目的 構(gòu)建轉(zhuǎn)化生長因子 β3(transforming growth factor β3,TGF-β3)的腺病毒載體,并通過腺病毒載體將TGF-β3基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs),使其在細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)。方法 將人TGF--3質(zhì)粒定向克隆進(jìn)入穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV中,與pAdEasy1共同轉(zhuǎn)入細(xì)菌并重組,獲得TGF-β3重組腺病毒質(zhì)粒,用脂質(zhì)體法導(dǎo)入包裝細(xì)胞HEK293中,48~96 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。取1 月齡新西蘭大白兔5 只,取其脛骨骨髓。采用密度梯度離心法分離純化MSCs,并進(jìn)行傳代。取傳至第3代細(xì)胞采用TGF-β3腺病毒載體轉(zhuǎn)染,10 h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá),轉(zhuǎn)染TGF-β3重組腺病毒4d后的MSCs用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察TGF-β3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果 pAdEasy-TGF-β3轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞48~96 h后,熒光顯微鏡可見明顯的綠色熒光表達(dá)。 兔骨髓分離培養(yǎng)10 d 后,培養(yǎng)MSCs融合達(dá)70%~80%、貼壁緊密,細(xì)胞形態(tài)均一,似成纖維細(xì)胞;14 d 完成原代細(xì)胞培養(yǎng)。TGF-β3重組腺病毒轉(zhuǎn)染MSCs 17 h 后,熒光顯微鏡下出現(xiàn)少量綠色熒光,48~72 h 熒光加強,熒光與MSCs輪廓一致。免疫細(xì)胞化學(xué)觀察,轉(zhuǎn)染TGF-β3重組腺病毒MSCs胞漿內(nèi)有棕黃色陽性顆粒表達(dá)。結(jié)論 TGF-β3基因重組腺病毒載體的成功構(gòu)建并在MSCs內(nèi)的表達(dá),為創(chuàng)傷愈合的基因治療提供了研究基礎(chǔ)。
【摘 要】 目的 通過將轉(zhuǎn)染TGF-β3c2s2 基因的兔BMSCs 移植于兔耳瘢痕模型,觀察轉(zhuǎn)基因BMSCs 對創(chuàng)面愈合后增生性瘢痕形成的影響。 方法 成年健康日本大耳白兔20 只,體重1.7 ~ 2.5 kg,雌雄不拘。取第3 代兔BMSCs,經(jīng)Ad-TGF-β3c2s2 在感染復(fù)數(shù)150 下轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)孵育24 h 后,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL 備用。將純化、濃縮的Ad-TGF-β3c2s2顆粒,DMEM/F12(不含F(xiàn)BS)稀釋為1×108 pfu/mL 備用。于20 只日本大耳白兔雙側(cè)兔耳分別制備兩個2 cm × 2 cm 大小的腹側(cè)全層皮膚、軟骨缺損創(chuàng)面。將每只兔的4 個創(chuàng)面隨機分為空白對照組(A組)、Ad-TGF-β3c2s2 組(B組)、BMSCs 組(C組)和BMSCs/Ad-TGF-β3c2s2 組(D 組),并以自身正常皮膚作為正常對照(E 組)。將備好的細(xì)胞及病毒液分別按創(chuàng)面分組進(jìn)行局部移植。于術(shù)后21、45、90 d 行大體觀察、瘢痕硬度和厚度測定、HE 染色和免疫組織化學(xué)檢測。 結(jié)果 大體觀察:A、B、C 組上皮化后創(chuàng)面均逐漸形成不同程度的瘢痕,傷后45 d 瘢痕增生程度達(dá)高峰,明顯高出皮膚表面,持續(xù)至90 d,D 組在觀察期內(nèi)均無明顯高出周圍皮膚的瘢痕形成。術(shù)后45 d 和90 d,A、B、C 組瘢痕厚度和硬度明顯高于D 組,且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.01),而B 組低于A、C 組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.01);D 組愈合后創(chuàng)面厚度和硬度與正常皮膚接近。HE 染色觀察:A、C 組傷后45 d 可見淺層組織結(jié)構(gòu)排列紊亂,膠原纖維粗大,呈交錯網(wǎng)織狀排列;B 組和D組結(jié)構(gòu)與正常皮膚接近,但較E 組膠原排列致密,表皮較A、C 組??;90 d 各組結(jié)構(gòu)與45 d 相似。BrdU 免疫組織化學(xué)觀察,傷后21、45 d,C、D 組均能見到散在分布、胞核染色陽性的棕色細(xì)胞,A、B、E 組均為陰性。 結(jié)論 創(chuàng)面局部移植人TGF- β3c2s2 基因修飾的BMSCs,具有抑制創(chuàng)面愈合后增生性瘢痕的作用。
本研究目的是探討超順磁性殼聚糖FGF-2明膠微球(SPCFGM)對小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化作用的影響。采用化學(xué)共沉淀法制備超順磁性氧化鐵殼聚糖納米粒子(SPIOCNs),與質(zhì)粒FGF-2結(jié)合后,用乳化交聯(lián)法制備SPCFGM和不含質(zhì)粒FGF-2的超順磁性殼聚糖明膠微球(SPCGM),激光粒度分析儀和透射電鏡檢測SPCFGM、SPIOCNs表征,測定SPCFGM的載藥量、包封率及體外釋放活性,分別用等量SPCFGM、SPCGM、加入C3H10細(xì)胞培養(yǎng)基中,設(shè)SPCFGM組、SPCGM組、空白對照組3組細(xì)胞。DAPI染色觀察細(xì)胞凋亡,Western blot法驗證各組FGF-2的表達(dá)水平,CCK8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的增殖活力及細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示:SPIOCNs微粒和SPCFGM微球都呈球形,粒徑分別為(25±9) nm和(140±12) μm。SPCFGM的載藥量為57.13%±5.41%,包封率為69.97%±0.04%。3組細(xì)胞無凋亡形態(tài),SPCFGM組FGF-2蛋白水平表達(dá)較其它兩組明顯增高,細(xì)胞增殖活力明顯增高(P<0.05)。SPCFGM可釋放FGF-2,并保持FGF-2的生物活性,促進(jìn)C3H10細(xì)胞增殖分化,對細(xì)胞無毒副作用。