目的 結(jié)合熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡三維重建技術(shù)觀察體外構(gòu)建的組織工程骨及其體內(nèi)移植情況，為篩選優(yōu)良的支架材料和三維構(gòu)建方法提供技術(shù)支持。 方法 取2 歲齡青山羊（體重約25 kg）髂骨骨髓，利用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs，并通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)表面分子CD29、CD60L、CD45和CD44 表達(dá)情況。將質(zhì)粒pLEGFP-N1 擴(kuò)增、提取后酶切鑒定。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到PT67 包裝細(xì)胞，G418 篩選后擴(kuò)增，獲取病毒液。根據(jù)測(cè)定的滴度轉(zhuǎn)染BMSCs，獲得綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達(dá)的BMSCs，擴(kuò)增后作為種子細(xì)胞，以脫鈣骨基質(zhì)作為支架材料構(gòu)建組織工程骨，并利用激光共聚焦顯微鏡觀察種子細(xì)胞。將構(gòu)建的組織工程骨移植到山羊股骨缺損處，利用激光共聚焦顯微鏡觀察其存活和分布情況。 結(jié)果 獲得的細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞狀，CD29 和CD44 呈陽(yáng)性表達(dá)，CD60L 和CD45 呈陰性。質(zhì)粒pLEGFP-N1 用Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ內(nèi)切酶酶切后，凝膠電泳可見(jiàn)其相對(duì)分子質(zhì)量約6 900 bp。將pLEGFP-N1 轉(zhuǎn)染到PT67 包裝細(xì)胞擴(kuò)增后獲取病毒液。根據(jù)測(cè)定的滴度（1.3 × 106 cfu/mL）轉(zhuǎn)染BMSCs，獲得GFP 表達(dá)陽(yáng)性的BMSCs 克隆。激光共聚焦顯微鏡三維立體成像技術(shù)觀察到BMSCs 在組織工程骨支架上分布、增殖和遷移。將構(gòu)建的組織工程骨移植到山羊股骨缺損處，28 d 后激光共聚焦顯微鏡觀察到GFP 陽(yáng)性細(xì)胞在移植區(qū)仍存在。 結(jié)論 熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡三維重建技術(shù)可很好地觀察支架上和移植體內(nèi)的細(xì)胞，為組織工程產(chǎn)物三維培養(yǎng)的立體觀察提供了可行方法。
引用本文： 侯天勇,邊巴羅布,羅飛,吳雪暉,靳慧勇,姜恒,許建中. 綠色熒光蛋白標(biāo)記結(jié)合激光共聚焦顯微鏡三維重建技術(shù)觀測(cè)組織工程骨的構(gòu)建和體內(nèi)移植. 中國(guó)修復(fù)重建外科雜志, 2010, 24(7): 774-778. doi: 復(fù)制