目的 構(gòu)建靶向小鼠核因子κB( NF-κB) P65 進(jìn)行RNA 干擾( RNAi) 的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體, 鑒定其生物學(xué)效應(yīng)。
方法 采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建靶向小鼠NF-κB P65 siRNA 的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體, 轉(zhuǎn)染293E 細(xì)胞, 包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒, 以不同滴度感染小鼠單核巨噬細(xì)胞J774A. 1, 用相同濃度的脂多糖( LPS) 刺激, 在不同時(shí)間點(diǎn)用RT-PCR 和Western blot 從mRNA 和蛋白水平上檢測細(xì)胞NF-κB P65 表達(dá), 并用RT-PCR 和ELISA 方法檢測腫瘤壞死因子α( TNF-α) 表達(dá)。
結(jié)果 成功構(gòu)建靶向小鼠 NF-κB P65 基因的小干擾RNA 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。經(jīng)LPS 刺激后, siRNA 病毒組J774A. 1 細(xì)胞中 NF-κB P65 mRNA 的表達(dá)明顯受到抑制, 2 h 即明顯低于Scramble 病毒組( 0. 91 ±0. 03 比1. 02 ± 0. 02, P lt;0. 01) , 此后持續(xù)降低; 在LPS刺激后的24、36、48 和72 h, siRNA 病毒組NF-κB P65 蛋白表達(dá)均明顯低于Scramble 病毒組( 0. 97 ±0. 02 比1. 01 ±0. 01, 0. 94 ±0. 01 比1. 02 ±0. 01, 0. 94 ±0. 02 比1. 02 ±0. 01, 0. 93 ±0. 01 比1. 00 ±0. 02, P lt;0. 05) 。LPS 刺激后2、6、12 和24 h, siRNA 病毒組TNF-α 的mRNA 表達(dá)水平均明顯低于Scramble 病毒組( P lt; 0. 01) , 而相同時(shí)間點(diǎn)siRNA 病毒組細(xì)胞上清 TNF-α的含量亦明顯低于Scramble 病毒組( P lt;0. 01) 。
結(jié)論 將小干擾RNA 片段連接到空白質(zhì)粒中構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的方法是可行的。采用RNA 干擾技術(shù)抑制NF-κB 的表達(dá)后, 可以減少其下游炎癥因子的釋放, 提示RNA 干擾技術(shù)在炎性損傷性疾病如急性肺損傷的防治中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
引用本文： 靳麗妍,朱光發(fā),吳春婷,閆樹鳳. 靶向小鼠核因子κB P65 的小干擾RNA 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建與鑒定. 中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志, 2011, 10(4): 335-339. doi: 復(fù)制