目的 觀察光損傷后人視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGF-A）及其受體可溶性fm樣酪氨酸激酶受體（sFlt-1）和包含激酶植入?yún)^(qū)域受體（KDR）的表達(dá)。方法 體外培養(yǎng)人RPE細(xì)胞，取第8~12代生長(zhǎng)良好的傳代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將同代細(xì)胞隨機(jī) 分為對(duì)照組和光損傷組。以18 W冷白色熒光燈作為光源，自制光照器。采用雙層高壓消毒錫紙包裹對(duì)照組細(xì)胞，與光損傷組細(xì)胞一同置于自制光照器下，控制光照強(qiáng)度在（2200±300） Lux，持續(xù)光照12 h建立光損傷模型。于光損傷后0、6、12、24 h終止培養(yǎng)，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)VEGF-A、sFlt-1及KDR 的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果 光損傷組VEGF-A mRNA及蛋白表達(dá)在光損傷后6 h時(shí)明顯增加，12 h時(shí)達(dá)到高峰，明顯高于對(duì)照組（t=2.74，2.93；P＜0.05），隨后降低。sFlt-1的mRNA及蛋白表達(dá)在光損傷后12 h達(dá)到高峰，明顯高于對(duì)照組（t=4.32，P＜0.01）；24 h時(shí) 明顯低于對(duì)照組（t=2.41，P＜0.05）。KDR的mRNA及蛋白表達(dá)在光損傷后6、12 h時(shí)較對(duì)照組無(wú)明顯變化(t=1.84，P＞0.05)，24 h時(shí)高于對(duì)照組（t=2.89，P＜0.05）。 〖HTH〗結(jié)論光損傷后6、12 h時(shí)，RPE細(xì)胞VEGF-A及sFlt-1的表達(dá)明顯增高，KDR的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。光損傷后24 h時(shí)，RPE細(xì)胞VEGF-A及sFlt-1的表達(dá)降低，KDR的表達(dá)增高。
目的 觀察持續(xù)頻閃光刺激對(duì)發(fā)育敏感期豚鼠視網(wǎng)膜組織及功能的影響。方法 24只出生日齡14 d的豚鼠隨機(jī)分為頻閃組和對(duì)照組，每組均為12只。頻閃組使用頻閃調(diào)光器以0.5 Hz頻率等時(shí)交替頻閃，照度波動(dòng)0～500 Lux；對(duì)照組給予500 Lux照明。2組均使用500 nm波長(zhǎng)發(fā)光二極管，控制光照時(shí)間為晝夜12 h輪替。實(shí)驗(yàn)第12周所有豚鼠行眼底彩色照相和閃光視網(wǎng)膜電圖（F-ERG）檢查。檢查結(jié)束后摘除眼球，測(cè)量眼球水平徑、垂直徑及前后徑3條徑線，光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察眼球后極部結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果 與對(duì)照組比較，頻閃組豚鼠眼底漆裂紋樣改變更為明顯，ERG a波潛伏期延長(zhǎng)；眼球水平徑、垂直徑及前后徑分別較對(duì)照組增加（0.89plusmn;0.30）、（0.69plusmn;0.20）、（0.96plusmn;0.30） mm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.7、11.9、15.8，P＜0.05）。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，頻閃組豚鼠鞏膜纖維出現(xiàn)擴(kuò)張；透射電子鏡顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層外段排列稀疏紊亂并可見(jiàn)大量脫落外節(jié)盤(pán)膜。結(jié)論 持續(xù)頻閃光刺激會(huì)誘導(dǎo)豚鼠眼球產(chǎn)生過(guò)度發(fā)育，并會(huì)影響視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與傳導(dǎo)功能。
目的 觀察藍(lán)光照射后大鼠視網(wǎng)膜中alpha;A和alpha;B晶體蛋白的表達(dá)。方法 40只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，藍(lán)光照射6、12、24 h組共4組，每組10只。正常對(duì)照組不給予任何處理，藍(lán)光照射6、12、24 h組分別給予藍(lán)光照射6、12、24 h后給予12 h暗適應(yīng)，麻醉后摘取眼球。采用免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)視網(wǎng)膜中alpha;A和alpha;B晶體蛋白表達(dá)。結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)顯示，正常對(duì)照組以及藍(lán)光照射6、12、24 h組視網(wǎng)膜alpha;A晶體蛋白吸光度［A，舊稱(chēng)光密度（OD）］值分別為1.405 73plusmn;0.707 48、4.317 51plusmn;0.412 97、7.397 08plusmn;1.947 90、9.634 32plusmn;2.377 61，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.569，P＜0.001）。正常對(duì)照組以及藍(lán)光照射6、12、24 h組視網(wǎng)膜alpha;B晶體蛋白A值分別為0.129 36plusmn;0.033 93、0.507 17plusmn;0.117 55、7.345 43plusmn;2.292 97、4.042 26plusmn;3.890 23，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=40.102，P＜0.001）。Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光照射6、12、24 h后視網(wǎng)膜alpha;A-及alpha;B-晶體蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組。結(jié)論 藍(lán)光可誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜alpha;A-晶體蛋白和alpha;B-晶體蛋白表達(dá)上調(diào)。
目的 觀察670 nm近紅外光對(duì)SD大鼠的視網(wǎng)膜光損傷模型是否具有保護(hù)作用。方法 將32只SD大鼠分成8組，1組為正常對(duì)照組； 2組為紅外光對(duì)照組； 3、5、7組為光損傷組；第4、6、8組為光損傷加近紅外光保護(hù)組。光損傷劑量為900，1800，2700 lx白光，持續(xù)照射3 h；在光損傷前3 h和光損傷后0、24、48 h，保護(hù)組先后4次給予50 mW近紅外光照射30 min。光損傷后第5天將大鼠置于暗室過(guò)夜，第6天作視網(wǎng)膜電圖（ERG）檢測(cè)，并取眼球作病理檢查。結(jié)果 1組和2組視網(wǎng)膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，外核層細(xì)胞約11層，ERG b波振幅（1088plusmn;55）mu;V。3組和4組900 lx白光持續(xù)照射3 h，未造成大鼠視網(wǎng)膜的損傷。5組1800 lx白光持續(xù)照射3 h，外核層細(xì)胞的減少至1～2層，內(nèi)節(jié)（IS）與外節(jié)（OS）結(jié)構(gòu)完全消失；損傷范圍占全視網(wǎng)膜的0.48plusmn;0.12，損傷厚度占外核層全厚的L5=0.39plusmn;0.07，ERG的b波低伏（431plusmn;120 ）mu;V。6組在1800 Lux白光照射前后實(shí)施近紅外光保護(hù)，視網(wǎng)膜損傷范圍縮小為M6=0.17plusmn;0.12, （P5/6=0.002)；損失厚度減少到L6=0.22plusmn;0.09 (P5/6lt;0.01）；ERG b波振幅升高到（1011plusmn;83）mu;V（P5/6lt;0.001）。2700 lx白光持續(xù)照射3 h，7組和8組病理和ERG檢查的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［損傷面積:M7=0.83plusmn;0.09, M8=0.70plusmn;0.10, P7/8=0.074；損傷厚度L7=0.81plusmn;0.08, L8=0.73plusmn;0.08, P=0.17；ERG：H7=（234plusmn;26）mu;V，H8=（253plusmn;29）mu;V，P7/8gt;0.05］。結(jié)論 在一定的照射強(qiáng)度和時(shí)間范圍內(nèi)，670 nm近紅外光對(duì)大鼠視網(wǎng)膜光損傷有明確的保護(hù)作用。
目的 觀察視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞中黑色素含量與光感受器細(xì)胞功能之間的關(guān)系，探討黑色素對(duì)視網(wǎng)膜光損傷的作用。方法 老齡多巴色素異構(gòu)酶敲除小鼠（Dct-/-小鼠）和C57BL/6小鼠（野生型小鼠）各20只，分別為Dct-/-小鼠組和野生型小鼠組。采用臨床電生理國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)各型鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖（ERG）檢查，記錄其最大混合反應(yīng)后各組隨機(jī)處死2只小鼠，摘除眼球作為陰性對(duì)照。余下每組各18只小鼠，將6只小鼠用20 W冷熒光燈行12 h明、12 h暗、12 h明的間斷光照36 h，連續(xù)3個(gè)循環(huán)。光照強(qiáng)度為（5000plusmn;356） lx。光照結(jié)束后第6天再次進(jìn)行ERG檢查，記錄ERG結(jié)果。隨機(jī)頸椎脫臼法處死每組各2只小鼠，摘除眼球。所有摘除眼球常規(guī)組織切片，光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察。結(jié)果 ERG檢查結(jié)果顯示，光損傷前后Dct-/-小鼠a、b波振幅明顯低于野生型小鼠（ta波光照前=-7.13，P＜0.01；tb波光照前=-4.414，P＜0.01；ta波光照后=-10.162，P＜0.01；tb波光照后=-6.772，P＜0.01）；光損傷后Dct-/-小鼠ERG a、b波的振幅下降幅度明顯高于野生型小鼠（ta波=4.975,P＜0.01；tb波=2.908,P＜0.01）。光損傷后，光學(xué)顯微鏡檢查可見(jiàn)Dct-/-小鼠視網(wǎng)膜水腫、變薄，較野生型明顯；電子顯微鏡檢查可見(jiàn)RPE細(xì)胞中黑色素顆粒融解、斷裂或丟失，光感受器細(xì)胞外節(jié)盤(pán)膜腫脹、碎裂及空泡變，Dct-/-小鼠損傷較野生型小鼠嚴(yán)重。結(jié)論 光損傷后RPE細(xì)胞黑色素含量減少，光感受器細(xì)胞功能下降，提示黑色素對(duì)光損傷可能有保護(hù)作用。
目的 探討藍(lán)光光照強(qiáng)度、時(shí)間與大鼠視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞復(fù)制衰老的關(guān)系。方法 將36只鼠齡12~14周的Wistar大鼠置于懸有波長(zhǎng)為（450plusmn;10） nm的醫(yī)用藍(lán)光燈管的自制光照架中。隨機(jī)分為4組，每組9只大鼠，1組：無(wú)光照對(duì)照組；2組：自然光照組；3組：500 lx光照組；4組：1000 lx光照組。每組按照照射時(shí)間再分為1、2、3個(gè)月組3個(gè)亞組，分別在1、2、3個(gè)月時(shí)行10％水合氯醛腹腔注射麻醉后取出眼球，將右眼球行石蠟切片，蘇木精伊紅（HE）染色；左眼球行冰凍切片，采用衰老相關(guān)beta;半乳糖苷酶（SA-beta;-Gal）染色方法觀察RPE細(xì)胞染色陽(yáng)性情況。采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 不同光照強(qiáng)度組、不同光照時(shí)間組大鼠RPE 細(xì)胞SA-beta;-Gal染色陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝510.309，55.016；P＝0.000）；組間兩兩比較，除1組與2組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＝0.154），其它各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000）。在單一光照強(qiáng)度條件下，除1組大鼠RPE細(xì)胞SA-beta;-Gal染色陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P=0.897）,其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在單一時(shí)間條件下，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000）。結(jié)論 同一藍(lán)光光照強(qiáng)度下，隨著時(shí)間的增加大鼠視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞逐漸出現(xiàn)復(fù)制衰老改變;同一時(shí)間條件下，隨光照強(qiáng)度增加大鼠視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞也逐漸出現(xiàn)復(fù)制衰老改變。
目的觀察芬戈莫德(FTY720)對(duì)視網(wǎng)膜光損傷大鼠光感受器細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。 方法Sprague-Dawley大鼠120只隨機(jī)分為正常組、模型組、溶媒組和FTY720組, 每組30只。正常組大鼠不予處理; 模型組、溶媒組和FTY720組大鼠建立光損傷動(dòng)物模型。模型組大鼠僅接受光照。FTY720組大鼠建模前腹腔注射FTY720, 溶媒組大鼠注射50%二甲基亞砜。光照后6 h及1、3、7 d, 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞所占比例; 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜中白細(xì)胞介素(IL)-1β的含量。光照后1 d, 采用原位末端標(biāo)記法檢測(cè)光感受器細(xì)胞凋亡情況。光照后7 d, 采用蘇木精-伊紅染色觀察大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)。 結(jié)果大鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細(xì)胞所占比例及IL-1β含量均于光照后6 h開(kāi)始升高, 光照后3 d達(dá)高峰, 光照后7 d開(kāi)始下降。光照后6 h及1、3、7 d, FTY720組大鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細(xì)胞所占比例及IL-1β含量較正常組升高, 較模型組、溶酶組明顯降低, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。光照后1 d, 正常組、模型組、溶酶組及FTY720組大鼠視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞比例分別為0、(87.66±2.50)%、(86.00±2.44)%、(49.66±2.80)%。FTY720組大鼠視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞比例較正常組升高, 較模型組、溶酶組明顯降低, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。光照后7 d, 正常組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰, 細(xì)胞排列整齊; 溶酶組、模型組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)不清楚, 細(xì)胞排列紊亂, 外核層明顯變薄; FTY720組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰, 外核層厚度較溶酶組、模型組厚, 但薄于正常組。 結(jié)論FTY720能抑制視網(wǎng)膜光損傷大鼠光感受器細(xì)胞的凋亡及小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。
目的觀察絲氨酸蛋白酶HtrA1沉默對(duì)光損傷人視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞的影響。 方法體外培養(yǎng)人RPE細(xì)胞,取第8～12代生長(zhǎng)良好的傳代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、光損傷模型組。采用波長(zhǎng)400 nm的藍(lán)色節(jié)能燈以(2000±500) Lux持續(xù)光照RPE細(xì)胞6 h建立光損傷模型。建模后光損傷模型組再分為針對(duì)HtrA1的小干擾RNA(HtrA1 siRNA)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組。應(yīng)用脂質(zhì)體RNAimax將HtrA1 siRNA轉(zhuǎn)染至HtrA1 siRNA組細(xì)胞;陰性對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染非特異的陰性siRNA;空白對(duì)照組為單純光損傷細(xì)胞。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒、transwell小室法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞增生、遷徙、凋亡以及細(xì)胞周期情況;實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中HtrA1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)。 結(jié)果光損傷模型組細(xì)胞中HtrA1 mRNA、蛋白表達(dá)均較正常對(duì)照組細(xì)胞明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.62、15.09,P<0.05)。與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較,HtrA1 siRNA組細(xì)胞增生(t=6.37、4.52)、遷徙能力(t=9.56、12.13)、凋亡率(t=23.37、29.08)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);細(xì)胞停留在G0/G1期數(shù)目增多(t=6.24、4.93),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);HtrA1、VEGF-A mRNA(t=17.36、11.32、7.29、4.05)和蛋白(t=12.02、15.28、4.98、6.24)表達(dá)均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論特異性沉默HtrA1基因表達(dá)可降低藍(lán)光對(duì)人RPE細(xì)胞增生、遷徙能力的損傷和細(xì)胞凋亡率;下調(diào)VEGF-A的表達(dá)。
目的觀察藍(lán)光誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞外泌體對(duì)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)樣受體蛋白（NLRP3）炎性體相關(guān)因子表達(dá)的影響。方法人RPE細(xì)胞株貼壁細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以藍(lán)光照射6 h建立光損傷模型；對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)。分級(jí)低溫超速離心法獲得兩組細(xì)胞外泌體，透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)兩組細(xì)胞外泌體表面CD63及白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-1）蛋白相對(duì)表達(dá)水平。將兩組細(xì)胞外泌體作用于正常RPE細(xì)胞，據(jù)此分為藍(lán)光誘導(dǎo)細(xì)胞外泌體+實(shí)驗(yàn)組、正常細(xì)胞外泌體+對(duì)照組。培養(yǎng)24 h后，Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞外泌體中IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表達(dá)；熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)兩組細(xì)胞中NLRP3 mRNA表達(dá)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞發(fā)生損傷失去原有形態(tài)；外泌體均呈雙凹托盤(pán)狀，直徑50～200 nm；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞外泌體中IL-1β（t=18.04）、IL-18（t=12.55）、caspase-1（t=14.70）蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。藍(lán)光誘導(dǎo)細(xì)胞外泌體+實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞外泌體中IL-1β（t=18.59）、IL-18（t=23.95）、caspase-1（t=35.27）蛋白表達(dá)量明顯高于正常細(xì)胞外泌體+對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；藍(lán)光誘導(dǎo)細(xì)胞外泌體+實(shí)驗(yàn)組、正常細(xì)胞外泌體+對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.069、0.200±0.010，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.20，P＜0.001）。結(jié)論藍(lán)光誘導(dǎo)RPE細(xì)胞外泌體可使RPE細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性體相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白和NLRP3 mRNA表達(dá)上調(diào)。