四川大學華西醫(yī)院趙旭東團隊于2019年11月在Cancer Immunology Research（影響因子8.619）發(fā)表文章“Eradication of Hepatocellular Carcinoma by NKG2D-Specific CAR-T Cells”（長按下方二維碼即可閱讀全文）。
。。。。據國家癌癥中心發(fā)布的2015年我國惡性腫瘤數據顯示，肝癌新發(fā)病例37萬，位居惡性腫瘤第四位，死亡病例32.6萬，位居惡性腫瘤第二位。目前常規(guī)治療手段對治愈晚期肝癌患者并不顯著，因此急需其它更有效的治療方式。嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T）是一種新型的免疫療法，目前在血液惡性腫瘤中取得了巨大成功，有望拓展至實體瘤研究領域。但實體瘤由于存在腫瘤異質性、缺少腫瘤特異性抗原、免疫抑制微環(huán)境等問題限制了CAR-T的應用。。。。。。四川大學華西醫(yī)院趙旭東團隊于2019年11月在Cancer Immunology Research（影響因子8.619）發(fā)表文章“Eradication of Hepatocellular Carcinoma by NKG2D-Specific CAR-T Cells”（長按下方二維碼即可閱讀全文）。。。。。
NKG2D是一類表達于NK細胞、CD8+T細胞、部分CD4+T細胞、γδ T細胞等的一類分子。它的配體主要有MICA、MICB、ULBP1-6等，且一般在正常細胞不表達而在腫瘤細胞中高表達。通過分析TCGA數據庫發(fā)現：大部分NKG2DLs在肝癌樣本中高表達，且我們在人肝癌樣本芯片（圖1）及人肝癌細胞系（SMMC-7721及MHCC97H）中檢測到MICA和ULBP2的高表達，這提示NKG2DLs可作為肝癌的靶點。因此我們構建了NKG2D-BBz CAR并制備CAR-T細胞，發(fā)現NKG2D-BBz CAR-T對肝癌細胞系的殺傷依賴于NKG2DL的表達（圖2）。
圖1 NKG2D配體MICA(A)及ULBP2（B）在肝癌樣本中的表達
圖2 NKG2D-BBz CART殺傷依賴于NKG2DL表達
除此之外，我們將SMMC-7721-luciferase細胞注射到NDG小鼠皮下，一周后尾靜脈回輸CART細胞。體內實驗結果表明：NKG2D-BBz CART能顯著抑制SMMC-7721裸鼠移植瘤的發(fā)生發(fā)展（圖3）。我們將瘤體組織做免疫組化染色發(fā)現：與對照組相比，NKG2D-BBz CART細胞在腫瘤內部存在大量聚集并裂解腫瘤細胞。
圖3 NKG2D-BBz CAR-T 抑制肝癌的發(fā)生
綜上所述，體內、體外實驗均證實了NKG2D-BBz CART細胞能特異性殺傷NKG2DL陽性的肝癌細胞。Celyad的NKG2D-CART臨床I期證據表明NKG2D-CART在7例急性髓系白血病和5例多發(fā)性骨髓瘤病人中沒有產生毒性及副作用。因此，NKG2D-CART有望發(fā)展成臨床治療NKG2DL陽性肝癌的有效方式之一。
專家點評
王瑋教授：我國每年新增肝癌病例數和死亡病例數，均占全球新增病例數和死亡病例數的一半以上，防治形勢十分嚴峻。目前晚期肝癌患者通常只能選擇化療藥物例如索菲替尼和瑞格非尼進行保守治療，而且僅僅只增加2-3個月的生存期。因此迫切需要開發(fā)新穎的、更有效的治療晚期肝癌的方法。近年來，以CD19為靶點的嵌合抗原受體T細胞免疫療法（chimeric antigen receptor modified T,CAR-T）在治療血液系統(tǒng)腫瘤中取得了顯著的療效，以GPC3等為靶點的CAR-T細胞治療產品在治療肝癌等實體腫瘤過程中也顯示了較好的臨床應用前景。本論文作者以NKG2D胞外域為識別域，41-BB和CD3ζ為共刺激信號構建的嵌合抗原受體T細胞，對NKG2D 配體表達陽性的肝癌細胞株在體內和體外均具有極強的殺傷作用，且抗腫瘤效果與NKG2D 配體表達呈正相關。重要的是，本論文的研究者成功地完成了病人來源的T細胞的CAR-T細胞制備，為該CAR-T細胞的臨床應用奠定了技術基礎。
目前已經有多個靶點被用作肝癌的CAR-T治療，例如GPC-3、 MUC-1 、CEA等，但是效果并不理想。肝癌作為實體瘤，其嚴重的異質性和強大的免疫抑制微環(huán)境被認為是限制CAR-T應用的主要原因。基于NKG2D構建的CAR-T細胞，能夠識別多種NKG2D配體，可在一定程度上克服實體瘤的異質性；其次，該CAR-T細胞被證實對腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細胞和新生血管細胞也有殺傷作用，讓我們不免對它的臨床治療效果又多了幾分期待。當然，目前CAR-T治療肝癌的應用還處于探索階段，對于CAR-T的有效性和安全性還需要更多的研究；特別是對于可溶性NKG2DL、腫瘤細胞的NKG2D 逃逸等對NKG2D CAR-T的治療效果的影響也應給予更多的關注。
王瑋，博士，副研究員， Plos one雜志編委?，F任職于四川大學生物治療國家重點實驗室/生物治療協(xié)同創(chuàng)新中心/國家綜合新藥研發(fā)大平臺, 基因免疫細胞治療室主任。王瑋多年來從事腫瘤和自身免疫性疾病等的基因及免疫細胞治療，主要致力于通過基因工程手段，將病人自體免疫細胞進行定向修飾從而賦予免疫細胞靶向治療潛能，工作的重點是利用嵌合型抗原受體（CAR）對T細胞進行修飾并實現其臨床應用。目前帶領的研發(fā)團隊已經建立了完整的規(guī)?；疌AR-T細胞臨床制備平臺，開展了靶向EpCAM、HER2、CD22、Mesothelin、CD24等多種實體腫瘤的CART細胞基礎研究和臨床轉化研究，其中，CD19 CAR-T、EpCAM CAR-T等已經開展了臨床試驗研究并顯示較好的安全性和明確的抗腫瘤活性。同時多項CAR-T研究成果已經轉讓給百年聚集團、銀河生物集團等制藥企業(yè)，共同推進CAR-T藥物的研發(fā)，其中轉讓給銀河生物集團的CAR-T品種已經從國家藥監(jiān)局獲得了新藥臨床試驗研究申請（IND）批件；同時，已經創(chuàng)立了Cygenpeutics、CarEne等研發(fā)企業(yè)，致力于推進CAR-T細胞治療及相關產品的產業(yè)化。相關工作已經在腫瘤的靶向治療等領域已經以第一作者/通訊作者等發(fā)表SCI論文30余篇，申請發(fā)明專利5項，作為項目負責人承擔了國家自然科學基金、國家重點研發(fā)計劃、國家高技術發(fā)展項目（863計劃）、四川省科技基金等項目。
專家點評
王春暉教授：據2018年發(fā)布的《中國肝癌大數據報告》顯示：原發(fā)性肝癌全球每年新發(fā)病例85.4萬，中國46.4萬，約占全球的55%。早期確診的肝癌患者經過有效治療，5年的生存率超過50%。在我國肝癌患者早期診斷率低，很多患者一經確診就已經處于中晚期，錯過了治療黃金期。免疫療法被認為是最有前景的腫瘤治療手段之一。CAR-T療法已經成功應用于臨床非實體瘤的治療，但實體瘤由于存在異質性、免疫抑制微環(huán)境等限制了其應用。目前已有GPC3、AFP、MUC1、CEA等靶點的CART在肝癌臨床前研究中的報道，均尚未完成臨床試驗。
近期，趙旭東研究員團隊以NKG2D配體（NKG2DLs）為靶點，創(chuàng)新性探討了NKG2D-CART在肝癌中的潛在價值。該研究具有以下亮點：1）通過TCGA數據庫與人肝癌樣本中發(fā)現NKG2DLs高表達，而人正常組織中NKG2DLs低表達。這指示NKG2DL可作為治療肝癌的潛在靶點。2）研究人員制備的NKG2D-BBz CART細胞能顯著殺傷NKG2DLs高表達的肝癌細胞系并抑制腫瘤生長。3）肝癌患者自身免疫細胞活性較低，用患者自身T細胞制備CAR-T細胞時會影響其活性。為此，研究人員分離并制備了肝癌患者來源的NKG2D-BBz CART細胞，實驗結果表明，上述病人來源的NKG2D-BBz CAR-T細胞也能顯著殺傷肝癌細胞并抑制腫瘤生長。
綜上所述，論文系統(tǒng)地研究了NKG2D-BBz CART對肝癌的抑制效果，如果通過臨床試驗證明其安全性，有望發(fā)展為臨床上治療NKG2DL陽性肝癌的新手段。
王春暉，博士、四川大學華西醫(yī)院消化內科教授、博士生導師。四川省有突出貢獻的優(yōu)秀專家，四川省衛(wèi)生健康委學術和技術帶頭人，中國醫(yī)師協(xié)會消化醫(yī)師分會常務委員，四川省醫(yī)師協(xié)會消化醫(yī)師分會第三屆會長，中國醫(yī)師協(xié)會介入醫(yī)師分會委員，四川省醫(yī)學會消化內鏡專委會副主任委員，四川省抗癌協(xié)會腫瘤內鏡專委會副主任委員。長期從事消化系統(tǒng)疾病基礎及臨床研究，主持國家自然科學基金面上項目2項，省部級課3項。在Am J Physiol Cell 及Am J Physiol GI 等傳統(tǒng)學術期刊發(fā)表SCI論文20余篇。先后獲得四川省科技進步一等獎及二等獎各1項。
作者投稿心得
Cancer Immunology Research由美國癌癥協(xié)會（AACR）于2013年主辦，主要刊登腫瘤免疫領域的原創(chuàng)性成果，五年影響因子9.7。我們根據實驗數據及分析腫瘤免疫領域的主流期刊就確定投稿此雜志。在投稿兩個月后收到修改通知：要求在3個月內完成3個體外實驗以及1個動物實驗。在每位團隊成員的共同努力下，終于我們按時修回文章并于一個月后收到接收通知。
總體來說，首先對自己實驗數據的認識及能發(fā)表雜志的定位至關重要。其次團隊協(xié)作非常重要，我們團隊每個成員都具有豐富的從事腫瘤相關領域的經驗，在此基礎上每個人又有自己擅長的實驗技能。團隊協(xié)作能力強，才能在最短的時間內完成各項試驗。再者，針對每個審稿專家提的意見和建議，我們逐條認真回復。
通信作者
趙旭東，腫瘤動物模型創(chuàng)制及應用研究室主任、研究員、博士生導師；云南省免疫學會理事長，云南省實驗動物學會副理事長，中國細胞生物學青年工作委員會會員。2005-2011年在哥倫比亞大學從事博士后研究，2011-2018年在中國科學院昆明動物研究所工作，任學科組長和靈長類中心主任。2012年入選中組部青年千人計劃、云南省高端科技人才計劃，2016年獲國家特聘專家稱號、2018年度國務院政府特殊津貼等榮譽。先后承擔和完成國家級、部省級科研項目10余項，已在Nat Cell Biol、Nat Commun、Dev Cell、Cancer Res、Cancer Immunol Res等刊物發(fā)表論文30余篇，獲授權發(fā)明專利 2 項。
Email：zhaoxudong@wchscu.cn
第一作者介紹
第一作者為孫彬、楊東、代紅久
團隊簡介
本課題組以華西醫(yī)院/生物治療國家重點實驗室平臺為依托，主要致力于小鼠及非人靈長類新型腫瘤模型的建立；并以其為研究對象開展腫瘤早期診斷、抗腫瘤和衰老藥物發(fā)現以及腫瘤免疫治療等研究。目前實驗室研究團隊包括1名研究員、3名助理研究員、1名博士后等11位成員。
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本文編輯：汪文靜
本文排版：陳紅梅 張洪雪