目的 觀察肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）修飾的BMSCs 對大鼠同種異體肝移植后免疫排斥反應的影響，探討其誘導免疫耐受的機制。 方法 3 ～ 4 周齡清潔級雄性SD 大鼠8 只，體重75 ～ 85 g，用于分離培養(yǎng)BMSCs；成年清潔級雄性SD 大鼠64 只，體重200 ～ 250 g，作為供體；成年清潔級雄性Wistar 大鼠64 只，體重230 ～ 280 g，作為受體。建立穩(wěn)定的同種異體肝移植動物模型并隨機分為4 組（n=16），A、B、C、D 組分別立即經(jīng)門靜脈注入1 mL 生理鹽水、1 mL 細胞密度為2 × 106 個/mL 的BMSCs、1 mL 細胞密度為2 × 106 個/mL 的BMSCs/ 綠色熒光蛋白、1 mL 細胞密度為2 × 106 個/mL 的BMSCs/hHGF。術后作實驗動物生存曲線分析；術后7 d 檢測實驗動物肝功能，并取肝臟組織行病理組織學觀察，RT-PCR 檢測肝組織內(nèi)hHGF mRNA 表達，ELISA 法檢測血清中hHGF、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 細胞因子的表達，TUNEL 法檢測肝組織內(nèi)細胞凋亡情況，免疫組織化學方法檢測增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在肝組織內(nèi)的表達。 結果 D 組生存時間顯著高于A、B、C 組（P lt; 0.01）；B、C 組生存時間明顯高于A 組（P lt; 0.01），但B、C 組間生存時間差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。RT-PCR 示檢測D 組肝組織內(nèi)有hHGF mRNA 表達，ELISA 檢測血清中hHGF 水平達（6.2 ± 1.0）ng/mL。相比B、C 組，D 組療效更顯著，肝功能明顯改善，病理學無急性排斥反應或僅為輕度；IL-2、IFN-γ 水平降低，IL-4、IL-10 水平升高，細胞凋亡明顯減少，PCNA 表達顯著升高，除IL-4 水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）外，其余指標比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結論 通過門靜脈輸注BMSCs/hHGF 至大鼠同種異體肝移植模型能成功誘導免疫耐受。與單純應用BMSCs 相比，BMSCs/hHGF在移植肝局部形成高濃度hHGF 免疫抑制微環(huán)境，能更顯著抑制急性排斥反應，延長移植受體存活時間。BMSCs/hHGF的免疫抑制作用與誘導Th1 細胞向Th2 細胞偏移、減少肝細胞凋亡、促進肝細胞增殖有關。
目的 構建攜帶人肝細胞生長因子（human hepatocyte growth factor，hHGF）基因的慢病毒，感染大鼠BMSCs，建立穩(wěn)定表達hHGF 的BMSCs/hHGF 細胞。 方法 從含hHGF 基因的質粒pcDNA-hHGF 中，用PCR 法獲取hHGF 全長基因，與慢病毒載體pGC-E1 分別進行Age Ⅰ酶切，產(chǎn)物定向連接，轉化后行PCR 鑒定和測序，構建hHGF 慢病毒表達質粒。脂質體Lipofectamine 2000 介導慢病毒載體三質粒pGC-E1-hHGF、pHelper 1.0、pHelper 2.0 共轉染293T細胞。收集病毒超濾離心濃縮，實時定量PCR 測定滴度。將hHGF 慢病毒感染BMSCs，熒光顯微鏡觀察熒光表達，確定最佳感染復數(shù)（multiplicities of infection，MOI）值，以最佳MOI 值感染細胞，流式細胞儀檢測感染效率，ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清hHGF 分泌水平，RT-PCR 檢測hHGF 基因的表達。 結果 實驗成功構建攜帶hHGF 基因的慢病毒，滴度達1 × 108 TU/mL。hHGF 慢病毒高效率感染BMSCs，最佳MOI 值為10。流式細胞儀檢測感染效率達98%，且在感染后28 d BMSCs 仍穩(wěn)定表達強烈的綠色熒光。細胞培養(yǎng)上清可檢測到hHGF 因子，術后5 d 達高峰，達40.5 ng/mL，這種高水平分泌可持續(xù)至感染后28 d。RT-PCR 檢測出hHGF 基因的表達。 結論 通過慢病毒載體將hHGF 基因穩(wěn)定感染至BMSCs 細胞，可獲得長期穩(wěn)定的表達，并持續(xù)分泌hHGF 因子。
目的 探討建立穩(wěn)定大鼠原位肝移植模型的手術操作技巧。 方法 成年雄性SD 大鼠200 只，體重200 ～ 250 g；成年雄性Wistar 大鼠60 只，體重230 ～ 280 g，供體體重小于受體約30 g。其中SD 大鼠為供、受體的同基因肝移植70 只（SD-SD 組），SD、Wistar 分別為供、受體的同種異體肝移植60 只（SD-Wistar 組）。采用改良二袖套法行大鼠原位肝移植，充分暴露第一肝門，不翻動肝臟先行門靜脈灌注；在體一步法離斷肝上下腔靜脈，不帶膈肌環(huán)；吻合肝上下腔靜脈采用單線連續(xù)縫合；雙線牽引法安裝門靜脈袖套。術后充分補液維持大鼠血液動力學穩(wěn)定。 結果 供體手術時間（38.2 ± 2.5）min，受體手術時間（45.6 ± 3.5）min，無肝期（15.1 ± 2.2）min，手術成功率93%，1 周存活率92%，與傳統(tǒng)二袖套法比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。SD-SD 組手術成功64 只，受體存活時間2 ～ 9 個月，平均145 d；術后約3 d 肝功能恢復正常，肝組織病理無明顯變化。SD-Wistar 組手術成功57 只，受體存活時間8 ～ 20 d，平均10.5 d；大鼠于術后3 ～ 5 d 出現(xiàn)急性排斥反應，未經(jīng)處理后均死亡。 結論 改良式肝移植操作簡便，成功率高，可為大鼠原位肝移植實驗提供穩(wěn)定可靠的動物模型。