目的 構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)hBMP-2 的慢病毒載體，并研究hBMP-2 在人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，HUMSCs）中的可誘導(dǎo)性表達(dá)。 方法 以pcDNA-hBMP-2 為模板，通過(guò)PCR 反應(yīng)獲取hBMP-2，運(yùn)用GATEWAY 技術(shù)構(gòu)建pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A- 反向反式激活因子（reverse transactivator，rtTA），通過(guò)PCR 鑒定重組慢病毒載體構(gòu)建。將重組慢病毒與輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293FT 細(xì)胞，包裝成能表達(dá)hBMP-2 的可控性慢病毒，并測(cè)定病毒滴度。用病毒轉(zhuǎn)染HUMSCs，使用強(qiáng)力霉素進(jìn)行誘導(dǎo)，分別在相同誘導(dǎo)時(shí)間（48 h）不同誘導(dǎo)濃度（0、10、100 ng/mL，1、10、100 μg/mL）及不同誘導(dǎo)時(shí)間（12、24、48、72 h）相同誘導(dǎo)濃度（10 μg/mL）兩種情況下用ELISA 法測(cè)定hBMP-2 的表達(dá)情況。對(duì)轉(zhuǎn)染前后的HUMSCs 進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，用茜素紅染色法觀察礦化物結(jié)節(jié)形成情況。 結(jié)果 成功構(gòu)建了攜帶hBMP-2 的可控性慢病毒載體pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA，并獲得相應(yīng)的病毒，病毒滴度分別為3.5 × 108 TU/mL 和9.5 × 107 TU/mL；病毒轉(zhuǎn)染HUMSCs 后，HUMSCs 可通過(guò)強(qiáng)力霉素的誘導(dǎo)可控性表達(dá)hBMP-2。在相同誘導(dǎo)時(shí)間情況下，強(qiáng)力霉素10 μg/mL 時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)最強(qiáng)；而在相同誘導(dǎo)濃度下，hBMP-2 的表達(dá)在誘導(dǎo)48 h 達(dá)峰值。HUMSCs 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2 周后，茜素紅染色示胞漿中有大量紅色的鈣化基質(zhì)沉積。 結(jié)論 通過(guò)GATEWAY 技術(shù)可以建立攜帶hBMP-2 目的基因的可控性慢病毒載體，為進(jìn)一步研究hBMP-2 誘導(dǎo)HUMSCs 成骨分化治療骨壞死模型奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并提供了一種新的實(shí)驗(yàn)思路。
引用本文： 周明,石新艷,田少奇,王麗,張積華,孫康,邢士超,孫偉雪,黃洪杰,吳丹. 可誘導(dǎo)表達(dá)hBMP-2 的慢病毒載體構(gòu)建及其在人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá). 中國(guó)修復(fù)重建外科雜志, 2011, 25(4): 482-487. doi: 復(fù)制