审核批准。采用0.25%胰蛋白酶-EDTA联合消化法分离表皮与真皮，应用Ⅳ型胶原快速黏附法[7]筛选获得人表皮干细胞，在由EGF、K-SFM组成的培养基中进行体外培养，之后定期换液，倒置相差显微镜观察细胞分离即刻及培养3 d的生物学特性。细胞生长至90%融合时进行消化传代，取第2代细胞进行后续实验。采用HRP标记的山羊抗兔二步法免疫组织化学检测试剂盒行CK19、ITGB1、CK1、CK10、CK18、CEA免疫细胞化学染色鉴定。
1.3 细胞转染及相关检测
1.3.1 实验分组
取第2代人表皮干细胞，按说明书运用脂质体 Lipofectamine 2000转染试剂进行转染。根据人源miRNA-203序列，设计并合成其双链模拟物，实验组和对照组分别转染FAM标记的人miRNA-203模拟物（n=5）及FAM标记的对照miRNA（n=5）。转染6 h后倒置荧光显微镜下观察转染情况，FACSCalibur 流式细胞仪检测转染效率，重复3次。转染72 h后倒置相差显微镜观察两组细胞形态变化。
1.3.2 转染后免疫细胞化学染色观察
两组细胞转染后，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱孵育72 h，以PV-9000二步法行ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA免疫细胞化学染色观察，按试剂盒说明书进行操作。
1.3.3 实时荧光定量RT-PCR检测
取转染前及实验组、对照组转染72 h后的细胞，采用Trizol法分别提取总RNA，用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检总RNA的质量。使用 mirVanaTM miRNA纯化试剂盒对总RNA进行纯化，纯化后重新定量。① miRNA-203的mRNA表达检测：每个样本各取2 μg总RNA，采用互补DNA反转录试剂盒合成总互补DNA，反转录产物采用SYBR Green荧光定量试剂盒和荧光定量RT-PCR仪行PCR。人miRNA-203及内参照U6的反转录引物和PCR引物均购自上海吉玛制药技术有限公司，引物序列见表 1。PCR反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火l min，40个循环。每个样本重复PCR反应3 次。采用Δ 循环阈值（Ct）法处理结果，计算相对表达量2-ΔΔCt。② P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA的mRNA表达检测：每个样本各取2 μg总RNA，以OligdT为反转录引物，应用互补DNA反转录试剂盒合成总互补DNA。采用引物设计软件Primer Premier 5.0设计P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA及内参照β-actin的PCR引物，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表 1。反转录产物采用SYBR Green荧光定量试剂盒和荧光定量RT-PCR仪行PCR。每个样本重复PCR反应3次。PCR反应条件及表达量计算方法同① 。
表1
实时荧光定量RT-PCR引物序列及产物大小
Table1.
Real-time fluorescence quantitative RT-PCR primer sequences and product sizes
1.3.4 Western
blot检测提取转染前及实验组和对照组转染72 h后细胞的总蛋白，用二辛丁酸法进行蛋白定量，100℃变性10 min，各取50 μg行PAGE凝胶电泳，转移至硝酸纤维滤膜上，封闭。分别加入兔抗人P63一抗、兔抗人ITGB1一抗、兔抗人CK19一抗、兔抗人CK1一抗、兔抗人CK10一抗、兔抗人CK18一抗、兔抗人CEA一抗、兔抗人β-actin一抗（稀释比均为1∶200），4℃孵育过夜；TTBS液冲洗后加入羊抗兔IgG-HRP二抗（稀释比为1∶5 000），室温孵育2 h；TTBS液冲洗后曝片，胶片用扫描仪扫描成像，Image Pro-plus6.0图像分析软件进行灰度分析，结果以目的蛋白与β-actin的灰度值比值表示。实验重复3次。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；对miRNA-203的mRNA表达与P63的mRNA和蛋白表达分别行Pearson相关分析；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 人表皮干细胞形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜观察示，快速黏附于Ⅳ型胶原的细胞群细胞呈圆形，分散较均匀，细胞体积较小，细胞核大，核质比大，折光性较强（图 1 a）；孵育3 d后，细胞贴壁牢固并形成明显克隆，符合表皮干细胞特征（图 1 b）。免疫细胞化学染色示，CK19、ITGB1呈棕黄色阳性表达，CK1、CK10、 CK18、CEA呈阴性表达，符合表皮干细胞特征。见图 2。
图1
人表皮干细胞形态学观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ 细胞分离即刻细胞培养3 d 图 2 人表皮干细胞免疫细胞化学染色观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ CK19 ITGB1 CK1 CK10 CK18 CEA 图 3 两组细胞转染6 h后倒置荧光显微镜观察（×100） ⓐ 实验组 ⓑ 对照组 图 4 两组细胞转染6 h后流式细胞仪检测 ⓐ 实验组 ⓑ 对照组 图 5 两组细胞转染72 h后倒置相差显微镜观察形态变化（×100） ⓐ 实验组 ⓑ 对照组
Figure1.
Morphological observation of human epidermal stem cell (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ Cells at immediate after separated Cells cultured for 3 days Fig. 2 Immunohistochemistry staining of human epidermal stem cells (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ CK19 ITGB1 CK1 CK10 CK18 CEA Fig. 3 Inverted fluorescence microscope observation of cells transfected for 6 hours in 2 groups (×100) ⓐ Experimental group ⓑ Control group Fig. 4 Flow cytometry detection of cells transfected for 6 hours in 2 groups ⓐ Experimental group ⓑ Control group Fig. 5 The morphological changes of cells transfected for 72 hours observed by inverted phase contrast microscope (×100) ⓐ Experimental group ⓑ Control group
2.2 细胞转染及转染效率
倒置荧光显微镜观察示，实验组和对照组均可见多数细胞胞质内有荧光显示（图 3）；流式细胞仪检测示，实验组和对照组转染后荧光细胞比例分别为41.58%±0.54%和40.84%±0.67%，两组比较差异无统计学意义（t=1.937，P=0.089），见图 4。
倒置相差显微镜观察示，实验组细胞转染72 h后，细胞大小不一致，分散不均匀，细胞核小，核质比小，且无明显克隆形成，符合角质形成细胞特征（图 5 a）；而对照组细胞转染72 h后仍有克隆形成，符合表皮干细胞特征，转染前后无显著差异（图 5 b）。
2.3 转染后免疫细胞化学染色观察
实验组细胞转染72 h后免疫细胞化学染色示CK1、CK10、CK18、CEA呈棕黄色阳性表达，CK19、ITGB1呈阴性表达，符合角质形成细胞及汗腺细胞特征（图 6）；而对照组与转染前比较无变化。
图6
实验组细胞转染72 h后免疫细胞化学染色观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ CK1 ⓑ CK10 ⓒ CK18 ⓓ CEA ⓔ CK19 ⓕ ITB1 图 7 Western blot法检测各组细胞各蛋白表达 Mr：相对分子质量 1：实验组 2：转染前 3：对照组 ⓐ P63 ⓑ CK19 ⓒ ITGB1 ⓓ CK1 ⓔ CK10 ⓕ CK18 ⓖ CEA
Figure6.
Immunocytochemical staining of cells in experimental group transfected for 72 hours (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ CK1 ⓑ CK10 ⓒ CK18 ⓓ CEA ⓔ CK19 ⓕ ITB1 Fig. 7 The protein expression of cells by Western blot analysis Mr: Relative molecular mass 1: Experimental group 2: Before transfection 3: Control group ⓐ P63 ⓑ CK19 ⓒ ITGB1 ⓓ CK1 ⓔ CK10 ⓕ CK18 ⓖ CEA
2.4 实时荧光定量RT-PCR检测
实验组细胞转染72 h后，miRNA-203及CK1、CK10、CK18、CEA mRNA的相对表达量均高于转染前及对照组，而P63、CK19、ITGB1 mRNA的相对表达量均低于转染前和对照组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。对照组与转染前比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
实时荧光定量RT-PCR检测各组各基因表达（n=5，2.5 Western blot检测
实验组细胞转染72 h后，CK1、CK10、CK18、CEA蛋白相对表达量均高于转染前及对照组，而P63、CK19、ITGB1蛋白相对表达量均低于转染前和对照组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。对照组与转染前比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 3、图 7。
表3
Western blot检测各组各蛋白表达（n=5，2.6 miRNA-203和P63表达的相关性分析
转染前后miRNA-203 mRNA表达量与P63的mRNA和蛋白相对表达量均成负相关，转染前相关系数分别为-0.91（t=3.862，P=0.042）及-0.96（t=5.971，P=0.009）；转染后相关系数分别为-0.92（t=4.283，P=0.031）及-0.95（t=5.842，P=0.011）。
3 讨论
目前对大面积烧伤患者皮肤缺损的修复主要为创面修复，对皮肤功能重建问题仍未解决[8]。患者存活后常由于汗腺缺失，体温调节功能严重受损，生活质量显著降低[9]。因此，如何实现皮肤附件的功能修复与重建是烧伤创面修复与组织再生研究的热点及难点[10]。干细胞技术的建立和发展为解决这一难题提供了新的思路，通过干细胞移植诱导再生汗腺是其中的重要方法之一[11-12]。胚胎学上，表皮干细胞与汗腺在发育学上有共同的起源，均起源于外胚层上皮，外胚层上皮细胞通过分裂增殖并内陷在表皮嵴形成上皮细胞索，细胞索的近端发育成导管，末端发育为分泌部，构成汗腺[13]。因此有可能 利用 表皮 干细胞向汗腺细胞定向分化再生汗腺。
miRNA-203是长19～22 nt非编码单链RNA，能与靶mRNA3’UTR区结合在转录后水平抑制蛋白质的合成，达到负性调控基因表达的目的[14]。miRNA-203是首个发现在表皮及毛囊表达最丰富的miRNA。若miRNA-203 生物合成所需的Dicer酶或DGCR8基因被敲除，以致miRNA-203合成缺失，可导致皮肤屏障功能缺陷、毛囊发育不良、表皮基底层细胞过度增殖[15-16]，表明miRNA-203对皮肤发育和功能维持具有重要作用。本研究根据人源miRNA-203序列，设计并合成其双链模拟物，利用脂质体转染将miRNA-203模拟物分子导入人离体表皮干细胞中，通过倒置荧光显微镜下观察、流式细胞仪检测及转染前后miRNA-203的实时荧光定量RT-PCR测定均表明转染成功。对转染前后的细胞于倒置相差显微镜下观察形态变化，通过免疫细胞化学染色、实时荧光定量RT-PCR及Western blot技术检测转染前后细胞ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA的变化，发现转染后的细胞CK1、CK10、CK18、CEA高表达，而ITGB1、CK19低表达。已有研究证实ITGB1、CK19表达水平的高低与细胞克隆形成能力即细胞增殖力成正相关，是表皮干细胞的特征蛋白；CK1、CK10是成熟表皮即高分化的角质形成细胞的特征蛋白[17-18]；而CEA、CK18常被作为汗腺上皮标记物[19]。本实验结果表明，miRNA-203能在体外诱导人表皮干细胞向汗腺上皮细胞及角质形成细胞分化。
同时，本研究发现转染后表皮干细胞P63mRNA及蛋白的表达较转染前显著降低，且与miRNA-203 mRNA的相对表达量成负相关，即miRNA-203与P63两者呈现相互排斥的表达模式，提示在表皮中P63可能是miRNA-203的靶基因。P63基因作为一种转录因子，与细胞周期、 细胞增殖和发育及细胞凋亡的关系密切[20]，在上皮组织尤其是表皮的形态发生中起着独特作用[21]。已有研究证实在胚胎发育阶段，P63能决定外胚层的某些细胞向上皮干细胞方向分化，且是最早启动外胚层层化的分化标志物和外胚层感应复层化指令的分子开关。在表皮成熟阶段，P63通过促进细胞周期中的G1/S期转化，起着维持表皮及其他复层上皮组织中干细胞增殖潜能的作用[22]。而P63表达下调是表皮干细胞进行分化的必要条件[23]。miRBase数据库显示成熟的miRNA-203基因序列为5’-GUGAAAUGUUUAGGACCACUA-G-3’，而P63的mRNA3’非翻译区基因序列为5’-GAGAAUGAGUCCUUGAUUUCAAA-3’，生物学信息表明，miRNA-203基因序列与P63的mRNA3’非翻译区匹配，P63基因可能是miRNA-203的靶基因，miRNA-203通过P63的3’非翻译区靶位点介导直接参与调控P63。因此，结合本实验结果，提示miRNA-203诱导表皮干细胞向汗腺细胞分化的一个重要机制可能是其通过转录后水平抑制靶基因P63的表达，限制表皮干细胞增殖潜能，从而促进表皮干细胞分化为汗腺细胞。
综上述，本研究利用miRNA-203诱导表皮干细胞表型转化尤其是向汗腺上皮细胞分化，为构建具有生理功能的人工皮肤提供了新的思路和重要的实验基础。若能在体内通过上调miRNA-203的表达优化创面表皮及附属器的形成，对实现创面从解剖修复到功能修复具有重要意义。但如何成功构建出功能性组织工程皮肤，其中涉及的机制及信号通路等还有待进一步研究。
