目的 觀察癌胚抗原（CEA）陽性靶向性淋巴細(xì)胞對胃癌細(xì)胞體內(nèi)及體外靶向性治療作用。 方法 從健康人外周血中分離單個核細(xì)胞（PBMC），通過脂質(zhì)體lipofectamine 2000 介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染將重組真核表達(dá)載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染導(dǎo)入 PBMC，以獲取 CEA 陽性靶向性淋巴細(xì)胞（以下簡稱靶淋巴細(xì)胞）；將不含 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 融合基因片段的 pcDNA3.0 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入 PBMC，獲取的淋巴細(xì)胞簡稱為空載體淋巴細(xì)胞。將上述兩種淋巴細(xì)胞分別與 CEA 陽性 KATOⅢ胃癌細(xì)胞和 CEA 陰性 BGC-823 胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察不同靶淋巴細(xì)胞與胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)（24 h 或 36 h ）后的識別情況或其對胃癌細(xì)胞凋亡的影響。并將上述已獲取的兩種淋巴細(xì)胞分別通過尾靜脈注入荷 CEA 陽性 KATOⅢ胃癌細(xì)胞裸鼠和荷 CEA 陰性 BGC-823 胃癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)，以觀察其對荷胃癌裸鼠腫瘤生長情況的影響。 結(jié)果 ① 靶淋巴細(xì)胞與胃癌細(xì)胞共培養(yǎng) 24 h 時，靶淋巴細(xì)胞對 KATOⅢ胃癌細(xì)胞的識別率為 72.3%，淋巴細(xì)胞對 KATOⅢ胃癌細(xì)胞的識別能力較強；其對 BGC-823 胃癌細(xì)胞識別率為 7.8%，其對 BGC-823 胃癌細(xì)胞識別能力較弱。② 當(dāng)靶淋巴細(xì)胞、空載體淋巴細(xì)胞分別與 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌細(xì)胞分別共培養(yǎng) 36 h 時，靶淋巴細(xì)胞+KATOⅢ胃癌細(xì)胞組的凋亡率明顯高于空載體淋巴細(xì)胞+KATOⅢ胃癌細(xì)胞組（P=0.032），而靶淋巴細(xì)胞+BGC-823 胃癌細(xì)胞組和空載體淋巴細(xì)胞+BGC-823 胃癌細(xì)胞組的凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.118）。③ 在觀察 40 d 內(nèi)，靶淋巴細(xì)胞+KATOⅢ胃癌細(xì)胞組的腫瘤體積明顯小于空載體淋巴細(xì)胞+KATOⅢ胃癌細(xì)胞組（F=5.010，P<0.01）和空白對照組（F=7.560，P<0.01）；靶淋巴細(xì)胞+BGC-823 胃癌細(xì)胞組與空載體淋巴細(xì)胞+BGC-823 胃癌細(xì)胞組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.210，P>0.05）。靶淋巴細(xì)胞+KATOⅢ胃癌細(xì)胞組的腫瘤體積明顯小于靶淋巴細(xì)胞+BGC-823 胃癌細(xì)胞組（F=4.982，P<0.01）。 結(jié)論 CEA 陽性靶向性淋巴細(xì)胞可特異性促進(jìn) CEA 陽性胃癌細(xì)胞凋亡，抑制荷 CEA 陽性胃癌細(xì)胞裸鼠腫瘤的生長。
目的 制備腫瘤相關(guān)糖蛋白-72抗原（TAG-72）嵌合錨定T細(xì)胞，通過體外實驗檢測其對乳腺癌細(xì)胞的抑癌活性。方法 分離健康人外周血單個核細(xì)胞（PBMC），采用脂質(zhì)體lipofectamineTM 2000介導(dǎo)的細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染方法，將已制備的重組真核表達(dá)載體即抗TAG-72-scFv-CD3ζ-pcDNA 3.0導(dǎo)入PBMC，以獲得TAG-72嵌合錨定T細(xì)胞，以此為轉(zhuǎn)染組；用轉(zhuǎn)染空載體pcDNA 3.0的PBMC作為對照組。將轉(zhuǎn)染組嵌合錨定T細(xì)胞和對照組PBMC細(xì)胞分別與乳腺癌細(xì)胞系MCF-7及Bcap37共培養(yǎng)，觀察兩者對乳腺癌細(xì)胞G1期的阻滯率。結(jié)果 轉(zhuǎn)染組對MCF-7細(xì)胞系的G1期阻滯率為（82.3±6.9）%，對照組為（43.4±3.9）%，2組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染組對Bcap37細(xì)胞系的G1期阻滯率為（51.3±4.7）%，對照組為（45.6±2.5）%，2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 TAG-72嵌合錨定T細(xì)胞可特異性地抑制TAG-72＋乳腺癌細(xì)胞的增殖，此將為乳腺癌的臨床診治提供一種有希望的途徑。
為探討抗凋亡基因bcl-2與膽囊腫瘤發(fā)生、分化及臨床預(yù)后的關(guān)系，采用免疫組織化學(xué)方法對45例原發(fā)性膽囊癌和39例膽囊腺瘤抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示：bcl-2在原發(fā)性膽囊癌和膽囊腺瘤的表達(dá)率分別為71.1%和87.2%，兩者比較無顯著性差異(Ｐ＞0.05)；bcl-2在原發(fā)性膽囊癌高、中、低分化型的表達(dá)率分別為82.3%、82.4%和50.0%，彼此間存在顯著性差異(Ｐ＜0.01)；bcl-2表達(dá)在原發(fā)性膽囊癌臨床Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ期的陽性率分別為81.3%、65.3%，彼此間無顯著性差異，表明bcl-2表達(dá)可能與原發(fā)性膽囊癌臨床分期無直接關(guān)系。
目的探討腫瘤相關(guān)糖蛋白72(TAG72)靶向性嵌合錨定T淋巴細(xì)胞的制備方法，并檢測它對TAG72陽性肝癌細(xì)胞增殖的阻滯效應(yīng)。方法分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，然后用免疫磁珠法分離得到CD8+ T淋巴細(xì)胞。將重組真核表達(dá)載體anti-TAG72-scFv-CD28-pcDNA3.0采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)，以制備TAG72靶向性的嵌合錨定T淋巴細(xì)胞; 將嵌合錨定T淋巴細(xì)胞與TAG72陽性肝癌細(xì)胞SMMC7721共培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞儀檢測肝癌細(xì)胞的周期變化，分析嵌合錨定T淋巴細(xì)胞對肝癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。結(jié)果TAG72靶向性嵌合錨定T淋巴細(xì)胞可識別肝癌細(xì)胞SMMC7721； 用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，嵌合錨定T淋巴細(xì)胞可引起肝癌細(xì)胞SMMC7721的增殖阻滯。結(jié)論TAG72靶向性嵌合錨定T淋巴細(xì)胞可特異性識別TAG72陽性肝癌細(xì)胞SMMC7721并引起其增殖阻滯。
目的 構(gòu)建含有由抗腫瘤相關(guān)糖蛋白72(anti-TAG72)單鏈抗體片段(single chain variable fragment,scFv)及CD28胞內(nèi)區(qū)及跨膜區(qū)的融合基因anti-TAG72 scFv-CD28的重組綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28，并轉(zhuǎn)染獲得嵌合錨定T淋巴細(xì)胞。方法 將anti-TAG72單鏈抗體及CD28胞內(nèi)區(qū)及跨膜區(qū)基因的嵌合錨定融合分子克隆入綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-C3，獲得pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28表達(dá)載體。用卡那霉素篩選陽性克隆，經(jīng)酶切和測序鑒定。將上述重組質(zhì)粒pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28以脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染外周血單核細(xì)胞(PBMC)，以獲得嵌合錨定T淋巴細(xì)胞，用熒光顯微鏡檢測嵌合分子anti-TAG72 scFv-CD28在PBMC中的表達(dá)，并檢驗嵌合錨定融合分子anti-TAG72 scFv-CD28的表達(dá)。結(jié)果 重組綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28中anti-TAG72 scFv-CD28片段為1 002 bp，與已知的序列相符。酶切、測序結(jié)果表明，嵌合錨定融合分子基因片段anti-TAG72 scFv-CD28被正確插入pEGFP-C3載體； 轉(zhuǎn)染后anti-TAG72 scFv-CD28片段及綠色熒光物質(zhì)表達(dá)于嵌合錨定T淋巴細(xì)胞胞膜表面及胞漿中，為綠色熒光顯色。結(jié)論 完成了綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28的構(gòu)建，并成功在PBMC瞬時表達(dá)。
目的 探討抗腫瘤相關(guān)糖蛋白-72(TAG-72)單鏈抗體的原核表達(dá)及與4種肝癌細(xì)胞系和肝癌組織的特異性親和力。方法 將抗TAG-72單鏈抗體的cDNA片段插入噬菌粒載體pCANTAB5E, 獲得噬菌粒載體TAG-72-scFv-pCANTAB5E。將后者轉(zhuǎn)化入E.coli HB2151, 經(jīng)β, D異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)獲得抗TAG-72單鏈抗體蛋白。采用細(xì)胞培養(yǎng)及免疫細(xì)胞/組織化學(xué)方法, 檢測4種肝癌細(xì)胞系及石蠟包埋的肝癌組織中TAG-72抗原的表達(dá)。結(jié)果 SDS-PAGE及Western blot法證實, 抗TAG-72單鏈抗體蛋白分子得以正確表達(dá)。抗TAG-72單鏈抗體可與肝癌細(xì)胞系SMMC7721、HepG2和HHCC結(jié)合, 表明這3種細(xì)胞表達(dá)了特異性腫瘤抗原; 抗TAG-72單鏈抗體不能結(jié)合BEL7402細(xì)胞。40例肝癌組織中TAG-72抗原表達(dá)陽性率Ⅰ期、Ⅱ~Ⅲ期分別為23.08%(3/13)和62.96%(17/27),在正常肝組織標(biāo)本中無TAG-72抗原表達(dá),TAG-72抗原在正常肝組織及肝癌組織中表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)論 TAG-72抗原在肝癌細(xì)胞或肝癌組織中有特異性表達(dá)，有可能成為判斷肝癌的標(biāo)志物。
目的 構(gòu)建受甲胎蛋白（AFP）增強子和白蛋白（Alb）啟動子調(diào)控的含有血管抑制素（angiostatin）K5序列的真核表達(dá)載體，通過基因轉(zhuǎn)染，將angiostatin K5基因?qū)敫伟┘?xì)胞，觀察angiostatin K5的表達(dá)。方法 用RTPCR法從正常人真核細(xì)胞擴(kuò)增出angiostatin K5基因，將AFP增強子和Alb啟動子調(diào)控序列定向克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，并將angiostatin K5 cDNA置于上述調(diào)控序列之下，從而構(gòu)建得到重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1AFABangiostatin K5His。利用細(xì)胞培養(yǎng)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將angiostatin K5基因?qū)敫伟┘?xì)胞。利用SDSPAGE和Western blot法檢測肝癌細(xì)胞中angiostatin K5的表達(dá)。結(jié)果 通過酶切鑒定及DNA測序證實目的真核表達(dá)載體pcDNA3.1AFABangiostatin K5His與預(yù)期的結(jié)果相同。SDSPAGE及Western blot分析證明，angiostatin K5在肝癌細(xì)胞中得以表達(dá)。結(jié)論 構(gòu)建的肝癌特異性重組真核表達(dá)載體可增加對AFP陽性肝癌細(xì)胞的治療的特異性，并用于實現(xiàn)對肝癌的特異性血管抑制作用。