引用本文： 余天, 邢怡桥, 陈长征. 小干扰RNA介导丝氨酸蛋白酶HtrA1沉默对光损伤人视网膜色素上皮细胞的影响. 中华眼底病杂志, 2016, 32(4): 413-417. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.04.016 复制
丝氨酸蛋白酶HtrAl基因与老年性黄斑变性(AMD)具有显著相关性；AMD患眼的玻璃膜疣、视网膜色素上皮(RPE)以及脉络膜新生血管(CNV)的HtrA1表达均增高[1, 2]。Kumar等[3]在HtrA1过表达的小鼠RPE层观察到细胞外基质的降解以及新生血管形成。可见光及紫外线尤其是光谱中的蓝光可对RPE细胞产生光化学损伤，从而参与到AMD病理过程中[4, 5]。血管内皮生长因子(VEGF)在CNV形成过程中发挥着重要的作用。Kernt等[6]研究发现，光损伤后RPE分泌VEGF上升。但HtrA1在蓝光光照RPE细胞中发挥的作用以及与VEGF之间是否存在关联尚不明确。为此，我们通过体外培养人RPE细胞建立光损伤模型，应用小干扰RNA(siRNA)技术特异性干扰光损伤模型人RPE细胞中HtrA1的表达，观察HtrA1沉默对RPE细胞的影响以及VEGF-A的表达情况。现将结果报道如下。
1 材料和方法
人RPE细胞株ARPE-19(美国ATCC公司)，针对HtrA1的siRNA(美国Santa Cruz公司)，脂质体RNAimax (美国Invitrogen公司)，RNA提取试剂盒、定量聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒以及逆转录试剂盒(德国QIAGEN公司)，细胞计数试剂盒(CCK-8，日本Dojindo公司)，transwell小室(美国Coming公司)，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)流式凋亡检测以及细胞周期检测试剂盒(美国R&D公司)，鼠抗人HtrA1抗体(美国R&D公司)，兔抗人VEGF-A抗体(美国Bioworld公司)，辣根过氧化物酶标记二抗(武汉博士德生物公司)，15 W蓝色节能灯(荷兰Philips公司)，MS6610数字式照度仪(深圳华谊仪表有限公司)，细胞培养箱(美国Thermo公司)。
采用含10％胎牛血清，100 U/L青链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养ARPE-19细胞。取第8～12代生长状态良好的传代细胞用于实验。将细胞分为正常对照组、光损伤模型组。参照蔡善君等[7]方法及前期预实验建立细胞光损伤模型。波长400 nm的15 W蓝色灯自制成光照器，细胞平面光照强度控制在(2000±500) Lux，温度变化在36.5～37.5℃，持续照射6 h。光损伤模型组建模后再分为HtrA1 siRNA组、阴性对照组、空白对照组。
应用脂质体RNAimax将HtrA1 siRNA转染至HtrA1 siRNA组细胞。将各组细胞接种于六孔板，调整细胞密度1×103个/孔，当细胞密度达到50％时换成OPTI-MEM培养基,加入预先配制HtrA1 siRNA/ 脂质体RNAimax复合物，使siRNA终浓度为100 nmol/L，转染4 h后换液，改用DMEM/F12培养基继续培养20 h后结束培养；阴性对照组细胞转染非特异的阴性siRNA；空白对照组为单纯光损伤细胞。
采用CCK-8增生分析法检测干扰HtrA1表达对HtrA1 siRNA组、阴性对照组、空白对照组细胞增生的影响。各组细胞消化并接种于96孔板，调整细胞密度1×103个/孔加入含10％胎牛血清DMEM/F12培养基200 μl，各组细胞分别培养12、24、48 h后加入CCK-8液20 μl孵育4 h。酶标仪上以490 nm波长测定吸光度[A，旧称光密度(OD)]值，以细胞A值平均值为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线。
Transwell小室法检测HtrA1 siRNA组、阴性对照组、空白对照组细胞迁徙。含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基600 μl置入下室，200 μl含1×105个各组培养的细胞加入上室，放入37℃、5％CO2培养箱培养24 h，棉签擦去基底膜上室细胞，甲醛固定，吉姆萨染色，计数、拍照。
流式细胞仪检测HtrA1 siRNA组、阴性对照组、空白对照组凋亡以及细胞周期。收集细胞，80％乙醇4℃过夜，磷酸盐缓冲液漂洗3次，加入核糖核酸酶 5 μl(10 mg/ml)，37℃放置1 h，加入PI(100 μg/ml) 染色液室温避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期。Annexin V-FITC/PI双标记法流式细胞仪分析细胞凋亡，具体方法按试剂盒说明书进行，采用Cellquest软件分析。
RT-PCR检测各组细胞中HtrA1、VEGF-A mRNA表达。RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。采用Primer Premier 5.0软件设计引物，上海生工生物技术服务有限公司合成。分别扩增HtrA1、VEGF-A和内参照β-肌动蛋白(actin)。HtrA1上游引物：5-AGTAAACCTGGACGGTGAA GTGATTG-3,下游引物：5-TTGGCTTTGCTGGAC GTGAGTG-3,合成产物192碱基对(bp)；VEGF-A上游引物：5′-AAGGAGGAGGGCAGAATCAT-3′，下游引物：5′-ATCTGCATGGTGATGTTGGA-3′，合成产物226 bp；β-actin上游引物：5′-GTCCACCGCA AATGCTTCTA-3′，下游引物：5′-TGCTGTCACCTT CACCGTTC -3′，合成产物190 bp。PCR反应条件：HtrA1 94℃预变性5 min，94℃变性30 s，51℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，共35个循环。其他的扩增反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，重复40个循环。PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，使用凝胶图像分析系统行A扫描并用所测指标A/β-actin A值作为mRNA表达的相对强度。
蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞HtrA1、VEGF-A蛋白表达。各组细胞光照24 h后提取总蛋白，二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。取40 μg蛋白进行凝胶电泳分离、转膜、封闭。以β-actin作为内参抗体，抗HtrA1及VEGF-A一抗4℃孵育过夜(分别按1 ∶200、 1 ∶5000稀释)，洗膜缓冲液(TBST)洗膜，二抗室温孵育2 h，TBST洗膜，显影定影。
各独立实验均重复3次。采用SPSS 13.0统计软件行统计学分析处理。数据以均数±标准差(
2 结果
光损伤模型组细胞中HtrA1 mRNA、蛋白表达均较正常对照组细胞明显升高，差异有统计学意义(t=17.62、15.09，P<0.05)(图 1,2)。
图1
图 1 光照前后RPE细胞HtrA1 mRNA表达情况。P<0.05 图 2 光照前后RPE细胞HtrA1蛋白表达情况。 2A.正常对照组、光损伤模型组细胞中HtrA1蛋白表达电泳图；2B.正常对照组、光损伤模型组HtrA1蛋白表达统计图。P<0.05 图 3各组细胞生长情况 图 4 Transwell小室检测各组细胞迁徙能力。P<0.05
CCK-8增生分析法结果显示，随着培养时间增加，HtrA1 siRNA组细胞较阴性对照组、空白对照组细胞生长曲线降低，48 h时差异有统计学意义(t=6.37、4.52，P<0.05)(图 3)。
Transwell实验结果显示，HtrA1 siRNA组细胞细胞迁徙数量与阴性对照组、空白对照组细胞比较，细胞迁徙数量明显下降，差异有统计学意义(t=9.56、12.13，P<0.05)(图 4)；阴性对照组、空白对照组间细胞迁徙数量比较，差异无统计学意义(t=2.31，P>0.05)。
流式细胞仪检测结果显示，HtrA1 siRNA组、阴性对照组、空白对照组细胞凋亡率分别为(3.2±1.3)％、(15.2±2.4)％、(17.3±1.9)％。HtrA1 siRNA组 细胞凋亡率较阴性对照组、空白对照组明显减少，差异有统计学意义(t=23.37、29.08，P<0.05)；阴性对照组、空白对照组间细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(t=7.32，P>0.05)(图 5)。HtrA1 siRNA组G0/G1期细胞数较阴性对照组和空白对照组明显增加，差异有统计学差异(t=6.24、4.93，P<0.05)(图 6)。
图5
Annexin V-FITC / PI双染法流式检测各组细胞凋亡情况。5A.各组细胞凋亡情况；5B.各组凋亡细胞统计图。P<0.05
图6
各组细胞G0/G1期细胞比例。P<0.05
RT-PCR检测结果显示，HtrA1 siRNA组细胞HtrA1(t=17.36、11.32)、VEGF-A(t=7.29、4.05) mRNA表达较阴性对照组和空白对照组明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组、空白对照组间细胞HtrA1、VEGF-A mRNA表达比较，差异无统计学意义(t=3.41、1.89，P>0.05)(图 7)。
图7
各组细胞HtrA1及VEGF-A的mRNA表达情况。P<0.05
Western blot检测结果显示，HtrA1 siRNA组 细胞HtrA1(t=12.02、15.28)、VEGF-A(t=4.98、6.24)蛋白表达较阴性对照组和空白对照组明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组、空白对照组间细胞HtrA1、VEGF-A蛋白表达比较，差异无统计学意义(t=2.65、2.07，P>0.05)(图 8)。
图8
各组细胞HtrA1及VEGF-A蛋白表达情况。8A.阴性对照组、空白对照组及HtrA1 siRNA组HtrA1及VEGF-A蛋白表达电泳图；8B. 各组HtrA1蛋白及VEGF-A表达统计图。P<0.05
3 讨论
RPE细胞结构和功能的改变是AMD和CNV发生发展的重要因素，可见光及紫外线尤其是光谱中的蓝光可对RPE细胞产生光化学损伤[4, 5]。本研究为观察RPE细胞结构和功能的变化，排除动物模型的种属差异、多种体内因子影响，参考之前使用的蓝光照射培养的ARPE-19细胞方法建立RPE细胞光损伤模型。
HtrA1是一种分泌蛋白，在胎盘、骨骼组织、血管以及眼等多种正常组织均有表达[8]。在卵巢癌、黑色素瘤、肺癌等多种恶性肿瘤中呈低表达状态，被认为是一种肿瘤抑制基因；在骨关节炎、类风湿性关节炎、AMD等中表达则增高[2, 9]。有研究结果显示，萎缩型和渗出型AMD的玻璃膜疣中HtrA1表达均增高[2]。Pei等[10]研究发现沉默HtrAl后，RPE细胞的增生、迁徙能力下降。本研究通过siRNA干扰技术沉默光损伤模型细胞中HtrAl的表达，通过CCK-8、transwell小室法及流式细胞仪观察干扰后RPE细胞的增生、迁徙、凋亡以及细胞周期的变化。结果显示，HtrAl siRNA组细胞增生、迁徙能力及凋亡率均较对照组明显下降，停留在G0/G1期的细胞数明显增加。本研究结果与Pei等[10]研究结果相似。但Supanji等[11]研究发现RPE细胞在双氧水氧化应激状态下，HtrA1表达增高，对细胞衰老有促进作用，对细胞凋亡并未见促进作用。引起细胞衰老死亡的趋势相同，但是却以衰老变化为主，原因是所采用的的模型类型差别引起。
有研究发现HtrAl产物可以参与调节细胞外基质的降解，通过阻断转化生长因子-β信号通路从而作用于形成玻璃膜疣的细胞外基质组成成分Bruch膜进而参与CNV的形成[12]。近年研究发现，上调小鼠RPE层HtrAl的表达可引起脉络膜血管出现AMD中相似的异常变化；在过表达HtrAl的转基因小鼠中，CNV风险增高[3, 13]。Ng等[14]发现AMD患者房水以及应激炎症状态下胎儿RPE细胞中HtrA1及VEGF同时增高。VEGF-A在CNV的形成中发挥重要作用，前期有研究也证实VEGF-A在蓝光RPE细胞损伤模型中表达增高[15]。本研究结果显示光损伤模型组细胞中HtrA1 mRNA、蛋白表达均较正常对照组明显增高。siRNA干扰技术沉默HtrA1后，HtrAl siRNA组HtrA1、VEGF-A mRNA和蛋白表达均较阴性对照组和空白对照组明显下降。提示在蓝光损伤模型中干预HtrA1表达后VEGF表达也同时下降，二者可能存在一定关联，有待进一步研究。
丝氨酸蛋白酶HtrAl基因与老年性黄斑变性(AMD)具有显著相关性；AMD患眼的玻璃膜疣、视网膜色素上皮(RPE)以及脉络膜新生血管(CNV)的HtrA1表达均增高[1, 2]。Kumar等[3]在HtrA1过表达的小鼠RPE层观察到细胞外基质的降解以及新生血管形成。可见光及紫外线尤其是光谱中的蓝光可对RPE细胞产生光化学损伤，从而参与到AMD病理过程中[4, 5]。血管内皮生长因子(VEGF)在CNV形成过程中发挥着重要的作用。Kernt等[6]研究发现，光损伤后RPE分泌VEGF上升。但HtrA1在蓝光光照RPE细胞中发挥的作用以及与VEGF之间是否存在关联尚不明确。为此，我们通过体外培养人RPE细胞建立光损伤模型，应用小干扰RNA(siRNA)技术特异性干扰光损伤模型人RPE细胞中HtrA1的表达，观察HtrA1沉默对RPE细胞的影响以及VEGF-A的表达情况。现将结果报道如下。
1 材料和方法
人RPE细胞株ARPE-19(美国ATCC公司)，针对HtrA1的siRNA(美国Santa Cruz公司)，脂质体RNAimax (美国Invitrogen公司)，RNA提取试剂盒、定量聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒以及逆转录试剂盒(德国QIAGEN公司)，细胞计数试剂盒(CCK-8，日本Dojindo公司)，transwell小室(美国Coming公司)，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)流式凋亡检测以及细胞周期检测试剂盒(美国R&D公司)，鼠抗人HtrA1抗体(美国R&D公司)，兔抗人VEGF-A抗体(美国Bioworld公司)，辣根过氧化物酶标记二抗(武汉博士德生物公司)，15 W蓝色节能灯(荷兰Philips公司)，MS6610数字式照度仪(深圳华谊仪表有限公司)，细胞培养箱(美国Thermo公司)。
采用含10％胎牛血清，100 U/L青链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养ARPE-19细胞。取第8～12代生长状态良好的传代细胞用于实验。将细胞分为正常对照组、光损伤模型组。参照蔡善君等[7]方法及前期预实验建立细胞光损伤模型。波长400 nm的15 W蓝色灯自制成光照器，细胞平面光照强度控制在(2000±500) Lux，温度变化在36.5～37.5℃，持续照射6 h。光损伤模型组建模后再分为HtrA1 siRNA组、阴性对照组、空白对照组。
应用脂质体RNAimax将HtrA1 siRNA转染至HtrA1 siRNA组细胞。将各组细胞接种于六孔板，调整细胞密度1×103个/孔，当细胞密度达到50％时换成OPTI-MEM培养基,加入预先配制HtrA1 siRNA/ 脂质体RNAimax复合物，使siRNA终浓度为100 nmol/L，转染4 h后换液，改用DMEM/F12培养基继续培养20 h后结束培养；阴性对照组细胞转染非特异的阴性siRNA；空白对照组为单纯光损伤细胞。
采用CCK-8增生分析法检测干扰HtrA1表达对HtrA1 siRNA组、阴性对照组、空白对照组细胞增生的影响。各组细胞消化并接种于96孔板，调整细胞密度1×103个/孔加入含10％胎牛血清DMEM/F12培养基200 μl，各组细胞分别培养12、24、48 h后加入CCK-8液20 μl孵育4 h。酶标仪上以490 nm波长测定吸光度[A，旧称光密度(OD)]值，以细胞A值平均值为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线。
Transwell小室法检测HtrA1 siRNA组、阴性对照组、空白对照组细胞迁徙。含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基600 μl置入下室，200 μl含1×105个各组培养的细胞加入上室，放入37℃、5％CO2培养箱培养24 h，棉签擦去基底膜上室细胞，甲醛固定，吉姆萨染色，计数、拍照。
流式细胞仪检测HtrA1 siRNA组、阴性对照组、空白对照组凋亡以及细胞周期。收集细胞，80％乙醇4℃过夜，磷酸盐缓冲液漂洗3次，加入核糖核酸酶 5 μl(10 mg/ml)，37℃放置1 h，加入PI(100 μg/ml) 染色液室温避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期。Annexin V-FITC/PI双标记法流式细胞仪分析细胞凋亡，具体方法按试剂盒说明书进行，采用Cellquest软件分析。
RT-PCR检测各组细胞中HtrA1、VEGF-A mRNA表达。RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。采用Primer Premier 5.0软件设计引物，上海生工生物技术服务有限公司合成。分别扩增HtrA1、VEGF-A和内参照β-肌动蛋白(actin)。HtrA1上游引物：5-AGTAAACCTGGACGGTGAA GTGATTG-3,下游引物：5-TTGGCTTTGCTGGAC GTGAGTG-3,合成产物192碱基对(bp)；VEGF-A上游引物：5′-AAGGAGGAGGGCAGAATCAT-3′，下游引物：5′-ATCTGCATGGTGATGTTGGA-3′，合成产物226 bp；β-actin上游引物：5′-GTCCACCGCA AATGCTTCTA-3′，下游引物：5′-TGCTGTCACCTT CACCGTTC -3′，合成产物190 bp。PCR反应条件：HtrA1 94℃预变性5 min，94℃变性30 s，51℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，共35个循环。其他的扩增反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，重复40个循环。PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，使用凝胶图像分析系统行A扫描并用所测指标A/β-actin A值作为mRNA表达的相对强度。
蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞HtrA1、VEGF-A蛋白表达。各组细胞光照24 h后提取总蛋白，二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。取40 μg蛋白进行凝胶电泳分离、转膜、封闭。以β-actin作为内参抗体，抗HtrA1及VEGF-A一抗4℃孵育过夜(分别按1 ∶200、 1 ∶5000稀释)，洗膜缓冲液(TBST)洗膜，二抗室温孵育2 h，TBST洗膜，显影定影。
各独立实验均重复3次。采用SPSS 13.0统计软件行统计学分析处理。数据以均数±标准差(
2 结果
光损伤模型组细胞中HtrA1 mRNA、蛋白表达均较正常对照组细胞明显升高，差异有统计学意义(t=17.62、15.09，P<0.05)(图 1,2)。
图1
图 1 光照前后RPE细胞HtrA1 mRNA表达情况。P<0.05 图 2 光照前后RPE细胞HtrA1蛋白表达情况。 2A.正常对照组、光损伤模型组细胞中HtrA1蛋白表达电泳图；2B.正常对照组、光损伤模型组HtrA1蛋白表达统计图。P<0.05 图 3各组细胞生长情况 图 4 Transwell小室检测各组细胞迁徙能力。P<0.05
CCK-8增生分析法结果显示，随着培养时间增加，HtrA1 siRNA组细胞较阴性对照组、空白对照组细胞生长曲线降低，48 h时差异有统计学意义(t=6.37、4.52，P<0.05)(图 3)。
Transwell实验结果显示，HtrA1 siRNA组细胞细胞迁徙数量与阴性对照组、空白对照组细胞比较，细胞迁徙数量明显下降，差异有统计学意义(t=9.56、12.13，P<0.05)(图 4)；阴性对照组、空白对照组间细胞迁徙数量比较，差异无统计学意义(t=2.31，P>0.05)。
流式细胞仪检测结果显示，HtrA1 siRNA组、阴性对照组、空白对照组细胞凋亡率分别为(3.2±1.3)％、(15.2±2.4)％、(17.3±1.9)％。HtrA1 siRNA组 细胞凋亡率较阴性对照组、空白对照组明显减少，差异有统计学意义(t=23.37、29.08，P<0.05)；阴性对照组、空白对照组间细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(t=7.32，P>0.05)(图 5)。HtrA1 siRNA组G0/G1期细胞数较阴性对照组和空白对照组明显增加，差异有统计学差异(t=6.24、4.93，P<0.05)(图 6)。
图5
Annexin V-FITC / PI双染法流式检测各组细胞凋亡情况。5A.各组细胞凋亡情况；5B.各组凋亡细胞统计图。P<0.05
图6
各组细胞G0/G1期细胞比例。P<0.05
RT-PCR检测结果显示，HtrA1 siRNA组细胞HtrA1(t=17.36、11.32)、VEGF-A(t=7.29、4.05) mRNA表达较阴性对照组和空白对照组明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组、空白对照组间细胞HtrA1、VEGF-A mRNA表达比较，差异无统计学意义(t=3.41、1.89，P>0.05)(图 7)。
图7
各组细胞HtrA1及VEGF-A的mRNA表达情况。P<0.05
Western blot检测结果显示，HtrA1 siRNA组 细胞HtrA1(t=12.02、15.28)、VEGF-A(t=4.98、6.24)蛋白表达较阴性对照组和空白对照组明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组、空白对照组间细胞HtrA1、VEGF-A蛋白表达比较，差异无统计学意义(t=2.65、2.07，P>0.05)(图 8)。
图8
各组细胞HtrA1及VEGF-A蛋白表达情况。8A.阴性对照组、空白对照组及HtrA1 siRNA组HtrA1及VEGF-A蛋白表达电泳图；8B. 各组HtrA1蛋白及VEGF-A表达统计图。P<0.05
3 讨论
RPE细胞结构和功能的改变是AMD和CNV发生发展的重要因素，可见光及紫外线尤其是光谱中的蓝光可对RPE细胞产生光化学损伤[4, 5]。本研究为观察RPE细胞结构和功能的变化，排除动物模型的种属差异、多种体内因子影响，参考之前使用的蓝光照射培养的ARPE-19细胞方法建立RPE细胞光损伤模型。
HtrA1是一种分泌蛋白，在胎盘、骨骼组织、血管以及眼等多种正常组织均有表达[8]。在卵巢癌、黑色素瘤、肺癌等多种恶性肿瘤中呈低表达状态，被认为是一种肿瘤抑制基因；在骨关节炎、类风湿性关节炎、AMD等中表达则增高[2, 9]。有研究结果显示，萎缩型和渗出型AMD的玻璃膜疣中HtrA1表达均增高[2]。Pei等[10]研究发现沉默HtrAl后，RPE细胞的增生、迁徙能力下降。本研究通过siRNA干扰技术沉默光损伤模型细胞中HtrAl的表达，通过CCK-8、transwell小室法及流式细胞仪观察干扰后RPE细胞的增生、迁徙、凋亡以及细胞周期的变化。结果显示，HtrAl siRNA组细胞增生、迁徙能力及凋亡率均较对照组明显下降，停留在G0/G1期的细胞数明显增加。本研究结果与Pei等[10]研究结果相似。但Supanji等[11]研究发现RPE细胞在双氧水氧化应激状态下，HtrA1表达增高，对细胞衰老有促进作用，对细胞凋亡并未见促进作用。引起细胞衰老死亡的趋势相同，但是却以衰老变化为主，原因是所采用的的模型类型差别引起。
有研究发现HtrAl产物可以参与调节细胞外基质的降解，通过阻断转化生长因子-β信号通路从而作用于形成玻璃膜疣的细胞外基质组成成分Bruch膜进而参与CNV的形成[12]。近年研究发现，上调小鼠RPE层HtrAl的表达可引起脉络膜血管出现AMD中相似的异常变化；在过表达HtrAl的转基因小鼠中，CNV风险增高[3, 13]。Ng等[14]发现AMD患者房水以及应激炎症状态下胎儿RPE细胞中HtrA1及VEGF同时增高。VEGF-A在CNV的形成中发挥重要作用，前期有研究也证实VEGF-A在蓝光RPE细胞损伤模型中表达增高[15]。本研究结果显示光损伤模型组细胞中HtrA1 mRNA、蛋白表达均较正常对照组明显增高。siRNA干扰技术沉默HtrA1后，HtrAl siRNA组HtrA1、VEGF-A mRNA和蛋白表达均较阴性对照组和空白对照组明显下降。提示在蓝光损伤模型中干预HtrA1表达后VEGF表达也同时下降，二者可能存在一定关联，有待进一步研究。
