目的 構建靶向小鼠核因子κB( NF-κB) P65 進行RNA 干擾( RNAi) 的逆轉錄病毒載體, 鑒定其生物學效應。
方法 采用分子克隆技術構建靶向小鼠NF-κB P65 siRNA 的逆轉錄病毒載體, 轉染293E 細胞, 包裝成逆轉錄病毒, 以不同滴度感染小鼠單核巨噬細胞J774A. 1, 用相同濃度的脂多糖( LPS) 刺激, 在不同時間點用RT-PCR 和Western blot 從mRNA 和蛋白水平上檢測細胞NF-κB P65 表達, 并用RT-PCR 和ELISA 方法檢測腫瘤壞死因子α( TNF-α) 表達。
結果 成功構建靶向小鼠 NF-κB P65 基因的小干擾RNA 逆轉錄病毒表達載體。經LPS 刺激后, siRNA 病毒組J774A. 1 細胞中 NF-κB P65 mRNA 的表達明顯受到抑制, 2 h 即明顯低于Scramble 病毒組( 0. 91 ±0. 03 比1. 02 ± 0. 02, P lt;0. 01) , 此后持續(xù)降低; 在LPS刺激后的24、36、48 和72 h, siRNA 病毒組NF-κB P65 蛋白表達均明顯低于Scramble 病毒組( 0. 97 ±0. 02 比1. 01 ±0. 01, 0. 94 ±0. 01 比1. 02 ±0. 01, 0. 94 ±0. 02 比1. 02 ±0. 01, 0. 93 ±0. 01 比1. 00 ±0. 02, P lt;0. 05) 。LPS 刺激后2、6、12 和24 h, siRNA 病毒組TNF-α 的mRNA 表達水平均明顯低于Scramble 病毒組( P lt; 0. 01) , 而相同時間點siRNA 病毒組細胞上清 TNF-α的含量亦明顯低于Scramble 病毒組( P lt;0. 01) 。
結論 將小干擾RNA 片段連接到空白質粒中構建逆轉錄病毒表達載體的方法是可行的。采用RNA 干擾技術抑制NF-κB 的表達后, 可以減少其下游炎癥因子的釋放, 提示RNA 干擾技術在炎性損傷性疾病如急性肺損傷的防治中具有潛在應用價值。
引用本文： 靳麗妍,朱光發(fā),吳春婷,閆樹鳳. 靶向小鼠核因子κB P65 的小干擾RNA 逆轉錄病毒載體的構建與鑒定. 中國呼吸與危重監(jiān)護雜志, 2011, 10(4): 335-339. doi: 復制
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