DNA 甲基化可通过调节基因转录水平的表达改变，在突触重塑、神经前体细胞分化等神经生物过程中起重要作用。近年来，不断有研究发现，DNA 甲基化与癫痫密切相关。文章主要探讨 DNA 甲基化参与癫痫发病的可能机制，以及为 DNA 甲基化提供甲基的甲硫氨酸循环在癫痫发病机制中的调控作用，以期为癫痫的预防和治疗提供新思路。
引用本文： 包翌, 肖争. DNA 甲基化在癫痫中的研究进展. 癫痫杂志, 2018, 4(3): 238-241. doi: 10.7507/2096-0247.20180042 复制
DNA 甲基化是最常见的表观遗传学修饰之一[1]。它是指以 S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）为甲基供体，在 DNA 甲基化转移酶（DNA methyctransferace，DNMTs）的作用下，把甲基转移到 DNA 分子的碱基上，形成 5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤，其中 5-甲基胞嘧啶是 DNA 甲基化最常见的一种形式[2]。在哺乳动物中，DNA 甲基化是必不可少的且大多数甲基化胞嘧啶都发生在 CpG 岛上。DNMT1 和 3（包括 3a 和 3b）是 DNA 甲基化过程中的两类关键酶，分别起维持和形成甲基化的作用[3]。DNA 甲基化主要通过改变 DNA 构象、DNA 与转录因子结合、DNA 与有关蛋白的相互作用等来抑制基因的表达。
1 DNA 甲基化与癫痫
癫痫是以脑部神经元异常同步化放电为主要特征的复杂神经系统疾病。全球有超过 5 千万的癫痫患者，每年新发病例超过 60 万，且约 1/3 的患者最终发展成为耐药性癫痫[4]。但是，癫痫的发病机制尚不完全清楚。近年来，不断有研究发现，DNA 甲基化与癫痫密切相关。
1.1 DNA 甲基化转移酶与癫痫
DNA 甲基化在癫痫发病机制中的作用的间接证据首先来于自体外研究。癫痫神经网络及环路重组学说认为异常的突触可塑性改变可使神经元之间建立异常联系，形成病理性神经环路，从而参与癫痫的发生。2006 年，Levenso 等[5]研究发现 DNMTs 抑制剂（5-氮杂-2'-脱氧胞苷和 2-嘧啶酮-B-核甙）可以抑制离体脑片中 Schaffer collateral-CA1 区突触的长时程诱导增强作用（Long-term potentiation，LTP）。2008 年，Nelson 等[6]用 DNMTs 抑制剂（5-氮杂-2'-脱氧胞苷）处理原代海马神经元后，用全细胞膜片钳记录到微兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic currents，mEPSC）较对照组明显降低，而增加甲基化的底物 SAM 可以逆转 DNMTs 抑制剂对 mEPSCs 的抑制作用。这些体外实验表明，DNA 甲基化与突触可塑性密切相关，可能参与癫痫的形成。随后，多项体内实验证实 DNMTs 与癫痫密切相关，DNMTs 抑制剂具有潜在的抗癫痫作用。Zhu 等[7]在颞叶癫痫患者脑组织中观察到 DNMT1 和 3a 表达上调，这从侧面提示 DNMTs 参与 DNA 甲基化的动态变化，从而影响癫痫的发生。Parrish 等[8]研究发现，用 DNMTs 抑制（zebularine）预处理可以缩短海人酸诱导的大鼠癫痫发作的潜伏期。而 Chen 等[9]也观察到 DNMTs 抑制（Rg108）预处理小鼠可以减轻海人酸诱导的小鼠癫痫发作的严重程度。
1.2 癫痫模型/患者全基因组甲基化水平的改变
DNMTs 与癫痫的密切相关预示着癫痫发生同时伴随着大规模基因甲基化水平发生变化。Miller-Delaney 等[10]发现，与正常小鼠海马组织相比海人酸诱导癫痫持续状态模型和癫痫耐受模型的海马组织中，约 90% 甲基化改变的基因表现为低甲基化。而Kobow 等[11]在锂-匹鲁卡品癫痫模型慢性期大鼠海马组织观察到全基因组高甲基改变占主导地位。上述研究提示诱发癫痫的急性脑损伤可能促使基因的甲基化状态降低，而慢性癫痫状态可能与全基因组高甲基化有关。此外，Miller-Delaney 等[12]对颞叶癫痫患者的硬化海马组织进行 DNA 甲基化深度测序发现，146 条蛋白编码基因甲基化水平发生改变，而这些基因中，81.5% 基因启动子区的甲基化水平升高。值得注意的是，2016 年，Dębski 等[13]对比了 3 种慢性癫痫模型鼠与正常鼠（杏仁核点燃、锂-匹鲁卡品腹腔注射、侧位液压冲击脑损伤）脑组织的甲基化表达差异的基因，没有发现任何一个共同改变的甲基化基因，即使是两个模型之间共同改变的甲基化基因的数量也十分有限，这表明病因和模型的特异性对机体甲基化的调控有较强的特异性。
1.3 癫痫相关基因甲基化水平改变
1.3.1 Reelin 基因甲基化与癫痫
Reelin 是由 Cajal-Retzius 细胞的一种细胞外基质分子，主要作用是在哺乳动物大脑的早期发育中，作为神经细胞迁移终止信号调节神经元的迁移和定位，诱导大脑板层结构形成。而在成熟的脑组织中，Reelin 蛋白可以调节神经元突触的功能，以及参与大脑板层结构的维持。研究发现，颞叶癫痫患者海马 Reelin 蛋白表达明显降低，且降低程度与海马齿状回颗粒细胞弥散程度密切相关，提示 Reelin 蛋白与颞叶癫痫密切相关[14, 15]。Levenson 等发现 DNMTs 抑制剂在调节成熟海马神经元突触可塑性的同时，Reelin 基因启动子区甲基化也发生了变化。随后，Kobow 等[16]观察到颞叶癫痫患者的硬化海马区的 Reelin 基因甲基化水平与颗粒细胞板层结构破坏程度明显相关。
1.3.2 SCN3a 基因甲基化与癫痫
SCN3a 基因编码的 α 亚基是组成电压门控钠离子通道 α 亚基的一个亚型，其主要作用是维持胚胎期中枢神经系统神经细胞的兴奋性。研究表明，SCN3a 基因高表达参与癫痫的形成[17-19]。Li 等[20]研究发现，SCN3a 启动子区-39 位点甲基化状态改变可影响其与 MBD2 的结合能力，从而调节 SCN3a 基因的表达，参与癫痫的发生。
1.3.3 BDNF 基因甲基化与癫痫
脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）对神经细胞有着广泛的营养作用和重要保护作用。BDNF 能促进苔藓纤维芽生，建立新的突触链接作用，其高表达能导致惊厥发作[21, 22]。Parrish 等[23, 24]检测到海人酸诱导的癫痫持续状态后小鼠的海马组织 BDNF 基因甲基化水平明显降低。
癫痫相关基因甲基化水平失调导致的基因异常表达，可能是癫痫发病的关键环节。多项研究还发现了其他癫痫相关基因甲基化水平的变化（表 1）。
表1
癫痫相关基因甲基化水平改变
2 甲硫氨酸循环与癫痫
DNA 甲基化依赖 SAM 为其提供甲基供体，而甲基供体 SAM 的合成和在体内的平衡主要依赖于甲硫氨酸循环。甲硫氨酸循环是指，甲硫氨酸活化生成 SAM，被甲基转移酶（Methyltransferase，MTs）催化去甲基生成 S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine，SAH），SAH 再脱去腺苷生成同型半胱氨酸，同型半胱氨酸再接受 N-CH3-FH4 上的甲基，重新生成甲硫氨酸的循环过程（图 1）。细胞内 SAM 浓度的增加可以促进 DNA 的甲基化，而高 SAH 水平可以防止 DNA 的进一步甲基化[29]。因此，甲硫氨酸循环可能通过参与调节体内甲基化水平，与癫痫的发生发展密切相关。
图1
甲硫氨酸循环
多项研究表明，参与甲硫氨酸循环中的代谢物与癫痫密切相关。蛋氨酸亚砜亚胺（Methionine sulfoximine，MSO）是一种已知几十年的具有诱发癫痫发作的化学物质。甲硫氨酸作为 MSO 的一种成分，其在癫痫中的作用也就通过 MSO 的促惊厥作用表现出来[30]。与甲硫氨酸相比，腺苷和 SAM 已被证明具有抗惊厥作用。Williams-Karnesky 等[31]研究发现，对海人酸造模小鼠给予持续 10 d 的腺苷干预，可以逆转小鼠脑组织的 DNA 甲基化变化，同时抑制海马苔藓纤维的芽生，从而抑制癫痫的自发发作。Dhediya 等[32]研究发现，SAM 可以显著延长戊四氮诱导的大鼠点燃模型的潜伏期，改善发作的严重程度。此外，同型半胱氨酸作为一种 N-甲基-D-天冬氨酸受体激动剂，也可通过增加谷氨酸能神经元传递发挥促惊厥和神经毒性的作用[33]。
3 结语
综上，DNA 甲基化在癫痫发展过程中是动态调节的，并与癫痫密切相关。干预甲硫氨酸循环中的物质代谢或者关键基因的甲基化水平，可能成为未来抗癫痫治疗的有效方法。DNA 甲基化在癫痫研究中作为一个新的领域具有广泛前景。
DNA 甲基化是最常见的表观遗传学修饰之一[1]。它是指以 S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）为甲基供体，在 DNA 甲基化转移酶（DNA methyctransferace，DNMTs）的作用下，把甲基转移到 DNA 分子的碱基上，形成 5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤，其中 5-甲基胞嘧啶是 DNA 甲基化最常见的一种形式[2]。在哺乳动物中，DNA 甲基化是必不可少的且大多数甲基化胞嘧啶都发生在 CpG 岛上。DNMT1 和 3（包括 3a 和 3b）是 DNA 甲基化过程中的两类关键酶，分别起维持和形成甲基化的作用[3]。DNA 甲基化主要通过改变 DNA 构象、DNA 与转录因子结合、DNA 与有关蛋白的相互作用等来抑制基因的表达。
1 DNA 甲基化与癫痫
癫痫是以脑部神经元异常同步化放电为主要特征的复杂神经系统疾病。全球有超过 5 千万的癫痫患者，每年新发病例超过 60 万，且约 1/3 的患者最终发展成为耐药性癫痫[4]。但是，癫痫的发病机制尚不完全清楚。近年来，不断有研究发现，DNA 甲基化与癫痫密切相关。
1.1 DNA 甲基化转移酶与癫痫
DNA 甲基化在癫痫发病机制中的作用的间接证据首先来于自体外研究。癫痫神经网络及环路重组学说认为异常的突触可塑性改变可使神经元之间建立异常联系，形成病理性神经环路，从而参与癫痫的发生。2006 年，Levenso 等[5]研究发现 DNMTs 抑制剂（5-氮杂-2'-脱氧胞苷和 2-嘧啶酮-B-核甙）可以抑制离体脑片中 Schaffer collateral-CA1 区突触的长时程诱导增强作用（Long-term potentiation，LTP）。2008 年，Nelson 等[6]用 DNMTs 抑制剂（5-氮杂-2'-脱氧胞苷）处理原代海马神经元后，用全细胞膜片钳记录到微兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic currents，mEPSC）较对照组明显降低，而增加甲基化的底物 SAM 可以逆转 DNMTs 抑制剂对 mEPSCs 的抑制作用。这些体外实验表明，DNA 甲基化与突触可塑性密切相关，可能参与癫痫的形成。随后，多项体内实验证实 DNMTs 与癫痫密切相关，DNMTs 抑制剂具有潜在的抗癫痫作用。Zhu 等[7]在颞叶癫痫患者脑组织中观察到 DNMT1 和 3a 表达上调，这从侧面提示 DNMTs 参与 DNA 甲基化的动态变化，从而影响癫痫的发生。Parrish 等[8]研究发现，用 DNMTs 抑制（zebularine）预处理可以缩短海人酸诱导的大鼠癫痫发作的潜伏期。而 Chen 等[9]也观察到 DNMTs 抑制（Rg108）预处理小鼠可以减轻海人酸诱导的小鼠癫痫发作的严重程度。
1.2 癫痫模型/患者全基因组甲基化水平的改变
DNMTs 与癫痫的密切相关预示着癫痫发生同时伴随着大规模基因甲基化水平发生变化。Miller-Delaney 等[10]发现，与正常小鼠海马组织相比海人酸诱导癫痫持续状态模型和癫痫耐受模型的海马组织中，约 90% 甲基化改变的基因表现为低甲基化。而Kobow 等[11]在锂-匹鲁卡品癫痫模型慢性期大鼠海马组织观察到全基因组高甲基改变占主导地位。上述研究提示诱发癫痫的急性脑损伤可能促使基因的甲基化状态降低，而慢性癫痫状态可能与全基因组高甲基化有关。此外，Miller-Delaney 等[12]对颞叶癫痫患者的硬化海马组织进行 DNA 甲基化深度测序发现，146 条蛋白编码基因甲基化水平发生改变，而这些基因中，81.5% 基因启动子区的甲基化水平升高。值得注意的是，2016 年，Dębski 等[13]对比了 3 种慢性癫痫模型鼠与正常鼠（杏仁核点燃、锂-匹鲁卡品腹腔注射、侧位液压冲击脑损伤）脑组织的甲基化表达差异的基因，没有发现任何一个共同改变的甲基化基因，即使是两个模型之间共同改变的甲基化基因的数量也十分有限，这表明病因和模型的特异性对机体甲基化的调控有较强的特异性。
1.3 癫痫相关基因甲基化水平改变
1.3.1 Reelin 基因甲基化与癫痫
Reelin 是由 Cajal-Retzius 细胞的一种细胞外基质分子，主要作用是在哺乳动物大脑的早期发育中，作为神经细胞迁移终止信号调节神经元的迁移和定位，诱导大脑板层结构形成。而在成熟的脑组织中，Reelin 蛋白可以调节神经元突触的功能，以及参与大脑板层结构的维持。研究发现，颞叶癫痫患者海马 Reelin 蛋白表达明显降低，且降低程度与海马齿状回颗粒细胞弥散程度密切相关，提示 Reelin 蛋白与颞叶癫痫密切相关[14, 15]。Levenson 等发现 DNMTs 抑制剂在调节成熟海马神经元突触可塑性的同时，Reelin 基因启动子区甲基化也发生了变化。随后，Kobow 等[16]观察到颞叶癫痫患者的硬化海马区的 Reelin 基因甲基化水平与颗粒细胞板层结构破坏程度明显相关。
1.3.2 SCN3a 基因甲基化与癫痫
SCN3a 基因编码的 α 亚基是组成电压门控钠离子通道 α 亚基的一个亚型，其主要作用是维持胚胎期中枢神经系统神经细胞的兴奋性。研究表明，SCN3a 基因高表达参与癫痫的形成[17-19]。Li 等[20]研究发现，SCN3a 启动子区-39 位点甲基化状态改变可影响其与 MBD2 的结合能力，从而调节 SCN3a 基因的表达，参与癫痫的发生。
1.3.3 BDNF 基因甲基化与癫痫
脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）对神经细胞有着广泛的营养作用和重要保护作用。BDNF 能促进苔藓纤维芽生，建立新的突触链接作用，其高表达能导致惊厥发作[21, 22]。Parrish 等[23, 24]检测到海人酸诱导的癫痫持续状态后小鼠的海马组织 BDNF 基因甲基化水平明显降低。
癫痫相关基因甲基化水平失调导致的基因异常表达，可能是癫痫发病的关键环节。多项研究还发现了其他癫痫相关基因甲基化水平的变化（表 1）。
表1
癫痫相关基因甲基化水平改变
2 甲硫氨酸循环与癫痫
DNA 甲基化依赖 SAM 为其提供甲基供体，而甲基供体 SAM 的合成和在体内的平衡主要依赖于甲硫氨酸循环。甲硫氨酸循环是指，甲硫氨酸活化生成 SAM，被甲基转移酶（Methyltransferase，MTs）催化去甲基生成 S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine，SAH），SAH 再脱去腺苷生成同型半胱氨酸，同型半胱氨酸再接受 N-CH3-FH4 上的甲基，重新生成甲硫氨酸的循环过程（图 1）。细胞内 SAM 浓度的增加可以促进 DNA 的甲基化，而高 SAH 水平可以防止 DNA 的进一步甲基化[29]。因此，甲硫氨酸循环可能通过参与调节体内甲基化水平，与癫痫的发生发展密切相关。
图1
甲硫氨酸循环
多项研究表明，参与甲硫氨酸循环中的代谢物与癫痫密切相关。蛋氨酸亚砜亚胺（Methionine sulfoximine，MSO）是一种已知几十年的具有诱发癫痫发作的化学物质。甲硫氨酸作为 MSO 的一种成分，其在癫痫中的作用也就通过 MSO 的促惊厥作用表现出来[30]。与甲硫氨酸相比，腺苷和 SAM 已被证明具有抗惊厥作用。Williams-Karnesky 等[31]研究发现，对海人酸造模小鼠给予持续 10 d 的腺苷干预，可以逆转小鼠脑组织的 DNA 甲基化变化，同时抑制海马苔藓纤维的芽生，从而抑制癫痫的自发发作。Dhediya 等[32]研究发现，SAM 可以显著延长戊四氮诱导的大鼠点燃模型的潜伏期，改善发作的严重程度。此外，同型半胱氨酸作为一种 N-甲基-D-天冬氨酸受体激动剂，也可通过增加谷氨酸能神经元传递发挥促惊厥和神经毒性的作用[33]。
3 结语
综上，DNA 甲基化在癫痫发展过程中是动态调节的，并与癫痫密切相关。干预甲硫氨酸循环中的物质代谢或者关键基因的甲基化水平，可能成为未来抗癫痫治疗的有效方法。DNA 甲基化在癫痫研究中作为一个新的领域具有广泛前景。
