目的 構(gòu)建可經(jīng)米非司酮（RU486）調(diào)控表達(dá)小鼠白細(xì)胞介素-12(mIL-12)單鏈融合基因的真核載體, 并鑒定其調(diào)控表達(dá)效果。方法 以GCp35Ep40PN質(zhì)粒為模板，分別獲取mIL-12 p40和p35亞基的基因, 重疊PCR引入linker后,克隆入pCA14質(zhì)粒,測(cè)序正確之后，裝入可調(diào)控載體pRS-17而構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒pRS-RUmIL-12。用Lipofectamine 2000將pRS-RUmIL-12質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，以不同劑量的RU486誘導(dǎo)其表達(dá)，然后用ELISA法檢測(cè)其培養(yǎng)上清液中mIL-12蛋白的含量。結(jié)果 所得mIL-12單鏈融合基因序列與設(shè)計(jì)一致。pRS-RUmIL-12在體外轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，ELISA檢測(cè)結(jié)果表明該系統(tǒng)具有良好的調(diào)控能力: 無(wú)誘導(dǎo)劑RU486時(shí)，mIL-12蛋白表達(dá)量很低，而加入誘導(dǎo)劑RU486后，可以誘導(dǎo)mIL-12的表達(dá)，并在一定范圍內(nèi)mIL-12的蛋白表達(dá)量與誘導(dǎo)劑的濃度呈正相關(guān)。結(jié)論 成功構(gòu)建了可經(jīng)RU486調(diào)控的mIL-12雙亞基共表達(dá)的真核表達(dá)質(zhì)粒,可用于進(jìn)一步的基因調(diào)控和基因治療研究。
目的對(duì)單純皰疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素進(jìn)行基因擴(kuò)增，克隆構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/HSVⅡ TK/As。方法從單純皰疹病毒Ⅱ型（HSVⅡ）Sav株感染的Hep2細(xì)胞上清液中提取HSV2基因組DNA，以此為模板，用PCR方法擴(kuò)增胸苷激酶（TK）基因，將擴(kuò)增的片段克隆入載體pcDNA3中，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。限制性核酸內(nèi)切酶酶切pcDNA3/HSVⅡTK,得到目的基因TK，將其克隆于已構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3/As上。結(jié)果HSVⅡTK基因全部編碼區(qū)為1 128 bp，基因序列與genebank中報(bào)道相符。新質(zhì)粒pcDNA3/HSVⅡTK/As經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶(BamH Ⅰ,Hind Ⅲ)酶切后得到700 bp(As)及1000 bp(HSVⅡTK)相應(yīng)基因片段。結(jié)論本研究成功構(gòu)建pcDNA3/HSVⅡTK/As真核表達(dá)質(zhì)粒。
目的 分析急性淋巴細(xì)胞白血病（ ALL） 糖原染色（ PAS） 的陽(yáng)性率，與細(xì)胞免疫分型、融合基因分析結(jié)果進(jìn)行比較，探索PAS在ALL診斷中的應(yīng)用價(jià)值。 方法 回顧性分析我院自2010年1月－2012年5月初發(fā)ALL患者124例，統(tǒng)計(jì)分析其PAS染色、細(xì)胞免疫分型、斷裂點(diǎn)叢集區(qū)基因-abesine鼠白血病基因（BCR-ABL）融合基因、外周血象及相關(guān)臨床資料。 結(jié)果 50 例經(jīng)細(xì)胞免疫分型診斷為早期前B型急性淋巴細(xì)胞白血?。≒ro-B ALL）的患者，PAS反應(yīng)陽(yáng)性者30例（60%）；42例經(jīng)細(xì)胞免疫分型診斷為普通型急B性淋巴細(xì)胞白血?。–ommon-B ALL）的患者，PAS反應(yīng)陽(yáng)性者23例（55%）；32例經(jīng)細(xì)胞免疫分型診斷為急性T淋巴細(xì)胞白血（T-ALL）的患者，PAS陽(yáng)性者12例（37%）。分析顯示T-ALL患者PAS的陽(yáng)性率明顯低于Common-B ALL和Pro-B ALL的患者（P＜ 0.05），Common-B ALL和Pro-B ALL之間PAS陽(yáng)性率差異無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。38 例BCR-ABL融合基因陽(yáng)性的ALL患者，PAS反應(yīng)陽(yáng)性者18例（47%）；86例BCR-ABL融合基因陰性的ALL患者，PAS反應(yīng)陽(yáng)性者47例（55%），BCR-ABL融合基因陽(yáng)性和陰性?xún)山M比較，PAS陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)論 PAS 在ALL患者有較高的陽(yáng)性率，B-ALL中PAS陽(yáng)性率顯著高于T-ALL，PAS可作為一種經(jīng)濟(jì)快速的ALL診斷及免疫亞型初步診斷的輔助手段。
目的 研究pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤模型的靶向性治療作用。方法 建立人原發(fā)性肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分成腫瘤對(duì)照組、空質(zhì)粒組、丙氧鳥(niǎo)苷(GCV）組、pcDNA3/TK/Angio組及pcDNA3/AFP/TK/Angio組5組。于瘤體內(nèi)分別直接注射不同的質(zhì)粒，同時(shí)于裸鼠腹腔內(nèi)注射GCV，觀察不同時(shí)段皮下腫瘤的生長(zhǎng)情況并做病理學(xué)檢查，免疫組化法檢測(cè)腫瘤微血管密度（MVD）以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)量，原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)細(xì)胞原位凋亡。放免法檢測(cè)裸鼠血清甲胎蛋白（AFP）的變化，透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 裸鼠皮下成瘤率100%； pcDNA3/TK/Angio組及pcDNA3/AFP/TK/Angio組的腫瘤體積、血清AFP含量、腫瘤MVD和VEGF表達(dá)強(qiáng)度均明顯低于對(duì)照組、空質(zhì)粒組和GCV組（P＜0.05），細(xì)胞凋亡指數(shù)都明顯高于后3組（P＜0.05），可見(jiàn)較多的凋亡細(xì)胞。而pcDNA3/AFP/TK/Angio組的腫瘤體積、AFP、MVD及VEGF表達(dá)強(qiáng)度又明顯低于pcDNA3/TK/Angio組（P＜0.05），凋亡指數(shù)高于后者（P＜0.05）。結(jié)論 pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因系統(tǒng)可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，有望成為治療原發(fā)性肝癌的新型生物制劑之一。