目的 構(gòu)建攜帶人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（human hepatocyte growth factor，hHGF）基因的慢病毒，感染大鼠BMSCs，建立穩(wěn)定表達(dá)hHGF 的BMSCs/hHGF 細(xì)胞。 方法 從含hHGF 基因的質(zhì)粒pcDNA-hHGF 中，用PCR 法獲取hHGF 全長(zhǎng)基因，與慢病毒載體pGC-E1 分別進(jìn)行Age Ⅰ酶切，產(chǎn)物定向連接，轉(zhuǎn)化后行PCR 鑒定和測(cè)序，構(gòu)建hHGF 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 介導(dǎo)慢病毒載體三質(zhì)粒pGC-E1-hHGF、pHelper 1.0、pHelper 2.0 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。收集病毒超濾離心濃縮，實(shí)時(shí)定量PCR 測(cè)定滴度。將hHGF 慢病毒感染BMSCs，熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)，確定最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicities of infection，MOI）值，以最佳MOI 值感染細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染效率，ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清hHGF 分泌水平，RT-PCR 檢測(cè)hHGF 基因的表達(dá)。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建攜帶hHGF 基因的慢病毒，滴度達(dá)1 × 108 TU/mL。hHGF 慢病毒高效率感染BMSCs，最佳MOI 值為10。流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染效率達(dá)98%，且在感染后28 d BMSCs 仍穩(wěn)定表達(dá)強(qiáng)烈的綠色熒光。細(xì)胞培養(yǎng)上清可檢測(cè)到hHGF 因子，術(shù)后5 d 達(dá)高峰，達(dá)40.5 ng/mL，這種高水平分泌可持續(xù)至感染后28 d。RT-PCR 檢測(cè)出hHGF 基因的表達(dá)。 結(jié)論 通過(guò)慢病毒載體將hHGF 基因穩(wěn)定感染至BMSCs 細(xì)胞，可獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)，并持續(xù)分泌hHGF 因子。

引用本文： 朱金海,陳燕凌. 慢病毒介導(dǎo)人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因感染BMSCs 的實(shí)驗(yàn)研究. 中國(guó)修復(fù)重建外科雜志, 2010, 24(8): 972-976. doi: 復(fù)制