目的對單純皰疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素進行基因擴增，克隆構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3/HSVⅡ TK/As。方法從單純皰疹病毒Ⅱ型（HSVⅡ）Sav株感染的Hep2細胞上清液中提取HSV2基因組DNA，以此為模板，用PCR方法擴增胸苷激酶（TK）基因，將擴增的片段克隆入載體pcDNA3中，挑取陽性克隆測序。限制性核酸內(nèi)切酶酶切pcDNA3/HSVⅡTK,得到目的基因TK，將其克隆于已構(gòu)建的真核表達載體pcDNA3/As上。結(jié)果HSVⅡTK基因全部編碼區(qū)為1 128 bp，基因序列與genebank中報道相符。新質(zhì)粒pcDNA3/HSVⅡTK/As經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶(BamH Ⅰ,Hind Ⅲ)酶切后得到700 bp(As)及1000 bp(HSVⅡTK)相應基因片段。結(jié)論本研究成功構(gòu)建pcDNA3/HSVⅡTK/As真核表達質(zhì)粒。
【摘要】 目的 觀察已構(gòu)建的含胸苷激酶（TK）自殺基因的重組腺病毒（ADV-TK）對肝癌細胞的體外殺傷作用和對肝癌裸鼠移植瘤的治療效果。 方法 將ADV-TK體外感染人肝癌細胞株SMMC-7721，噻唑藍（MTT）法檢測受感染的SMMC-7721細胞被不同濃度更昔洛韋（GCV）作用后的細胞存活率情況。構(gòu)建肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤模型，觀察腫瘤注射重組腺病毒ADV-TK結(jié)合GCV治療移植瘤的變化。 結(jié)果 相同滴度的重組腺病毒與不同濃度的GCV作用于肝癌細胞株SMMC-7721后，MTT法檢測到細胞的存活率隨著GCV濃度的增加而不斷降低。動物實驗中ADV-TK治療組腫瘤體積明顯小于對照組（ADV-null及NS）（Plt;0.01）。 結(jié)論 重組腺病毒ADV-TK對肝癌SMMC-7721細胞的體外增殖和裸鼠體內(nèi)的移植瘤生長均有明顯的抑制作用。【Abstract】 Objective To explore the inhibitory effect of recombinant adenovirus containing TK gene (ADV-TK) on transfected human liver cancer cells SMMC-7721 in vitro and murine transplanted hepatocarcinoma in vivo. Methods SMMC-7721 cells transfected with ADV-TK were exposed to medium with GCV. The cell viability was measured by MTT assays. In the established model of SMMC-7721 human liver cancer, nude mice underwent intratumoral injection with 1 109 pfu ADV-TK, the control vector (ADV-null) or normal saline (NS) and again 7 days later, twice for all. GCV was given at a dose of l00 mg/(kg?d) on the following day of injection for 10 days. The tumor inhibitory effect was observed by measuring the tumor sizes. Results After transfected by ADV-TK in vitro, and combined with GCV, the cell growth of SMMC-7721 cell were significantly suppressed. The result of in vivo assay showed that tumor volumes in treatment group were apparently smaller than that in the control group (Plt;0.01). Conclusion Recombinant adenovirus combined with GCV shows a significant inhibitory effect on SMMC-7721 cells in vitro and murine transplanted hepatocarcinoma in vivo.
目的 應用基因重組技術(shù)，構(gòu)建含胸苷激酶（tk）自殺基因的復制缺陷型腺病毒（ADV-tk），為進一步研究tk自殺基因?qū)δ[瘤的抑制作用奠定基礎(chǔ)。方法 采用細胞內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶tk基因的ADV-tk，經(jīng)PCR鑒定正確后進行擴增、純化和滴度測定。重組腺病毒ADV-tk體外轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC-7721細胞，RT-PCR檢測tk基因的整合和表達。建立裸鼠人肝癌動物模型，腹腔注射ADV-tk，熒光顯微技術(shù)觀察ADV-tk基因在肝臟的轉(zhuǎn)染情況和對腫瘤細胞的抑制作用。結(jié)果 構(gòu)建的重組腺病毒中帶有tk基因，經(jīng)擴增、純化后測得重組腺病毒滴度為1.4×1010 pfu/ml。ADV-tk體外轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞后，RT-PCR檢測顯示tk基因在細胞中整合并且有效表達。體內(nèi)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADV-tk在肝臟有明顯轉(zhuǎn)染，腫瘤組織中凋亡細胞明顯增多。結(jié)論 本研究構(gòu)建的攜帶tk基因的復制缺陷型腺病毒獲得成功，可用于下一步研究。
目的探討以腺病毒為載體介導胸苷激酶（tk）基因?qū)o脈平滑肌細胞增殖及內(nèi)膜增生的抑制作用。方法腺病毒載體攜tk及β半乳糖苷酶（lacZ）基因轉(zhuǎn)染人的大隱靜脈平滑肌細胞及大隱靜脈片,以不同濃度的更昔洛韋（GCV）培養(yǎng)。通過Xgal染色觀察標記基因lacZ的表達效率。將轉(zhuǎn)染tk基因陽性與tk基因陰性的平滑肌細胞以不同的比例混合培養(yǎng)觀察旁觀者效應。將轉(zhuǎn)染tk基因的靜脈片在含有GCV的培養(yǎng)液中培養(yǎng)14 d，取標本進行HE、VG染色，輔以計算機圖像分析，觀察內(nèi)膜增生情況。結(jié)果腺病毒載體能有效地轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的平滑肌細胞和靜脈片中的平滑肌細胞，外源基因表達持續(xù)14 d。平滑肌細胞增殖受抑制程度與GCV的濃度和tk表達的水平呈正相關(guān)。轉(zhuǎn)染lacZ的平滑肌細胞則不被GCV抑制。混合細胞培養(yǎng)（tk陽性及tk陰性細胞混合），當10%的細胞表達tk基因時，細胞生存率下降了55%。在靜脈片培養(yǎng)實驗中，tk/GCV組與對照組（lacZ/GCV和tk/GCV-）比較，前者內(nèi)膜增生60%受到抑制。 結(jié)論tk基因合并GCV治療具有抑制平滑肌細胞增殖和移植靜脈內(nèi)膜增生的作用, tk基因治療具有旁觀者效應。