引用本文： 徐宏勇, 徐立. 一种特异性靶向性淋巴细胞对荷瘤裸鼠的治疗观察. 中国普外基础与临床杂志, 2018, 25(3): 283-288. doi: 10.7507/1007-9424.201709005 复制
癌胚抗原（CEA）表达于多种肿瘤[1]，尤其在消化道恶性肿瘤中明显[2-3]，基于其生物学特性，将其作为肿瘤标志物可广泛应用于对肿瘤的早期检测，可为临床肿瘤诊断提供依据并判断预后[4]；抗 CEA 单克隆抗体也用于对消化道肿瘤的诊治方面。基于 T 细胞活化的双信号学说，T 细胞的活化需要由抗原提呈细胞提供的两个信号[5]，一个信号是主要组织相容性复合体抗原，由肿瘤细胞抗原提供的抗原特异性刺激信号；另一个信号由反应 T 细胞共刺激分子提供，常包括 CD3ζ 及 CD28 和 B7-1 分子。我们将共刺激信号对 T 细胞的活化作用和抗 CEA 单链抗体对肿瘤的识别功能结合起来，构建了真核表达载体[6]，并制备出了具有 CEA 阳性靶向性和有活化功能的淋巴细胞。籍此观察对荷 CEA 阳性 KATOⅢ胃癌细胞裸鼠的治疗效应，并探索 CEA 阳性靶向性淋巴细胞治疗胃肠道肿瘤的可能性。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料
① CEA 阳性 KATOⅢ胃癌细胞系及 CEA 阴性 BGC-823 胃癌细胞系，用抗 CEA 的 T84.66 单链抗体（scFv）检测证实（抗 CEA 的 T84.66 scFv 由本项目组经原核表达纯化而制备[7]）。② 健康人外周血样从 10 名健康志愿者抽取。③ BALB/c 裸鼠，4～6 周龄，雄雌不限，体质量 18～20 g，在无特定病原体条件下饲养。④ 脂质体 lipofectamineTM 2000 （LF-2000）为美国 Invitrogen 公司产品；RPMI1640 购自美国 Gibco 公司；膜联蛋白Ⅴ-异硫氢酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）试剂盒为澳大利亚 Bender Medsystems 公司产品。⑤ 白细胞介素（IL）-2 由第四军医大学基因所制备；质粒大量提取盒为上海华舜生物公司产品。⑥ 细胞培养板购自美国 Costar 公司；流式细胞仪为 Counter 公司产品；γ 计数器为安莱公司产品；淋巴细胞分离液购自上海生化制剂一厂。
1.2 方法
1.2.1 重组真核表达载体 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 的构建及扩增
① 重组真核表达载体 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 构建方法详见文献[6]，进行目标基因 anti-CEA-scFv 片段的扩增，并从人白细胞中克隆出 CD3ζ 片段，通过分子生物学方法将 anti-CEA-scFv 及 CD3ζ 片段依次克隆于真核表达载体 pcDNA3.0，从而获得重组真核表达载体 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0。② 重组真核表达载体 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 扩增方法详见文献[6]，将重组真核表达载体转化入 E. coli TG1 细胞，经培养扩增后，抽提质粒载体，用密度分光仪测定 DNA 定量后备用。
1.2.2 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分离与培养
详细步骤按文献[8]的方法进行。无菌抽取健康志愿者的外周血，EDTA 抗凝，Ficoli 密度梯度离心法分离并获得 PBMC。在末次离心后，将获取的 PBMC 重悬于含胎牛血清的 RPMI 1640 培养液，原代培养并计数。用 2 mL RPMI 1640+10% 胎牛血清+IL-2（工作浓度为 500 U/mL）重悬细胞；置于培养瓶中在 37 ℃、5% CO2 孵箱中培养。
1.2.3 CEA 阳性靶向性淋巴细胞的制备
用脂质体介导的细胞转染方法，按照 LF-2000 产品说明书进行操作。首先将 PBMC（2～6）×105个/mL 接种于 12 孔培养板，加入无血清的培养基 1 mL。用 100 μL 无血清的 RPMI 1640 培养液稀释的 4 μL LF-2000，室温孵育 5 min。将拟转染的重组真核表达载体 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 DNA 的淋巴细胞简称为靶淋巴细胞，转染空载体 pcDNA3.0 DNA 的淋巴细胞简称为空载体淋巴细胞。靶淋巴细胞用无血清的 RPMI 1640 培养液稀释 2 μg 重组真核表达载体 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 DNA，与已稀释好的 LF-2000 充分混合，并在室温下孵育 20 min 形成 DNA-LF-2000 混合物；培养板中每孔 PBMC 中加入 200 μL 上述 DNA-LF-2000 混合物，孵育 6 h 后换液以减轻脂质体对淋巴细胞的毒性，以此获得靶淋巴细胞。空载体淋巴细胞用 2 μg pcDNA3.0 DNA 与已稀释好的 LF-2000 充分混合，并在室温下孵育 20 min 形成 DNA-LF-2000 混合物；培养板中每孔 PBMC 中加入 200 μL 上述 DNA-LF-2000 混合物，以此获得空载体淋巴细胞。转染各组原代淋巴细胞原代培养，以待观察对荷瘤小鼠的治疗效果。
1.2.4 不同淋巴细胞与胃癌细胞共培养[8-9 ]
将 KATOⅢ胃癌细胞及 BGC-823 胃癌细胞分别培养于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件，在其对数生长期传代使其贴壁生长。同时将不同淋巴细胞原代收集后计数，调至每份样品 5×105个细胞，将不同淋巴细胞和胃癌细胞靶效比按 4∶1 的比例共培养。① 倒置显微镜观察不同淋巴细胞与胃癌细胞共培养 24 h 后的识别情况。识别率的计数方法同病理学计数方法，取 10 个视野，取平均值作为其结合识别率。② 观察不同淋巴细胞与 KATOⅢ胃癌细胞共培养 24 h 及 48 h 时胃癌细胞的形态学变化。③ 用靶淋巴细胞和空载体淋巴细胞分别与 KATOⅢ 和 BGC-823 胃癌细胞分别共培养 36 h 后离心，弃上清，加入终浓度 2% 的多聚甲醛固定液 500 μL 重悬细胞，通过流式细胞仪检测 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌细胞凋亡信号膜联蛋白Ⅴ的表达，以判断不同淋巴细胞与 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌细胞共培养后对胃癌细胞凋亡的影响。
1.2.5 人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分组
将处于对数生长期的 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌细胞分别用生理盐水制成细胞悬液，工作浓度为 5×106个细胞/100 μL。将上述每种胃癌细胞悬液 100 μL 分别接种于 BALB/c 裸鼠右侧臀部皮下，每次各注射淋巴细胞数量为 5×105个。将建立荷 KATOⅢ胃癌细胞成功的裸鼠分为靶淋巴细胞+KATOⅢ 细胞组、空载体淋巴细胞+KATOⅢ细胞组及只荷 KATOⅢ胃癌细胞裸鼠而不注射淋巴细胞组即空白对照组 3 个亚组；建立荷 BGC-823 胃癌细胞成功的裸鼠分为靶淋巴细胞+BGC-823 细胞组和空载体淋巴细胞+BGC-823 细胞组。每组 8 只荷瘤裸鼠。分别通过尾静脉注射靶淋巴细胞或空载体淋巴细胞于 KATOⅢ瘤裸鼠和 BGC-823 瘤裸鼠。空白对照组 8 只荷 KATOⅢ胃癌细胞裸鼠不注射淋巴细胞。观察各组荷瘤裸鼠的生长情况，1 次/4 d，共观察 40 d；肿瘤生长情况观察，用游标卡尺测量肿瘤结节长径（a）和短径（b），1 次/5 d，计算肿瘤体积，其公式为 V=a×b2×0.5（mm3），根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 10.0 统计软件进行分析，采用单因素方差分析，方差中 2 组间均数比较用最小显著差法（LSD）。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 靶淋巴细胞对胃癌细胞的识别情况
在倒置显微镜高倍镜（×200 倍）下观察，共培养 24 h 时即发现靶淋巴细胞可与 KATOⅢ胃癌细胞紧密结合，连续取 10 个观察视野内靶淋巴细胞对 KATOⅢ胃癌细胞的识别率为 72.3%，提示该淋巴细胞对 KATOⅢ胃癌细胞的识别能力较强；靶淋巴细胞对 BGC-823 胃癌细胞识别率为 7.8%，提示该淋巴细胞对 BGC-823 胃癌细胞的识别能力较弱。
2.2 靶淋巴细胞对胃癌细胞的杀伤作用
2.2.1 形态学观察
在倒置显微镜下可见，靶淋巴细胞与 KATOⅢ胃癌细胞共培养 24 h 时，胃癌细胞增殖缓慢，细胞形态发生变化，局部发生凋亡（图 1a）；共培养 48 h 时，胃癌细胞进一步增殖缓慢，局部凋亡明显，出现坏死（图 1b）；空载体淋巴细胞与 KATOⅢ胃癌细胞共培养 24 h 时，胃癌细胞增殖活跃；48 h 时肿瘤细胞无明显受损害变化。靶淋巴细胞与 BGC-823 胃癌细胞共培养 24 h 或 48 h时，增殖均无明显变化（图 1c）；空载体淋巴细胞与 BGC-823 胃癌细胞共培养 24 h 时增殖未受明显影响（图 1d），48 h 时胃癌细胞增殖活跃，无明显受损形态学改变。
图1
不同淋巴细胞培养不同时相时胃癌细胞的形态学观察结果（倒置显微镜 ×200）
a：靶淋巴细胞与 KATOⅢ胃癌细胞共培养 24 h；b：靶淋巴细胞与 KATOⅢ胃癌细胞共培养 48 h；c：靶淋巴细胞与 BGC-823 胃癌细胞共培养 24 h；d：空载体淋巴细胞与 BGC-823 胃癌细胞共培养 24 h
2.2.2 对细胞凋亡的影响
当靶淋巴细胞和空载体淋巴细胞分别与 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌细胞分别共培养 36 h 时，靶淋巴细胞+KATOⅢ细胞组的凋亡率明显高于空载体淋巴细胞+KATOⅢ细胞组（P=0.032），而靶淋巴细胞+BGC-823 细胞组和空载体淋巴细胞+BGC-823 细胞组的凋亡率比较差异无统计学意义（P=0.118）。见表 1。
表1
不同淋巴细胞对不同胃癌细胞的凋亡影响（
）
2.3 靶淋巴细胞对荷瘤裸鼠肿瘤大小的影响
在观察 40 d 内肿瘤生长曲线见图 2。靶淋巴细胞+KATOⅢ细胞组的肿瘤体积明显小于空载体淋巴细胞+KATOⅢ细胞组（F=5.010，P<0.01）和空白对照组（F=7.560，P<0.01）；空载体淋巴细胞+KATOⅢ细胞组和空白对照组间比较差异无统计学意义（F=1.890，P>0.05）。靶淋巴细胞+BGC-823 细胞组与空载体淋巴细胞+BGC-823 细胞组间比较差异无统计学意义（F=1.210，P>0.05）。靶淋巴细胞+KATOⅢ细胞组的肿瘤体积明显小于靶淋巴细胞+BGC-823 细胞组（F=4.982，P<0.01）。
图2
各组荷瘤裸鼠肿瘤生长曲线
3 讨论
消化道肿瘤是常见且发病率较高的恶性肿瘤，手术治疗及术后放化疗尤为重要，但术后放化疗不良反应大，因而探索不良反应少、对患者身心影响较小的免疫治疗越来越受到重视。近年来的特异性免疫治疗，尤其瞄准消化道肿瘤特异性抗原的靶向免疫治疗显示出潜在的希望和活力。
CEA 在多种消化道肿瘤中呈阳性表达，阳性率高达 90%[10]。目前已经将抗 CEA 单抗 Fab 段的核酸序列克隆化，针对 CEA 的单克隆抗体相继出现，其中抗 CEA 的 T84.66 scFv 的功能已经明确[11-12]，其对 CEA 阳性的肿瘤具有较高的亲和力及特异性[13]，而对正常组织不结合，这对消化道肿瘤尤其胃癌的诊断具有重要意义。目前，将 CEA 作为肿瘤标志物可广泛应用于肿瘤的临床诊治和判断其预后。
十几年来，因在包括 CEA 在内多种肿瘤抗原的研究方面取得长足进展，肿瘤的生物治疗逐渐受到重视[14]。肿瘤基因治疗因此也被认为是当前最具发展潜力的肿瘤治疗手段之一[15-17]。
肿瘤基因治疗相当大的层面要借助于免疫治疗得以实现。因为肿瘤发生、发展往往与机体免疫下调息息相关。
肿瘤免疫治疗包括体液免疫治疗及细胞免疫治疗两方面，通常二者结合更能发挥效用。本研究中将二者有机结合起来。在体液免疫方面，具备识别肿瘤特异性抗原功能的单链抗体，在肿瘤的识别中表现出明显的优势[18]，将其整合于淋巴细胞上，就会赋予淋巴细胞以识别肿瘤细胞的功能。在细胞免疫方面，促进 T 淋巴细胞活化就更能发挥其对肿瘤细胞的细胞毒作用；T 细胞活化的共刺激信号的功能一直被重视[19-20]，合理上调其活化功能，便于对免疫细胞的活化，这对临床免疫非常关键[21]。本研究中引入 T 细胞活化的共刺激信号 CD3ζ 分子及抗 CEA 单链抗体，构建对胃癌靶向性融合基因的真核表达载体[6]，通过融合基因的表达使淋巴细胞具备识别肿瘤及本身活化的双重功能，上调淋巴细胞的功能进而提高免疫疗效，为基因治疗提供了一个重要方法[22-23]，因其并非引入毒性分子对靶细胞的杀伤作用，所以在治疗上显得更为安全和可靠。如此设计将抗原抗体反应的特异性同 T 细胞活化所需双信号相结合，更能降低 T 细胞的活化阈值，提高 T 细胞的活化水平[24-25]，从而使得 CEA 靶向性淋巴细胞的杀伤功能不再受主要组织相容性复合体抗原的限制。
即使限于体外细胞与实验动物阶段，通过本研究发现，靶淋巴细胞对 CEA 阳性的 KATOⅢ胃癌细胞显示出较为理想的疗效。通过观察靶淋巴细胞与 CEA 阳性的 KATOⅢ胃癌细胞共培养发现，共培养 24 h 后，靶淋巴细胞可识别并引起 KATOⅢ胃癌细胞的凋亡；共培养 48 h 后，KATOⅢ胃癌细胞发生凋亡甚至坏死不可避免。在空载体淋巴细胞与 KATOⅢ胃癌细胞以及靶淋巴细胞与胃癌 BGC-823 细胞共培养发现，两者并无结合。该结果提示，靶淋巴细胞中 scFv-CD3ζ 嵌合分子中抗 CEA 单链抗体得以表达并未影响各自的功能，从而具备了活化特性及肿瘤识别。
为了进一步观察 CEA 靶向性淋巴细胞对 CEA 阳性胃癌细胞 KATOⅢ的杀伤效应，本研究通过检测胃癌细胞的凋亡发现，CEA 靶向性淋巴细胞可引起 KATOⅢ胃癌细胞的凋亡，明显高于其对 BGC-823 胃癌细胞引起的凋亡率，差异有统计学意义；也明显高于空载体淋巴细胞引起的 KATOⅢ细胞的凋亡率，差异也有统计学意义。提示 CEA 靶向性淋巴细胞对 CEA 阳性胃癌细胞杀伤效应明显，优于对 CEA 阴性癌细胞。未导入抗 CEA 抗体成分的淋巴细胞可能因失去了对肿瘤的识别能力，杀伤效应欠佳。
本研究分别构建胃癌细胞 KATOⅢ 及 BGC-823 荷瘤裸鼠动物模型，将靶淋巴细胞注射荷瘤裸鼠后，观察靶淋巴细胞在体内治疗效应，在不同时间内检测肿瘤生长情况。结果显示，靶淋巴细胞对荷瘤裸鼠的治疗效果是不同的，靶淋巴细胞对荷 CEA 阳性 KATOⅢ胃癌细胞裸鼠的肿瘤具有明显的抑制作用，明显优于荷 CEA 阴性的 BGC-823 胃癌细胞裸鼠组。体内试验结果证实，用靶淋巴细胞治疗荷瘤裸鼠疗效明显。
本研究的初步结果提示，靶淋巴细胞可特异性地抑制荷 CEA 阳性胃癌细胞裸鼠的肿瘤生长。或许，靶淋巴细胞将为肿瘤治疗提供一种比较有希望的思路。
癌胚抗原（CEA）表达于多种肿瘤[1]，尤其在消化道恶性肿瘤中明显[2-3]，基于其生物学特性，将其作为肿瘤标志物可广泛应用于对肿瘤的早期检测，可为临床肿瘤诊断提供依据并判断预后[4]；抗 CEA 单克隆抗体也用于对消化道肿瘤的诊治方面。基于 T 细胞活化的双信号学说，T 细胞的活化需要由抗原提呈细胞提供的两个信号[5]，一个信号是主要组织相容性复合体抗原，由肿瘤细胞抗原提供的抗原特异性刺激信号；另一个信号由反应 T 细胞共刺激分子提供，常包括 CD3ζ 及 CD28 和 B7-1 分子。我们将共刺激信号对 T 细胞的活化作用和抗 CEA 单链抗体对肿瘤的识别功能结合起来，构建了真核表达载体[6]，并制备出了具有 CEA 阳性靶向性和有活化功能的淋巴细胞。籍此观察对荷 CEA 阳性 KATOⅢ胃癌细胞裸鼠的治疗效应，并探索 CEA 阳性靶向性淋巴细胞治疗胃肠道肿瘤的可能性。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料
① CEA 阳性 KATOⅢ胃癌细胞系及 CEA 阴性 BGC-823 胃癌细胞系，用抗 CEA 的 T84.66 单链抗体（scFv）检测证实（抗 CEA 的 T84.66 scFv 由本项目组经原核表达纯化而制备[7]）。② 健康人外周血样从 10 名健康志愿者抽取。③ BALB/c 裸鼠，4～6 周龄，雄雌不限，体质量 18～20 g，在无特定病原体条件下饲养。④ 脂质体 lipofectamineTM 2000 （LF-2000）为美国 Invitrogen 公司产品；RPMI1640 购自美国 Gibco 公司；膜联蛋白Ⅴ-异硫氢酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）试剂盒为澳大利亚 Bender Medsystems 公司产品。⑤ 白细胞介素（IL）-2 由第四军医大学基因所制备；质粒大量提取盒为上海华舜生物公司产品。⑥ 细胞培养板购自美国 Costar 公司；流式细胞仪为 Counter 公司产品；γ 计数器为安莱公司产品；淋巴细胞分离液购自上海生化制剂一厂。
1.2 方法
1.2.1 重组真核表达载体 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 的构建及扩增
① 重组真核表达载体 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 构建方法详见文献[6]，进行目标基因 anti-CEA-scFv 片段的扩增，并从人白细胞中克隆出 CD3ζ 片段，通过分子生物学方法将 anti-CEA-scFv 及 CD3ζ 片段依次克隆于真核表达载体 pcDNA3.0，从而获得重组真核表达载体 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0。② 重组真核表达载体 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 扩增方法详见文献[6]，将重组真核表达载体转化入 E. coli TG1 细胞，经培养扩增后，抽提质粒载体，用密度分光仪测定 DNA 定量后备用。
1.2.2 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分离与培养
详细步骤按文献[8]的方法进行。无菌抽取健康志愿者的外周血，EDTA 抗凝，Ficoli 密度梯度离心法分离并获得 PBMC。在末次离心后，将获取的 PBMC 重悬于含胎牛血清的 RPMI 1640 培养液，原代培养并计数。用 2 mL RPMI 1640+10% 胎牛血清+IL-2（工作浓度为 500 U/mL）重悬细胞；置于培养瓶中在 37 ℃、5% CO2 孵箱中培养。
1.2.3 CEA 阳性靶向性淋巴细胞的制备
用脂质体介导的细胞转染方法，按照 LF-2000 产品说明书进行操作。首先将 PBMC（2～6）×105个/mL 接种于 12 孔培养板，加入无血清的培养基 1 mL。用 100 μL 无血清的 RPMI 1640 培养液稀释的 4 μL LF-2000，室温孵育 5 min。将拟转染的重组真核表达载体 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 DNA 的淋巴细胞简称为靶淋巴细胞，转染空载体 pcDNA3.0 DNA 的淋巴细胞简称为空载体淋巴细胞。靶淋巴细胞用无血清的 RPMI 1640 培养液稀释 2 μg 重组真核表达载体 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 DNA，与已稀释好的 LF-2000 充分混合，并在室温下孵育 20 min 形成 DNA-LF-2000 混合物；培养板中每孔 PBMC 中加入 200 μL 上述 DNA-LF-2000 混合物，孵育 6 h 后换液以减轻脂质体对淋巴细胞的毒性，以此获得靶淋巴细胞。空载体淋巴细胞用 2 μg pcDNA3.0 DNA 与已稀释好的 LF-2000 充分混合，并在室温下孵育 20 min 形成 DNA-LF-2000 混合物；培养板中每孔 PBMC 中加入 200 μL 上述 DNA-LF-2000 混合物，以此获得空载体淋巴细胞。转染各组原代淋巴细胞原代培养，以待观察对荷瘤小鼠的治疗效果。
1.2.4 不同淋巴细胞与胃癌细胞共培养[8-9 ]
将 KATOⅢ胃癌细胞及 BGC-823 胃癌细胞分别培养于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件，在其对数生长期传代使其贴壁生长。同时将不同淋巴细胞原代收集后计数，调至每份样品 5×105个细胞，将不同淋巴细胞和胃癌细胞靶效比按 4∶1 的比例共培养。① 倒置显微镜观察不同淋巴细胞与胃癌细胞共培养 24 h 后的识别情况。识别率的计数方法同病理学计数方法，取 10 个视野，取平均值作为其结合识别率。② 观察不同淋巴细胞与 KATOⅢ胃癌细胞共培养 24 h 及 48 h 时胃癌细胞的形态学变化。③ 用靶淋巴细胞和空载体淋巴细胞分别与 KATOⅢ 和 BGC-823 胃癌细胞分别共培养 36 h 后离心，弃上清，加入终浓度 2% 的多聚甲醛固定液 500 μL 重悬细胞，通过流式细胞仪检测 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌细胞凋亡信号膜联蛋白Ⅴ的表达，以判断不同淋巴细胞与 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌细胞共培养后对胃癌细胞凋亡的影响。
1.2.5 人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分组
将处于对数生长期的 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌细胞分别用生理盐水制成细胞悬液，工作浓度为 5×106个细胞/100 μL。将上述每种胃癌细胞悬液 100 μL 分别接种于 BALB/c 裸鼠右侧臀部皮下，每次各注射淋巴细胞数量为 5×105个。将建立荷 KATOⅢ胃癌细胞成功的裸鼠分为靶淋巴细胞+KATOⅢ 细胞组、空载体淋巴细胞+KATOⅢ细胞组及只荷 KATOⅢ胃癌细胞裸鼠而不注射淋巴细胞组即空白对照组 3 个亚组；建立荷 BGC-823 胃癌细胞成功的裸鼠分为靶淋巴细胞+BGC-823 细胞组和空载体淋巴细胞+BGC-823 细胞组。每组 8 只荷瘤裸鼠。分别通过尾静脉注射靶淋巴细胞或空载体淋巴细胞于 KATOⅢ瘤裸鼠和 BGC-823 瘤裸鼠。空白对照组 8 只荷 KATOⅢ胃癌细胞裸鼠不注射淋巴细胞。观察各组荷瘤裸鼠的生长情况，1 次/4 d，共观察 40 d；肿瘤生长情况观察，用游标卡尺测量肿瘤结节长径（a）和短径（b），1 次/5 d，计算肿瘤体积，其公式为 V=a×b2×0.5（mm3），根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 10.0 统计软件进行分析，采用单因素方差分析，方差中 2 组间均数比较用最小显著差法（LSD）。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 靶淋巴细胞对胃癌细胞的识别情况
在倒置显微镜高倍镜（×200 倍）下观察，共培养 24 h 时即发现靶淋巴细胞可与 KATOⅢ胃癌细胞紧密结合，连续取 10 个观察视野内靶淋巴细胞对 KATOⅢ胃癌细胞的识别率为 72.3%，提示该淋巴细胞对 KATOⅢ胃癌细胞的识别能力较强；靶淋巴细胞对 BGC-823 胃癌细胞识别率为 7.8%，提示该淋巴细胞对 BGC-823 胃癌细胞的识别能力较弱。
2.2 靶淋巴细胞对胃癌细胞的杀伤作用
2.2.1 形态学观察
在倒置显微镜下可见，靶淋巴细胞与 KATOⅢ胃癌细胞共培养 24 h 时，胃癌细胞增殖缓慢，细胞形态发生变化，局部发生凋亡（图 1a）；共培养 48 h 时，胃癌细胞进一步增殖缓慢，局部凋亡明显，出现坏死（图 1b）；空载体淋巴细胞与 KATOⅢ胃癌细胞共培养 24 h 时，胃癌细胞增殖活跃；48 h 时肿瘤细胞无明显受损害变化。靶淋巴细胞与 BGC-823 胃癌细胞共培养 24 h 或 48 h时，增殖均无明显变化（图 1c）；空载体淋巴细胞与 BGC-823 胃癌细胞共培养 24 h 时增殖未受明显影响（图 1d），48 h 时胃癌细胞增殖活跃，无明显受损形态学改变。
图1
不同淋巴细胞培养不同时相时胃癌细胞的形态学观察结果（倒置显微镜 ×200）
a：靶淋巴细胞与 KATOⅢ胃癌细胞共培养 24 h；b：靶淋巴细胞与 KATOⅢ胃癌细胞共培养 48 h；c：靶淋巴细胞与 BGC-823 胃癌细胞共培养 24 h；d：空载体淋巴细胞与 BGC-823 胃癌细胞共培养 24 h
2.2.2 对细胞凋亡的影响
当靶淋巴细胞和空载体淋巴细胞分别与 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌细胞分别共培养 36 h 时，靶淋巴细胞+KATOⅢ细胞组的凋亡率明显高于空载体淋巴细胞+KATOⅢ细胞组（P=0.032），而靶淋巴细胞+BGC-823 细胞组和空载体淋巴细胞+BGC-823 细胞组的凋亡率比较差异无统计学意义（P=0.118）。见表 1。
表1
不同淋巴细胞对不同胃癌细胞的凋亡影响（
）
2.3 靶淋巴细胞对荷瘤裸鼠肿瘤大小的影响
在观察 40 d 内肿瘤生长曲线见图 2。靶淋巴细胞+KATOⅢ细胞组的肿瘤体积明显小于空载体淋巴细胞+KATOⅢ细胞组（F=5.010，P<0.01）和空白对照组（F=7.560，P<0.01）；空载体淋巴细胞+KATOⅢ细胞组和空白对照组间比较差异无统计学意义（F=1.890，P>0.05）。靶淋巴细胞+BGC-823 细胞组与空载体淋巴细胞+BGC-823 细胞组间比较差异无统计学意义（F=1.210，P>0.05）。靶淋巴细胞+KATOⅢ细胞组的肿瘤体积明显小于靶淋巴细胞+BGC-823 细胞组（F=4.982，P<0.01）。
图2
各组荷瘤裸鼠肿瘤生长曲线
3 讨论
消化道肿瘤是常见且发病率较高的恶性肿瘤，手术治疗及术后放化疗尤为重要，但术后放化疗不良反应大，因而探索不良反应少、对患者身心影响较小的免疫治疗越来越受到重视。近年来的特异性免疫治疗，尤其瞄准消化道肿瘤特异性抗原的靶向免疫治疗显示出潜在的希望和活力。
CEA 在多种消化道肿瘤中呈阳性表达，阳性率高达 90%[10]。目前已经将抗 CEA 单抗 Fab 段的核酸序列克隆化，针对 CEA 的单克隆抗体相继出现，其中抗 CEA 的 T84.66 scFv 的功能已经明确[11-12]，其对 CEA 阳性的肿瘤具有较高的亲和力及特异性[13]，而对正常组织不结合，这对消化道肿瘤尤其胃癌的诊断具有重要意义。目前，将 CEA 作为肿瘤标志物可广泛应用于肿瘤的临床诊治和判断其预后。
十几年来，因在包括 CEA 在内多种肿瘤抗原的研究方面取得长足进展，肿瘤的生物治疗逐渐受到重视[14]。肿瘤基因治疗因此也被认为是当前最具发展潜力的肿瘤治疗手段之一[15-17]。
肿瘤基因治疗相当大的层面要借助于免疫治疗得以实现。因为肿瘤发生、发展往往与机体免疫下调息息相关。
肿瘤免疫治疗包括体液免疫治疗及细胞免疫治疗两方面，通常二者结合更能发挥效用。本研究中将二者有机结合起来。在体液免疫方面，具备识别肿瘤特异性抗原功能的单链抗体，在肿瘤的识别中表现出明显的优势[18]，将其整合于淋巴细胞上，就会赋予淋巴细胞以识别肿瘤细胞的功能。在细胞免疫方面，促进 T 淋巴细胞活化就更能发挥其对肿瘤细胞的细胞毒作用；T 细胞活化的共刺激信号的功能一直被重视[19-20]，合理上调其活化功能，便于对免疫细胞的活化，这对临床免疫非常关键[21]。本研究中引入 T 细胞活化的共刺激信号 CD3ζ 分子及抗 CEA 单链抗体，构建对胃癌靶向性融合基因的真核表达载体[6]，通过融合基因的表达使淋巴细胞具备识别肿瘤及本身活化的双重功能，上调淋巴细胞的功能进而提高免疫疗效，为基因治疗提供了一个重要方法[22-23]，因其并非引入毒性分子对靶细胞的杀伤作用，所以在治疗上显得更为安全和可靠。如此设计将抗原抗体反应的特异性同 T 细胞活化所需双信号相结合，更能降低 T 细胞的活化阈值，提高 T 细胞的活化水平[24-25]，从而使得 CEA 靶向性淋巴细胞的杀伤功能不再受主要组织相容性复合体抗原的限制。
即使限于体外细胞与实验动物阶段，通过本研究发现，靶淋巴细胞对 CEA 阳性的 KATOⅢ胃癌细胞显示出较为理想的疗效。通过观察靶淋巴细胞与 CEA 阳性的 KATOⅢ胃癌细胞共培养发现，共培养 24 h 后，靶淋巴细胞可识别并引起 KATOⅢ胃癌细胞的凋亡；共培养 48 h 后，KATOⅢ胃癌细胞发生凋亡甚至坏死不可避免。在空载体淋巴细胞与 KATOⅢ胃癌细胞以及靶淋巴细胞与胃癌 BGC-823 细胞共培养发现，两者并无结合。该结果提示，靶淋巴细胞中 scFv-CD3ζ 嵌合分子中抗 CEA 单链抗体得以表达并未影响各自的功能，从而具备了活化特性及肿瘤识别。
为了进一步观察 CEA 靶向性淋巴细胞对 CEA 阳性胃癌细胞 KATOⅢ的杀伤效应，本研究通过检测胃癌细胞的凋亡发现，CEA 靶向性淋巴细胞可引起 KATOⅢ胃癌细胞的凋亡，明显高于其对 BGC-823 胃癌细胞引起的凋亡率，差异有统计学意义；也明显高于空载体淋巴细胞引起的 KATOⅢ细胞的凋亡率，差异也有统计学意义。提示 CEA 靶向性淋巴细胞对 CEA 阳性胃癌细胞杀伤效应明显，优于对 CEA 阴性癌细胞。未导入抗 CEA 抗体成分的淋巴细胞可能因失去了对肿瘤的识别能力，杀伤效应欠佳。
本研究分别构建胃癌细胞 KATOⅢ 及 BGC-823 荷瘤裸鼠动物模型，将靶淋巴细胞注射荷瘤裸鼠后，观察靶淋巴细胞在体内治疗效应，在不同时间内检测肿瘤生长情况。结果显示，靶淋巴细胞对荷瘤裸鼠的治疗效果是不同的，靶淋巴细胞对荷 CEA 阳性 KATOⅢ胃癌细胞裸鼠的肿瘤具有明显的抑制作用，明显优于荷 CEA 阴性的 BGC-823 胃癌细胞裸鼠组。体内试验结果证实，用靶淋巴细胞治疗荷瘤裸鼠疗效明显。
本研究的初步结果提示，靶淋巴细胞可特异性地抑制荷 CEA 阳性胃癌细胞裸鼠的肿瘤生长。或许，靶淋巴细胞将为肿瘤治疗提供一种比较有希望的思路。
