目的 觀察T 淋巴細胞瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1 ( Tiam 1) 反義寡核苷酸(ASODN) 轉(zhuǎn)染對胃癌細胞形體重塑的影響。方法 采用層粘連蛋白黏附法,由胃癌MKN245 細胞株(M0 ) 中篩選獲得高侵襲轉(zhuǎn)移亞株(MH ) 。以脂質(zhì)體介導(dǎo)將Tiam 1 ASODN 轉(zhuǎn)染至MH 細胞中,并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT2PCR) 及流式細胞技術(shù)分別檢測Tiam 1 mRNA 和蛋白的表達。采用HE 染色、細胞骨架蛋白染色及掃描電鏡技術(shù)觀察轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染MH 細胞在形態(tài)學(xué)方面的不同。結(jié)果 與未轉(zhuǎn)染組相比,應(yīng)用0. 43μmol/ L Tiam 1 ASODN 轉(zhuǎn)染可特異性抑制胃癌MH細胞中Tiam 1 mRNA 和蛋白的表達( Plt; 0. 01) ; 轉(zhuǎn)染MH 細胞的膜表面突起及偽足變稀疏或縮短,細胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂程度降低,斑點狀肌動蛋白小體減少。結(jié)論 特異性ASODN 轉(zhuǎn)染可有效抑制Tiam 1 在胃癌細胞中的表達及胃癌細胞形體重塑,這可能對胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。
目的 在體外實驗研究的基礎(chǔ)上進一步觀察反義硫代磷酸酯寡核苷酸（ASODN）在裸鼠體內(nèi)逆轉(zhuǎn)耐藥肝癌細胞SMMC-7721/ADM多藥耐藥基因mdr1的作用。 方法 取體外培養(yǎng)的耐藥肝癌細胞（1×107個/0.2 ml）注射于裸小鼠腋部皮下，建立耐藥肝癌模型，而后將成模裸鼠分成4組，每組各5只。ASODN組在裸鼠腫瘤局部注射濃度為3 μmol/L的ASODN 50 μl和脂質(zhì)體Lipofectamine 50 μl，并在腹腔內(nèi)注射阿霉素(ADM，每天10 mg/m2)； 正義鏈組（SODN組）與ASODN組的方法、劑量相同； 對照1組、對照2組分別在裸鼠局部注射Lipofectamine 50 μl和生理鹽水200 μl，同時腹腔注射ADM(每天 10 mg/m2)。寡核苷酸于觀察的兩周內(nèi)每周前3 d注射； ADM于每周的第2～4天使用。Lipofectamine和生理鹽水使用時間與寡核苷酸相同。 結(jié)果 隨著時間的推移，4組裸鼠的腫瘤體積逐漸增大，且于第5天開始變化明顯，此后各時相之腫瘤體積與前一時相比較，差異均有顯著性意義（P＜0.05）； ASODN組的腫瘤體積在第5天后明顯小于其他3組（P＜0.05）； 而對照1組、對照2組及SODN組各時相的腫瘤體積差異無顯著性意義（Pgt;0.05）。該實驗結(jié)果提示，SODN及脂質(zhì)體對裸鼠腫瘤的生長無明顯影響，而ASODN對裸鼠腫瘤的生長具有明顯的抑制作用。 結(jié)論 ASODN在體內(nèi)同樣可逆轉(zhuǎn)SMMC-7721/ADM細胞的耐藥性,使腫瘤在一定時間內(nèi)處于生長相對緩慢狀態(tài)。
目的觀察脂質(zhì)體介導(dǎo)增殖細胞核抗原（PCNA）對肝癌細胞增殖的影響。 方法根據(jù)PCNA cDNA序列設(shè)計合成與PCNA mRNA AUG起始密碼子后的18位堿基序列互補的PCNA反義寡核苷酸，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株，通過細胞生長曲線測定，MTT比色法檢測PCNA反義寡核苷酸對人肝癌細胞的生長抑制率，比較陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法與直接轉(zhuǎn)染法的區(qū)別。 結(jié)果PCNA反義寡核苷酸作用后的肝癌細胞，生長明顯受到抑制。應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染能顯著提高PCNA反義寡核苷酸的抑增殖效應(yīng)。結(jié)論利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PCNA反義寡核苷酸能顯著提高對人肝癌細胞增殖的抑制效應(yīng)。
目的 研究反義硫代磷酸寡核苷酸(AS-ODN)抑制人肝癌細胞耐藥株(SMMC-7721／ADM)MRP基因表達的作用。方法 用人工合成互補于MRP基因mRNA特定片斷的反義硫代磷酸寡核苷酸，以脂質(zhì)體Lipofectamine為載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721／ADM細胞株，用RT-PCR測定mRNA表達，流式細胞技術(shù)測定細胞膜MRP1蛋白P190表達及MTT法檢測細胞對柔紅霉素(DNR)和阿霉素(ADM)的敏感性。 結(jié)果 AS-ODN能抑制MRP mRNA和其蛋白P190表達，提高細胞對DNR和ADM的敏感性。 結(jié)論 ①AS-ODN能降低MRP基因表達； ②MRP介導(dǎo)的多藥耐藥(MDR)是SMMC-7721／ADM耐藥的重要機理之一。
目的 觀察反義硫代磷酸寡核苷酸（ASOND）逆轉(zhuǎn)耐藥肝癌細胞的多藥耐藥作用。方法 用人工合成互補于mdrl基因5′端AUG起始密碼子的反義20聚硫代磷酸寡核苷酸，以Lipofectamine為載體，轉(zhuǎn)染人耐藥肝癌細胞SMMC-7721，MTT測定細胞對化療藥物的敏感性，通過RT-PCR檢測mRNA的表達，流式細胞儀分析P-170的表達。結(jié)果 ASOND可抑制SMMC-7721細胞mRNA及P-170的表達，增加耐藥細胞對化療藥物的敏感性，最佳ASOND作用濃度為0.5μmol/L。結(jié)論 ASOND可增加耐藥細胞對化療藥物的敏感性，部分逆轉(zhuǎn)耐藥肝癌細胞耐藥。
目的 探討核因子κB 圈套寡核苷酸( NF-κB decoy ODN) 轉(zhuǎn)染對小鼠成熟樹突狀細胞( DCs) 生物學(xué)特性的影響。方法 體外誘導(dǎo)Balb/c 小鼠骨髓細胞生成未成熟DCs( imDCs) , 經(jīng)抗原 OVA 以及LPS孵育后成為OVA 沖擊的骨髓來源成熟DCs( mDCs) , 流式細胞儀檢測DCs 表面分子CD11c 以及MHC-Ⅱ的表達予以鑒定; 將NF-κB decoy ODN 體外轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來源成熟DCs, 同時設(shè)立陰性對照組( 轉(zhuǎn)染NF-κB“變異”O(jiān)DN) 以及未轉(zhuǎn)染組, EMSA 檢測轉(zhuǎn)染后NF-κB 的活性變化; 流式細胞儀檢測各組DCs 表面共刺激分子( CD40、CD80、CD86) 的表達; 混合淋巴細胞反應(yīng)觀察各組DCs 對OVA 致敏的T淋巴細胞增殖的影響。結(jié)果 成功培養(yǎng)出骨髓來源成熟DCs; NF-κB decoy ODN 轉(zhuǎn)染DCs 的NF-κB活性明顯降低( P lt;0. 05) , DCs 表面CD40、CD80 共刺激分子的表達與陰性對照組、未轉(zhuǎn)染組比較無明顯改變( P gt; 0. 05) , 而CD86 的表達與其他各組比較明顯降低( P lt;0. 05) ; 在混合淋巴細胞反應(yīng)中,NF-κB decoy ODN轉(zhuǎn)染DCs 對T細胞的增殖有抑制作用( P lt; 0.05) , 而陰性對照組與未轉(zhuǎn)染組的DCs具有強烈的激發(fā)T細胞增殖的能力( P lt; 0. 05) 。結(jié)論 NF-κB decoy ODN 轉(zhuǎn)染DCs 可能通過CD86 的表達降低顯著抑制抗原特異性T細胞活化, 該改良的DCs 有可能用于哮喘的免疫治療。
目的采用可溶性支架將原癌基因c—myc反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染靜脈移植物，觀察其對靜脈移植物內(nèi)c—myc蛋白和增殖細胞核抗原（PCNA）蛋白產(chǎn)物表達的影響。方法50只新西蘭大耳白兔建立兔頸外靜脈頸總動脈旁路移植模型后隨機分成5組，每組10只。對照組：無支架；組1：植入單純可溶性支架；組2：植入正義c—myc寡核苷酸可溶性支架；組3：植入反義c—myc寡核苷酸可溶性支架；組4：植入不匹配c—myc寡核苷酸可溶性支架。于靜脈移植后7d、28d和90d取出靜脈移植物，采用免疫組織化學(xué)方法檢測其c—myc蛋白和PCNA蛋白的表達。結(jié)果對照組、組1、組2、組4靜脈移植術(shù)后7d、28d、90d時靜脈移植物內(nèi)膜和中膜內(nèi)可見大量c—myc蛋白和PCNA蛋白表達陽性的細胞，與同時間點組3比較差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0．01）。28d、90d時5組靜脈移植物內(nèi)c—myc蛋白的表達與同組7d時比較明顯增強（P〈0．01）。結(jié)論可溶性支架轉(zhuǎn)染c—myc反義寡核苷酸可顯著抑制靜脈移植物內(nèi)c—myc蛋白和PCNA蛋白的表達。
目的 人Ⅰ型前膠原基因（Col Ⅰ A1）反義寡核苷酸（antisense oligodeoxyneucleotide，ASODN）對體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細胞有抑制膠原合成作用，擬進一步探討Col Ⅰ A1 ASODN 對裸鼠移植模型體內(nèi)的人增生性瘢痕的膠原合成作用。 方法 SPF 級BALB/c-nunu 品系6 ～ 8 周齡雌性裸鼠60 只，體重約20 g；取行瘢痕切除手術(shù)患者自愿捐贈的瘢痕組織塊去表皮后，移植至裸鼠背部肩胛內(nèi)側(cè)皮下，每只裸鼠移植1 塊，制備人增生性瘢痕裸鼠移植模型。將58 只成功制備模型的裸鼠根據(jù)處理方法不同，隨機分成3 組，于瘢痕移植2 周根據(jù)分組行經(jīng)皮穿刺瘢痕內(nèi)注射。A 組（n=20）：5 μL 濃度為3 mmol/L Col Ⅰ A1 ASODN、3 μL 脂質(zhì)體、92 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基；B 組（n=20）： 3 μL 脂 質(zhì)體、97 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基；C 組（n=18）：100 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基。實驗最初2 周每天注射1 次，之后隔天1 次，至實驗取材。注射后2、4、6 周，對存活裸鼠進行瘢痕硬度測量后，處死裸鼠取瘢痕組織行膠原染色組織學(xué)觀察以及透射電鏡觀察；提取細胞總RNA 后行RT-PCR 測定Col Ⅰ A1 mRNA 相對含量；ELISA 法行Col Ⅰ A1 蛋白定量分析。 結(jié)果 注射后6 周內(nèi)17 只裸鼠死亡；共41 只裸鼠40 塊瘢痕組織符合實驗標準，納入實驗；A、B、C 組各14、13、14 只。注射后2 周，3 組間瘢痕硬度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）；4、6 周時A 組與B、C 組比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05），B、C 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。隨時間延長，組織學(xué)觀察示3 組Ⅲ型膠原表達上升，A 組最明顯，Ⅰ型膠原排列規(guī)則。透射電鏡觀察示A 組成纖維細胞退化，膠原纖維排列更趨于一致；B、C 組膠原纖維排列也逐漸規(guī)則。注射后2、4 周3 組間Col Ⅰ A1 mRNA 和蛋白表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；6 周時A 組與B、C 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05），B、C 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 在人增生性瘢痕裸鼠移植模型的瘢痕內(nèi)注射Col Ⅰ A1 ASODN 可抑制Col Ⅰ A1 mRNA 及Ⅰ型膠原表達，促進瘢痕組織成熟、軟化，脂質(zhì)體可促進該抑制效果。
探討陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)Ⅰ 型前膠原基因（Col Ⅰ A1）反義寡核苷酸（antisense oligodeoxyneucleotide，ASODN）轉(zhuǎn)染對人增生性瘢痕成纖維細胞Col Ⅰ A1 表達的影響。 方法 取患者自愿捐贈瘢痕組織，采用組織塊法培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細胞并傳代。于6 孔板內(nèi)按32.25 × 104 個/ 孔的密度接種第4 代細胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染液不同分為4 組：A 組為脂質(zhì)體加Col Ⅰ A1 ASODN，B 組為Col Ⅰ A1 ASODN，C 組為脂質(zhì)體，D 組為空白對照。轉(zhuǎn)染后8 h，1、2、3、4 d 分別提取細胞總RNA，行RT-PCR 后測定Col Ⅰ A1 mRNA 表達量；胃酶消化法提取ECM 中Col Ⅰ A1 蛋白，ELISA 測定其濃度。 結(jié)果 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示條帶清晰，無雜帶、明顯的引物二聚體及拖尾現(xiàn)象。Col Ⅰ A1 mRNA 相對表達量：轉(zhuǎn)染后8 h，A 組小于B、C、D 組，B、C 組小于D 組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；B、C 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后1 d，A、B 組小于C、D 組（P lt; 0.05），A、B 組間和C、D 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05） ；轉(zhuǎn)染后2 d，各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后3、4 d，A 組小于B、C、D 組，B 組小于C、D 組（P lt; 0.05），C、D 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。Col Ⅰ蛋白濃度：轉(zhuǎn)染后8 h，A組小于B、C、D 組，B、C 組小于D 組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05），B、C 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（PP gt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后1 d，各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后2、3、4 d，A、B 組小于C、D 組，C 組小于D 組（P lt; 0.05），A、B 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 Col Ⅰ A1 ASODN 抑制Col Ⅰ A1 mRNA 和蛋白表達；陽離子脂質(zhì)體作為載體有增強效果，促進ASODN 進入細胞并在核內(nèi)分布。
目的 探討殼聚糖納米粒子攜帶反義基因在血管外科領(lǐng)域中的 應(yīng)用。方法 雄性SPF級SD大白鼠54只，體重450~600g，隨機分為實驗 組和對照組（n＝27）。實驗組取右側(cè)頸靜脈、頸動脈吻合口段灌注攜帶增殖細胞核抗 原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)的反義寡核苷酸（antisens oligo deoxy nucleotides, ASODN ）粒子后，移植至同側(cè)頸動脈；對照組用同樣方法灌注生理鹽水。取 造模后血管通暢的48只大白鼠(n=24)分別于第1、2、3、4周超聲多普勒監(jiān)測血流動力學(xué) ，取標本行免疫組織化學(xué)染色、Western blot蛋白印跡檢測、血管壁組織病理變化檢測等。 結(jié)果兩組的血栓形成率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。在4 周的觀察期內(nèi)，代表增殖的PCNA蛋白印跡條帶顯示：實驗組移植靜脈、吻合口的濃度較對照 組低。術(shù)后1、2、3及4周，實驗組移植靜脈PCNA陽性細胞指數(shù)分別為0.13％±0.11％，0. 79％±0.28％，0.45％±0.29％,0.43％±0.25％，吻合口分別為1.90％±0.84％ ，2.11％±0.98％，2.48％±0.77％，2.17％±0.36％，較對照組明顯減少（P＜ 0.05）；實驗組移植靜脈及吻合口的空腔面積分別為88.71±16.96、95.98±21.44 、88.48±32.81、97.86±34.11 μm2和41.49±3.34、45.15±11.65、46.27± 8.90、51.62±8.85 μm 2，均較對照組大（P＜0.05），實驗組移植靜脈、吻合口的內(nèi)膜面積／中膜面積分別為22.73％±3.11％、32.40％±4.55％、45.14％±3.19％、45.70％±5.01％和41.49％±3.34％、45.15％±11.65％、46.27％±8.90％ 、51.62％±8.85％，均較對照組?。≒＜0.05）。最大血流速度比較，兩組在第1周血流最大速度相似，后3周出現(xiàn)不同變化。對照組靜脈移植段和吻合口的最大流速逐漸增加，在第3周達到最高，至第4周時降低；實驗組靜脈移植段和吻合口最大流速逐漸降低，在第3周達到最低，至第4周時升高。第4周實驗組和對照組移植靜脈段和吻合口最大流速均接近 。各時間點兩組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 殼聚糖納米粒子攜帶PCNAASODN能有效抑制血管移植后內(nèi)膜細胞增殖，從而抑制新生內(nèi)膜過度增厚。