引用本文： 杨小林, 张晓青, 陈兵, 李维, 杨梅花, 陈欣, 张伟, 杨辉, 邹丽萍, 刘仕勇. 促肾上腺皮质激素释放激素及受体在婴儿痉挛症致痫组织中的表达. 癫痫杂志, 2017, 3(1): 3-14. doi: 10.7507/2096-0247.20170001 复制
婴儿痉挛症(Infantile spasm, IS)是以年龄依赖性为特征的一种癫痫综合征, 主要临床特征为点头样痉挛发作、脑电图(EEG)呈高峰节律紊乱，且常伴精神发育迟滞，其发病机制尚不清楚。1958年Sorel和Dusaucy-Bayloye发现用促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone, ACTH)治疗IS有效[1]，至今仍是IS治疗的首选药物，但其作用机理尚未阐明。已发现IS患者脑脊液中ACTH和皮质醇都低于正常对照[2]，进一步研究提示ACTH是通过抑制促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin releasing hormone, CRH)在杏仁核中的表达发挥其抗癫痫作用[3]。已有较多动物实验结果显示CRH具有促癫痫作用，增加未成熟脑的兴奋性。因此，有学者认为IS是脑内CRH过多引起，但至今仍缺乏对IS患者脑组织的直接研究依据[4]。
CRH在大脑主要有两个受体--促肾上腺皮质激素释放激素1型受体(Corticotropin releasing hormone receptor 1, CRHR1)和2型受体CRHR2，CRH对CRHR1的亲和性较强，CRHR1被认为是CRH发挥效应的重要受体[5]。CRHR1和CRHR2属于G蛋白偶联受体家族，与CRH结合后启动环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)及三磷酸肌醇(Inositol 1，4，5-triphosphate，IP3)，进一步激活细胞内蛋白激酶A (Protein kinase A, PKA)和蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC)等信号途径发挥生物学效应[6]。PKC与癫痫发作关系密切，激活大鼠海马神经元PKC的电生理研究发现PKC与癫痫易感性有着重要的关系，参与癫痫的发生与维持机制[7]。CRH、CRHR1及其下游信号在人IS致痫灶中的作用尚不清楚，本研究检测CRH、CRHR1在IS患者致痫灶中的表达，进一步分析下游PKC信号分子的变化，有助于了解其在IS癫痫发作中的作用。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取第三军医大学新桥医院脑标本库中的IS患者手术标本(2011年6月-2014年6月)。所有标本的采集都在第三军医大学伦理委员会的指导下进行，脑标本的使用都符合赫尔辛基宣言，无任何为了试验目的而进行的标本采集与使用。入选标准：①符合IS的诊断标准, 即婴儿期起病且具有IS的3个特征：点头样痉挛发作、EEG高峰节律紊乱和精神发育迟滞；②包括ACTH及强的松在内的多种抗癫痫药物(AEDs)治疗无效，是手术介入的适应证[8]；③术前临床症状学、EEG及头颅核磁共振(MRI)和正电子发射断层显像(PET)检查等术前评估能够确定致痫灶。本组入选标本17例(表 1)。正常对照来自6例尸检，平均年龄2.8(1~5)岁，尸检时间＜24 h，均无癫痫相关病史，应激史及神经系统疾病，死亡前无濒死期(表 2)。
表1
IS患者的临床和神经病理学资料
Table1.
The clinical and neuropathological data in patients with IS
表2
对照组临床资料
Table2.
Clinical data of control group
1.2 组织准备
所有组织标本在获得时立即分成两份，一份浸泡于10%福尔马林缓冲液固定24 h后石蜡包埋, 石蜡包埋组织被切割成5 μm片用于HE染色及免疫组织化学染色，其他样本放于液氮冷冻。冷冻样本保持在-80℃冰箱用于Real-time PCR和Western Blot分析。
1.3 研究方法
1.3.1 Real-time PCR
用Real-time PCR检测IS致痫灶和尸检正常组织总RNA样本。用Trizol试剂(Invitrogen, La Jolla, CA)分离每个样本总RNA。NanoDropspectrophotometer (Ocean Optics, Dunedin, FL, USA)分光光度计在260/280 nm光下进行浓度和纯度鉴定。按反转录试剂盒(TakaRa, Otsu, Japan)说明，用1 μg RNA反转录得到cDNA。Real-time PCR反应所用引物由TAKARA生物技术有限公司合成(大连, 中国)，如下：CRH (forward：tccgagg agcctcccatc，reverse：aatctccatgagtttcctgttgc)，CRHR1(forward：gcctctgactcaccacgatg，reverse：tctgatgatgacac ctgacttctg)，β-actin (forward：gcaccacaccttctacaatgagc，reverse：tagcacagcctggatagcaacg)，CRHR2(forward: tcagccgtgaggaagaggtg, reverse: ggccgtctgcttgatgctgt)。Real-time PCR反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，CRH引物53.9℃延伸30 s (CRHR1引物53.9℃)，65℃溶解曲线，40个循环。mRNA表达水平的相对定量用2-△△CT法计算。所有样本都作3个复孔，每个基因重复2次。
1.3.2 Western blot
用Western Blot分析IS致痫灶与正常对照匀浆液。取100 mg冰冻标本按1：5 mL加裂解液匀浆机匀浆10 s，4℃下离心15 min，吸取上清置新EP管，用Bradford protein assay (Beyotime, China)测量总蛋白浓度及品质。将10%SDS胶置于电泳缓冲液中每孔点样50 μg蛋白量电泳分离。在甘氨酸转移缓冲液中恒流300 mA、80 min转膜，后置于用TBST液配置的5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加CRH单克隆兔抗人(1：2 000; Abcam, UK)，CRHR1多克隆羊抗人(1：500; Abcam, UK), PKC多克隆鼠抗人(1：600，Boster，China)，PKA多克隆兔抗人(1：400，Boster，China)，GAPDH单克隆兔抗人(1：1 000, CST, Beverly, USA)；4℃孵育过夜，TBST漂洗后加辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育1 h。GAPDH的表达水平作内参，化学发光法显影。
1.3.3 免疫组织化学及双标荧光染色
将石蜡包埋标本切5 μm片，贴片于防脱载玻片置60°烤箱1~2 h，取出脱蜡至水，常规HE染色，其余切片在0.3%双氧水甲醇稀释液中常温孵育30 min去除内源性过氧化物酶。置800 ml PBS (0.01 μmol/L, pH 7.3)中微波抗原修复(中高火20 min，室温冷却)，分别加CRH单克隆兔抗人(1：400; Abcam, UK)，CRHR1多克隆羊抗人(1：100; Abcam, UK), PKC多克隆鼠抗人(1：100，Boster，China)一抗4℃过夜，0.01 mmol/L PBS漂洗，加二抗37℃孵育1 h，用DAB显色，苏木素复染，阴性对照不加一抗，中性树胶封片显微镜下观察照相。荧光双标染色，加CRH单克隆兔抗人(1：250; Abcam, UK)，CRHR1多克隆羊抗人(1：50; Abcam, UK), PKC多克隆鼠抗人(1：50，Boster，China)，分别混合NF200单克隆鼠抗人(1：100，Boster，China), NF200多克隆兔抗人(1：200，Abcam，UK)，GFAP单克隆鼠抗人(1：400，Sigma), GFAP单克隆兔抗人(1：400，Abcam)，HLA单克隆鼠抗人(1：200, Dako, Denmark)，HLA单克隆兔抗人(1：200, Abcam)一抗4℃过夜，0.01 mmol/LPBS漂洗后加混合FITC结合二抗和AlexaFluor 594结合二抗(1：200; Boster, China)37℃孵育1 h，DAPI (10 μg/mL, Beyotime, China)染细胞核，荧光淬灭剂封片在激光共聚焦显微镜(TCS-TIV; Leica, Nussloch, Germany)下观察照相。
1.3.4 免疫组织化学染色评估分析方法
免疫组织化学染色IPP (Image Pro Plus)软件评估，每个标本随机选取3张切片，在×400视野下，于皮质逐层分别随机选取10个非重复区域，通过显微镜在1360×1024分辨率下拍摄图片；用IPP测量每张图片平均光密度值(Density mean, DM)，即我们首先校正光密度，设置感兴趣区色调为0~39，色彩饱和度0~255，强度0~255，然后把图片转换为灰度图片并计算其DM。
1.4 统计学方法
运用SPSS软件分析。数据均以均数±标准差表示，组间差异行单因素方差分析，用Spearman等级相关性分析法分析CRH、CRHR1和PKC之间的相关性，以及和临床特征的相关性。P值＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病例资料
研究入组17例IS患者标本，男12例，女5例。手术时平均月龄为29.4(9~58)个月，首次癫痫发作平均月龄为6.3(1~30)个月，病程19.2(8~46)个月。所有患儿都主要表现为频繁的痉挛性发作，部分患儿尚具有部分性发作和强直性发作，术前每月平均发作频率304(120~900)次。所有患儿均进行充分的术前评估，可以确定致痫灶位置并进行手术切除。所有患儿均行磁共振(MRI)和正电子断层扫描成像(PET)检查，MRI显示15例病灶，包括皮质发育障碍8例，萎缩或软化病灶7例；PET扫描17例均显示局灶性(11例)或半球性(6例)代谢减低，其中15例与MRI吻合，另其余2例与EEG吻合。EEG均表现为间歇期高度节律失常(8例)或变异型高度节律失常(9例，既往曾EEG显示典型高度节律失常)，发作期均显示为局灶起源(13例)或一侧半球起源(4例)。手术均采用局灶(7例)、灶中为中等至强的CRH (图 2c)表达于神经元。弱至中等CRHR1表达于神经元及胶质细胞(图 3b)，一侧半球多脑叶(6例)或半球切除(4例)。手术预后采用Engel分级：Ⅰ级12例，Ⅱ级3例，Ⅲ级2例。
图1
促肾上腺皮质激素释放激素和Ⅰ型受体激素在IS组和对照组表达水平的比较
a、b. CRH和CRHR1在IS致痫组织(
a、b. the mRNA expression of CRH and CRHR1 in IS group are higher than control group*
图2
促肾上腺皮质激素释放激素免疫组织化学检测结果
a. IS中FCDIa标本病理学特征; b-l. CRH在对照和IS致痫组织中免疫组化结果，CRH弱表达于对照神经元(b中箭头)，中等和强表达于IS致痫组织中神经元(c中箭头), 在IS致痫组织中CRH (绿色)与NF200(红色)共表达于神经元(d-f箭头)；GFAP阳性(红色)星形胶质细胞CRH表达阴性(g-i箭头)；HLA阳性(红色)小胶质细胞CRH表达阴性(j-l箭头).标尺: A-C, 50 μm；D-L 25 μm
Figure2. Immunohistochemical detection results of CRHa. Histopathologic characteristics of FCDIa in IS; b-l. Immunoreactivity (IR) detection results of CRH in control group and IS group. Weak CRHIR in the controls (b arrow), moderate to strong IR in IS (c arrow), CRH (green) and NF200 (red) both expressed in IS (d-f arrows); CRH is negative in GFAP positive astrocyte (g-i arrows); CRH is negative in HLA positive (red) microglial cell (j-l arrows). Scale: a-c, 50 μm; d-l 25 μm
图3
CRHR1免疫组织化学检测结果
a. IS中正常标本病理学特征; b-l：CRHR1在对照和IS致痫组织中免疫组化结果; b, c. CRHR1弱度及中度表达于对照神经元(b中箭头)，中等和强度表达于IS致痫组织中神经元(c中箭头)，IS致痫组织中CRHR1(绿色)与NF200(红色)共表达于神经元(d-f箭头)；CRHR1(绿色)与GFAP (红色)共表达于星型胶质细胞(g-i箭头)；CRHR1(绿色)与HLA (红色)共表达于小胶质细胞(j-l箭头).标尺: a-c, 50 μm; d-i 25 μm; j-l 10 μm
Figure3. Immunohistochemical detection results of CRHr1a. Histopathologic characteristics of IS; b-l. Immunohistochemical detection results of CRHR1 in control group and IS group. CRHR1 are weak to moderate in the controls (b arrow), moderate to strong in neurons (c arrow), CRHR1 (green) and NF200 (red) both expressed in IS (d-f arrows); CRHR1 (green) and GFAP (red) are both positive in astrocyte (g-i arrows); CRHR1 (green) and HLA (red) are both positive in microglial cell (j-l arrows). Scale: a-c, 50μm; d-i 25 μm; j-l 10 μm
2.2 促肾上腺皮质激素释放激素和Ⅰ型受体激素的Real-time PCR和Western Blot分析
用Real-time PCR检测CRH及CRHR1mRNA在IS致痫灶和正常对照中的表达，β-actin mRNA作为内参，结果显示IS致痫灶中CRH mRNA相对表达量显著高于对照组(图 1a)，CRHR1 mRNA在IS致痫灶中的表达较对照组升高(图 1b)。Western Blot结果显示CRH (图 1c)和CRHR1(图 1e)的蛋白条带分子量大约为25KDa和50KDa，用GAPDH (37KDa)作为内参作相对OD值分析，结果显示在IS致痫灶中CRH和CRHR1的蛋白表达水平均明显高于正常对照(图 1d、f)。
2.3 促肾上腺皮质激素释放激素和Ⅰ型受体激素的免疫组织化学分析
用免疫组织化学技术检测IS致痫灶和正常对照标本中的CRH和CRHR1的表达，结果显示，正常对照组中弱CRH表达于神经元(图 2b)，在IS致痫正常中等至强的CRHR1(图 3c)表达于神经元和胶质细胞。平均光密度也显示IS致痫灶标本CRH和CRHR1的表达明显高于对照组(表 3)，用Spearman等级相关性分析发现CRH和CRHR1表达强度与癫痫发作频率相关(CRH，R=0.671，P＜0.05；CRHR1，R=0.689，P＜0.05)，与其他临床特征未见明显相关性。荧光双标染色显示CRH与NF200共标于神经元(图 2d-f)。CRH未与GFAP和HLA共标于星形胶质细胞及小胶质细胞(图 2g-l)。CRHR1与NF200在神经元共标(图 3d-f)，与GFAP共标于星型胶质细胞(图 3g-i)，与HLA共标于小胶质细胞(图 3j-l)。
表3
对照组和婴儿痉挛症标本免疫组织化平均光密度值
Table3.
Density mean of control group and IS group
2.4 PKC的表达及细胞分布
用Western Blot检测PKC在IS致痫灶和正常对照中的表达，结果显示PKC的蛋白分子量约为80 KD (图 4a)，用GAPDH (37 KD)作为内参作相对OD值分析，PKC在IS致痫灶中的蛋白表达水平明显高于正常对照(图 4b)。HE染色检查示IS中胶质细胞非典型增生标本病理学特征(图 4c)。免疫组织化学分析PKC在IS致痫灶和正常对照中的表达，结果显示在正常对照为弱至中等的PKC表达于神经元和胶质细胞(图 4d)，IS致痫灶中为中等至强的PKC表达于神经元和胶质细胞(图 4e)。平均光密度值也显示IS在致痫灶标本中PKC的表达较正常对照升高(表 3)。荧光双标显示PKC与NF200在神经元共标(图 4f-h)。与GFAP共标与星形胶质细胞(图 4i-k)，与HLA共标于小胶质细胞(图 4l-n)。我们进一步评估了PKC的表达与CRHR1表达强度的相关性，用Spearman等级相关性分析发现PKC的表达强度与CRHR1的表达强度有相关性(R=0.855，P＜0.01)，与癫痫发作频率相关(R=0.72，P＜0.05)，与其他临床特征未见明显相关性。见图 5。
图4
PKC的表达及细胞分布
a, b. PKC在IS致痫组织中的表达较对照组明显增高(**
a, b. The expression of PKC is higher in IS group than control group (**
图5
婴儿痉挛症癫痫性痉挛与促肾上腺皮质激素释放激素和Ⅰ型受体, PKC表达相关性分析
a, b, c.散点图显示CRH，CRHR1和PKC的表达与IS癫痫性痉挛之间成正相关关系，Spearman等级相关系数：CRH: R=0.671,
a, b, c. Scatter diagram showed positive correlation between the expression of CRH, CRHR1, PKC with epileptic spasm in IS patients, Spearman coefficient: CRH: R=0.671,
3 讨论
本研究发现在IS患者致痫灶标本中，CRH和CRHR1在mRNA水平及蛋白水平的表达较对照组明显升高。CRH主要在神经元表达，其受体CRHR1则分布于神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。CRH和CRHR1的表达水平与IS癫痫性痉挛发作频率有相关性。免疫组织化学和Western blot检测发现PKC高表达于IS致痫灶，且与CRHR1的表达水平及癫痫发作频率存在相关性。结果提示：CRH-CRHR1-PKC信号通路可能参与IS的发病机制。
目前的研究表明在人IS患者脑脊液，ACTH和皮质醇都低于正常对照，而在IS动物模型中ACTH可抑制新生鼠海马CRH的表达发挥抗惊厥作用，据此推测脑组织中CRH表达过多诱导了IS发病[2, 3]。在动物实验中发现CRH能诱导不成熟大鼠惊厥，CRH注入大鼠侧脑室引起癫痫发作的剂量具有年龄依赖性，如在出生两周的大鼠比成年鼠小200多倍[9, 10]。在大鼠海马培养脑片实验显示海马多个亚区的兴奋性受到CRH的调节[9, 11]。对全身性癫痫发作患者尸检的结果也显示：大脑皮层CRH mRNA较对照组表达升高[12]。因此，Kristen等推测CRH可作用于大脑特异性皮质区而诱导IS癫痫发作，并提出IS的CRH发病假说[13]。但CRH发病学说尚未在IS患者致痫灶标本中获得直接支持依据。我们研究首次发现IS患者脑致痫灶中CRH明显升高，其受体CRHR1和下游信号PKC激活，且与癫痫发作频率相关，提示局部脑组织CRH过多有可能参与了IS癫痫发作机制。
在CRH的受体中，由于CRHR1的高亲和性和在脑内的分布特异性使其发挥主要作用。CRH与CRHR1结合后调节下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能，与应激、神经再生、神经免疫、肥胖及一些精神性疾病有关。CRH诱导的不成熟大鼠脑边缘性癫痫发作可以被CRHR1受体阻断剂阻断，提示CRH诱导不成熟脑惊厥作用可能由CRHR1介导[14]。该研究对人IS致痫灶标本的结果进一步支持这一观点，即CRHR1可能是IS中CRH发挥作用的重要受体。已经证实，在未成熟大脑，CRH可诱导CRHR1在细胞膜表达，而在较大年龄或成熟大鼠脑，这种CRH诱导CRHR1的作用减弱[15, 16]。本组对低龄(＜5岁)儿童脑组织标本的研究中发现CRH与CRHR1同时高表达现象，且与癫痫发作的频率相关，这也提示CRH可能诱导未成熟脑CRHR1的表达，从而在特定的未成熟脑发育阶段参与IS的特殊发病机制。IS具有起病于低龄婴儿，在脑发育成熟后痉挛发作消失的年龄依赖性临床特点，与CRH在未成熟脑特定发育阶段诱发癫痫和诱导CRHR1表达的现象相吻合，支持IS的CRH发病学说。
CRHR1的激活可以启动下游多个信号通路，如PKA、PKC等发挥其生物学效应。在小鼠海马神经元已经证实CRH通过CRH受体偶联Gs和Gq蛋白影响PKA和PKC信号通路[17]。进一步对海马锥体神经元的电生理研究发现PKC与癫痫易感性有着重要的关系，涉及到癫痫的发生与维持机制，可引起兴奋性突触传递的增强和增加突触后神经元的兴奋性[7]。在癫痫持续状态动物模型，PKC的激活可增强N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA)受体的表达，减少神经肽Y对谷氨酸释放的抑制，从而具有癫痫促进作用和潜在的癫痫诱导作用[18]。在培养的海马神经元PKC的抑制可拮抗CRH诱导的NMDA电流[19]。电点燃大鼠癫痫模型海马中PKC膜相关性活性大大增加，PKC注入海马脑片锥体神经元，增强了兴奋性突触后电位和点燃率[20]。我们研究在IS人体标本中发现PKC增高，并与上游CRHR1的表达和IS癫痫发作相关，提示PKC细胞内信号转导途径可能是CRH参与IS癫痫发病的重要机制，具体的作用靶标尚需进一步研究。
CRH可能通过PKC的作用促使星形胶质细胞增殖以及细胞胞质内Ga2+浓度升高[21, 22]，引起胶质细胞钙依赖性谷氨酸以及其他胶质递质的释放，从而增强局部脑组织兴奋性。并且CRH可诱导小鼠前脑原代小胶质细胞凋亡来调节神经炎症反应[23]。CRH与CRHR1结合通过ROI信号通路调节小鼠小胶质细胞分泌IL-18，也可促进肿瘤死因子-α和Fas-L的表达[24, 25]。本研究中发现，CRH主要表达于神经元，而其受体CRHR1和下游信号PKC高表达于神经元和胶质细胞，提示CRH可能由神经元分泌，作用于神经胶质细胞而诱导IS癫痫发作；同时我们发现CRHR1和PKC表达于小胶质细胞，提示CRH诱导的炎症反应也可能参与IS的发病过程，炎症与癫痫发病的关系已被大量研究所证实。
综上，我们首次在人体脑标本发现CRH、CRHR1及其下游信号PKC高表达于IS致痫灶，且与癫痫痉挛发作有相关性，提示CRH信号途径可能参与了IS的发病机制。这些结果可为解释ACTH治疗IS有效提供依据，并为进一步筛选IS的治疗靶点提供线索。
婴儿痉挛症(Infantile spasm, IS)是以年龄依赖性为特征的一种癫痫综合征, 主要临床特征为点头样痉挛发作、脑电图(EEG)呈高峰节律紊乱，且常伴精神发育迟滞，其发病机制尚不清楚。1958年Sorel和Dusaucy-Bayloye发现用促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone, ACTH)治疗IS有效[1]，至今仍是IS治疗的首选药物，但其作用机理尚未阐明。已发现IS患者脑脊液中ACTH和皮质醇都低于正常对照[2]，进一步研究提示ACTH是通过抑制促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin releasing hormone, CRH)在杏仁核中的表达发挥其抗癫痫作用[3]。已有较多动物实验结果显示CRH具有促癫痫作用，增加未成熟脑的兴奋性。因此，有学者认为IS是脑内CRH过多引起，但至今仍缺乏对IS患者脑组织的直接研究依据[4]。
CRH在大脑主要有两个受体--促肾上腺皮质激素释放激素1型受体(Corticotropin releasing hormone receptor 1, CRHR1)和2型受体CRHR2，CRH对CRHR1的亲和性较强，CRHR1被认为是CRH发挥效应的重要受体[5]。CRHR1和CRHR2属于G蛋白偶联受体家族，与CRH结合后启动环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)及三磷酸肌醇(Inositol 1，4，5-triphosphate，IP3)，进一步激活细胞内蛋白激酶A (Protein kinase A, PKA)和蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC)等信号途径发挥生物学效应[6]。PKC与癫痫发作关系密切，激活大鼠海马神经元PKC的电生理研究发现PKC与癫痫易感性有着重要的关系，参与癫痫的发生与维持机制[7]。CRH、CRHR1及其下游信号在人IS致痫灶中的作用尚不清楚，本研究检测CRH、CRHR1在IS患者致痫灶中的表达，进一步分析下游PKC信号分子的变化，有助于了解其在IS癫痫发作中的作用。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取第三军医大学新桥医院脑标本库中的IS患者手术标本(2011年6月-2014年6月)。所有标本的采集都在第三军医大学伦理委员会的指导下进行，脑标本的使用都符合赫尔辛基宣言，无任何为了试验目的而进行的标本采集与使用。入选标准：①符合IS的诊断标准, 即婴儿期起病且具有IS的3个特征：点头样痉挛发作、EEG高峰节律紊乱和精神发育迟滞；②包括ACTH及强的松在内的多种抗癫痫药物(AEDs)治疗无效，是手术介入的适应证[8]；③术前临床症状学、EEG及头颅核磁共振(MRI)和正电子发射断层显像(PET)检查等术前评估能够确定致痫灶。本组入选标本17例(表 1)。正常对照来自6例尸检，平均年龄2.8(1~5)岁，尸检时间＜24 h，均无癫痫相关病史，应激史及神经系统疾病，死亡前无濒死期(表 2)。
表1
IS患者的临床和神经病理学资料
Table1.
The clinical and neuropathological data in patients with IS
表2
对照组临床资料
Table2.
Clinical data of control group
1.2 组织准备
所有组织标本在获得时立即分成两份，一份浸泡于10%福尔马林缓冲液固定24 h后石蜡包埋, 石蜡包埋组织被切割成5 μm片用于HE染色及免疫组织化学染色，其他样本放于液氮冷冻。冷冻样本保持在-80℃冰箱用于Real-time PCR和Western Blot分析。
1.3 研究方法
1.3.1 Real-time PCR
用Real-time PCR检测IS致痫灶和尸检正常组织总RNA样本。用Trizol试剂(Invitrogen, La Jolla, CA)分离每个样本总RNA。NanoDropspectrophotometer (Ocean Optics, Dunedin, FL, USA)分光光度计在260/280 nm光下进行浓度和纯度鉴定。按反转录试剂盒(TakaRa, Otsu, Japan)说明，用1 μg RNA反转录得到cDNA。Real-time PCR反应所用引物由TAKARA生物技术有限公司合成(大连, 中国)，如下：CRH (forward：tccgagg agcctcccatc，reverse：aatctccatgagtttcctgttgc)，CRHR1(forward：gcctctgactcaccacgatg，reverse：tctgatgatgacac ctgacttctg)，β-actin (forward：gcaccacaccttctacaatgagc，reverse：tagcacagcctggatagcaacg)，CRHR2(forward: tcagccgtgaggaagaggtg, reverse: ggccgtctgcttgatgctgt)。Real-time PCR反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，CRH引物53.9℃延伸30 s (CRHR1引物53.9℃)，65℃溶解曲线，40个循环。mRNA表达水平的相对定量用2-△△CT法计算。所有样本都作3个复孔，每个基因重复2次。
1.3.2 Western blot
用Western Blot分析IS致痫灶与正常对照匀浆液。取100 mg冰冻标本按1：5 mL加裂解液匀浆机匀浆10 s，4℃下离心15 min，吸取上清置新EP管，用Bradford protein assay (Beyotime, China)测量总蛋白浓度及品质。将10%SDS胶置于电泳缓冲液中每孔点样50 μg蛋白量电泳分离。在甘氨酸转移缓冲液中恒流300 mA、80 min转膜，后置于用TBST液配置的5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加CRH单克隆兔抗人(1：2 000; Abcam, UK)，CRHR1多克隆羊抗人(1：500; Abcam, UK), PKC多克隆鼠抗人(1：600，Boster，China)，PKA多克隆兔抗人(1：400，Boster，China)，GAPDH单克隆兔抗人(1：1 000, CST, Beverly, USA)；4℃孵育过夜，TBST漂洗后加辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育1 h。GAPDH的表达水平作内参，化学发光法显影。
1.3.3 免疫组织化学及双标荧光染色
将石蜡包埋标本切5 μm片，贴片于防脱载玻片置60°烤箱1~2 h，取出脱蜡至水，常规HE染色，其余切片在0.3%双氧水甲醇稀释液中常温孵育30 min去除内源性过氧化物酶。置800 ml PBS (0.01 μmol/L, pH 7.3)中微波抗原修复(中高火20 min，室温冷却)，分别加CRH单克隆兔抗人(1：400; Abcam, UK)，CRHR1多克隆羊抗人(1：100; Abcam, UK), PKC多克隆鼠抗人(1：100，Boster，China)一抗4℃过夜，0.01 mmol/L PBS漂洗，加二抗37℃孵育1 h，用DAB显色，苏木素复染，阴性对照不加一抗，中性树胶封片显微镜下观察照相。荧光双标染色，加CRH单克隆兔抗人(1：250; Abcam, UK)，CRHR1多克隆羊抗人(1：50; Abcam, UK), PKC多克隆鼠抗人(1：50，Boster，China)，分别混合NF200单克隆鼠抗人(1：100，Boster，China), NF200多克隆兔抗人(1：200，Abcam，UK)，GFAP单克隆鼠抗人(1：400，Sigma), GFAP单克隆兔抗人(1：400，Abcam)，HLA单克隆鼠抗人(1：200, Dako, Denmark)，HLA单克隆兔抗人(1：200, Abcam)一抗4℃过夜，0.01 mmol/LPBS漂洗后加混合FITC结合二抗和AlexaFluor 594结合二抗(1：200; Boster, China)37℃孵育1 h，DAPI (10 μg/mL, Beyotime, China)染细胞核，荧光淬灭剂封片在激光共聚焦显微镜(TCS-TIV; Leica, Nussloch, Germany)下观察照相。
1.3.4 免疫组织化学染色评估分析方法
免疫组织化学染色IPP (Image Pro Plus)软件评估，每个标本随机选取3张切片，在×400视野下，于皮质逐层分别随机选取10个非重复区域，通过显微镜在1360×1024分辨率下拍摄图片；用IPP测量每张图片平均光密度值(Density mean, DM)，即我们首先校正光密度，设置感兴趣区色调为0~39，色彩饱和度0~255，强度0~255，然后把图片转换为灰度图片并计算其DM。
1.4 统计学方法
运用SPSS软件分析。数据均以均数±标准差表示，组间差异行单因素方差分析，用Spearman等级相关性分析法分析CRH、CRHR1和PKC之间的相关性，以及和临床特征的相关性。P值＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病例资料
研究入组17例IS患者标本，男12例，女5例。手术时平均月龄为29.4(9~58)个月，首次癫痫发作平均月龄为6.3(1~30)个月，病程19.2(8~46)个月。所有患儿都主要表现为频繁的痉挛性发作，部分患儿尚具有部分性发作和强直性发作，术前每月平均发作频率304(120~900)次。所有患儿均进行充分的术前评估，可以确定致痫灶位置并进行手术切除。所有患儿均行磁共振(MRI)和正电子断层扫描成像(PET)检查，MRI显示15例病灶，包括皮质发育障碍8例，萎缩或软化病灶7例；PET扫描17例均显示局灶性(11例)或半球性(6例)代谢减低，其中15例与MRI吻合，另其余2例与EEG吻合。EEG均表现为间歇期高度节律失常(8例)或变异型高度节律失常(9例，既往曾EEG显示典型高度节律失常)，发作期均显示为局灶起源(13例)或一侧半球起源(4例)。手术均采用局灶(7例)、灶中为中等至强的CRH (图 2c)表达于神经元。弱至中等CRHR1表达于神经元及胶质细胞(图 3b)，一侧半球多脑叶(6例)或半球切除(4例)。手术预后采用Engel分级：Ⅰ级12例，Ⅱ级3例，Ⅲ级2例。
图1
促肾上腺皮质激素释放激素和Ⅰ型受体激素在IS组和对照组表达水平的比较
a、b. CRH和CRHR1在IS致痫组织(
a、b. the mRNA expression of CRH and CRHR1 in IS group are higher than control group*
图2
促肾上腺皮质激素释放激素免疫组织化学检测结果
a. IS中FCDIa标本病理学特征; b-l. CRH在对照和IS致痫组织中免疫组化结果，CRH弱表达于对照神经元(b中箭头)，中等和强表达于IS致痫组织中神经元(c中箭头), 在IS致痫组织中CRH (绿色)与NF200(红色)共表达于神经元(d-f箭头)；GFAP阳性(红色)星形胶质细胞CRH表达阴性(g-i箭头)；HLA阳性(红色)小胶质细胞CRH表达阴性(j-l箭头).标尺: A-C, 50 μm；D-L 25 μm
Figure2. Immunohistochemical detection results of CRHa. Histopathologic characteristics of FCDIa in IS; b-l. Immunoreactivity (IR) detection results of CRH in control group and IS group. Weak CRHIR in the controls (b arrow), moderate to strong IR in IS (c arrow), CRH (green) and NF200 (red) both expressed in IS (d-f arrows); CRH is negative in GFAP positive astrocyte (g-i arrows); CRH is negative in HLA positive (red) microglial cell (j-l arrows). Scale: a-c, 50 μm; d-l 25 μm
图3
CRHR1免疫组织化学检测结果
a. IS中正常标本病理学特征; b-l：CRHR1在对照和IS致痫组织中免疫组化结果; b, c. CRHR1弱度及中度表达于对照神经元(b中箭头)，中等和强度表达于IS致痫组织中神经元(c中箭头)，IS致痫组织中CRHR1(绿色)与NF200(红色)共表达于神经元(d-f箭头)；CRHR1(绿色)与GFAP (红色)共表达于星型胶质细胞(g-i箭头)；CRHR1(绿色)与HLA (红色)共表达于小胶质细胞(j-l箭头).标尺: a-c, 50 μm; d-i 25 μm; j-l 10 μm
Figure3. Immunohistochemical detection results of CRHr1a. Histopathologic characteristics of IS; b-l. Immunohistochemical detection results of CRHR1 in control group and IS group. CRHR1 are weak to moderate in the controls (b arrow), moderate to strong in neurons (c arrow), CRHR1 (green) and NF200 (red) both expressed in IS (d-f arrows); CRHR1 (green) and GFAP (red) are both positive in astrocyte (g-i arrows); CRHR1 (green) and HLA (red) are both positive in microglial cell (j-l arrows). Scale: a-c, 50μm; d-i 25 μm; j-l 10 μm
2.2 促肾上腺皮质激素释放激素和Ⅰ型受体激素的Real-time PCR和Western Blot分析
用Real-time PCR检测CRH及CRHR1mRNA在IS致痫灶和正常对照中的表达，β-actin mRNA作为内参，结果显示IS致痫灶中CRH mRNA相对表达量显著高于对照组(图 1a)，CRHR1 mRNA在IS致痫灶中的表达较对照组升高(图 1b)。Western Blot结果显示CRH (图 1c)和CRHR1(图 1e)的蛋白条带分子量大约为25KDa和50KDa，用GAPDH (37KDa)作为内参作相对OD值分析，结果显示在IS致痫灶中CRH和CRHR1的蛋白表达水平均明显高于正常对照(图 1d、f)。
2.3 促肾上腺皮质激素释放激素和Ⅰ型受体激素的免疫组织化学分析
用免疫组织化学技术检测IS致痫灶和正常对照标本中的CRH和CRHR1的表达，结果显示，正常对照组中弱CRH表达于神经元(图 2b)，在IS致痫正常中等至强的CRHR1(图 3c)表达于神经元和胶质细胞。平均光密度也显示IS致痫灶标本CRH和CRHR1的表达明显高于对照组(表 3)，用Spearman等级相关性分析发现CRH和CRHR1表达强度与癫痫发作频率相关(CRH，R=0.671，P＜0.05；CRHR1，R=0.689，P＜0.05)，与其他临床特征未见明显相关性。荧光双标染色显示CRH与NF200共标于神经元(图 2d-f)。CRH未与GFAP和HLA共标于星形胶质细胞及小胶质细胞(图 2g-l)。CRHR1与NF200在神经元共标(图 3d-f)，与GFAP共标于星型胶质细胞(图 3g-i)，与HLA共标于小胶质细胞(图 3j-l)。
表3
对照组和婴儿痉挛症标本免疫组织化平均光密度值
Table3.
Density mean of control group and IS group
2.4 PKC的表达及细胞分布
用Western Blot检测PKC在IS致痫灶和正常对照中的表达，结果显示PKC的蛋白分子量约为80 KD (图 4a)，用GAPDH (37 KD)作为内参作相对OD值分析，PKC在IS致痫灶中的蛋白表达水平明显高于正常对照(图 4b)。HE染色检查示IS中胶质细胞非典型增生标本病理学特征(图 4c)。免疫组织化学分析PKC在IS致痫灶和正常对照中的表达，结果显示在正常对照为弱至中等的PKC表达于神经元和胶质细胞(图 4d)，IS致痫灶中为中等至强的PKC表达于神经元和胶质细胞(图 4e)。平均光密度值也显示IS在致痫灶标本中PKC的表达较正常对照升高(表 3)。荧光双标显示PKC与NF200在神经元共标(图 4f-h)。与GFAP共标与星形胶质细胞(图 4i-k)，与HLA共标于小胶质细胞(图 4l-n)。我们进一步评估了PKC的表达与CRHR1表达强度的相关性，用Spearman等级相关性分析发现PKC的表达强度与CRHR1的表达强度有相关性(R=0.855，P＜0.01)，与癫痫发作频率相关(R=0.72，P＜0.05)，与其他临床特征未见明显相关性。见图 5。
图4
PKC的表达及细胞分布
a, b. PKC在IS致痫组织中的表达较对照组明显增高(**
a, b. The expression of PKC is higher in IS group than control group (**
图5
婴儿痉挛症癫痫性痉挛与促肾上腺皮质激素释放激素和Ⅰ型受体, PKC表达相关性分析
a, b, c.散点图显示CRH，CRHR1和PKC的表达与IS癫痫性痉挛之间成正相关关系，Spearman等级相关系数：CRH: R=0.671,
a, b, c. Scatter diagram showed positive correlation between the expression of CRH, CRHR1, PKC with epileptic spasm in IS patients, Spearman coefficient: CRH: R=0.671,
3 讨论
本研究发现在IS患者致痫灶标本中，CRH和CRHR1在mRNA水平及蛋白水平的表达较对照组明显升高。CRH主要在神经元表达，其受体CRHR1则分布于神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。CRH和CRHR1的表达水平与IS癫痫性痉挛发作频率有相关性。免疫组织化学和Western blot检测发现PKC高表达于IS致痫灶，且与CRHR1的表达水平及癫痫发作频率存在相关性。结果提示：CRH-CRHR1-PKC信号通路可能参与IS的发病机制。
目前的研究表明在人IS患者脑脊液，ACTH和皮质醇都低于正常对照，而在IS动物模型中ACTH可抑制新生鼠海马CRH的表达发挥抗惊厥作用，据此推测脑组织中CRH表达过多诱导了IS发病[2, 3]。在动物实验中发现CRH能诱导不成熟大鼠惊厥，CRH注入大鼠侧脑室引起癫痫发作的剂量具有年龄依赖性，如在出生两周的大鼠比成年鼠小200多倍[9, 10]。在大鼠海马培养脑片实验显示海马多个亚区的兴奋性受到CRH的调节[9, 11]。对全身性癫痫发作患者尸检的结果也显示：大脑皮层CRH mRNA较对照组表达升高[12]。因此，Kristen等推测CRH可作用于大脑特异性皮质区而诱导IS癫痫发作，并提出IS的CRH发病假说[13]。但CRH发病学说尚未在IS患者致痫灶标本中获得直接支持依据。我们研究首次发现IS患者脑致痫灶中CRH明显升高，其受体CRHR1和下游信号PKC激活，且与癫痫发作频率相关，提示局部脑组织CRH过多有可能参与了IS癫痫发作机制。
在CRH的受体中，由于CRHR1的高亲和性和在脑内的分布特异性使其发挥主要作用。CRH与CRHR1结合后调节下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能，与应激、神经再生、神经免疫、肥胖及一些精神性疾病有关。CRH诱导的不成熟大鼠脑边缘性癫痫发作可以被CRHR1受体阻断剂阻断，提示CRH诱导不成熟脑惊厥作用可能由CRHR1介导[14]。该研究对人IS致痫灶标本的结果进一步支持这一观点，即CRHR1可能是IS中CRH发挥作用的重要受体。已经证实，在未成熟大脑，CRH可诱导CRHR1在细胞膜表达，而在较大年龄或成熟大鼠脑，这种CRH诱导CRHR1的作用减弱[15, 16]。本组对低龄(＜5岁)儿童脑组织标本的研究中发现CRH与CRHR1同时高表达现象，且与癫痫发作的频率相关，这也提示CRH可能诱导未成熟脑CRHR1的表达，从而在特定的未成熟脑发育阶段参与IS的特殊发病机制。IS具有起病于低龄婴儿，在脑发育成熟后痉挛发作消失的年龄依赖性临床特点，与CRH在未成熟脑特定发育阶段诱发癫痫和诱导CRHR1表达的现象相吻合，支持IS的CRH发病学说。
CRHR1的激活可以启动下游多个信号通路，如PKA、PKC等发挥其生物学效应。在小鼠海马神经元已经证实CRH通过CRH受体偶联Gs和Gq蛋白影响PKA和PKC信号通路[17]。进一步对海马锥体神经元的电生理研究发现PKC与癫痫易感性有着重要的关系，涉及到癫痫的发生与维持机制，可引起兴奋性突触传递的增强和增加突触后神经元的兴奋性[7]。在癫痫持续状态动物模型，PKC的激活可增强N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA)受体的表达，减少神经肽Y对谷氨酸释放的抑制，从而具有癫痫促进作用和潜在的癫痫诱导作用[18]。在培养的海马神经元PKC的抑制可拮抗CRH诱导的NMDA电流[19]。电点燃大鼠癫痫模型海马中PKC膜相关性活性大大增加，PKC注入海马脑片锥体神经元，增强了兴奋性突触后电位和点燃率[20]。我们研究在IS人体标本中发现PKC增高，并与上游CRHR1的表达和IS癫痫发作相关，提示PKC细胞内信号转导途径可能是CRH参与IS癫痫发病的重要机制，具体的作用靶标尚需进一步研究。
CRH可能通过PKC的作用促使星形胶质细胞增殖以及细胞胞质内Ga2+浓度升高[21, 22]，引起胶质细胞钙依赖性谷氨酸以及其他胶质递质的释放，从而增强局部脑组织兴奋性。并且CRH可诱导小鼠前脑原代小胶质细胞凋亡来调节神经炎症反应[23]。CRH与CRHR1结合通过ROI信号通路调节小鼠小胶质细胞分泌IL-18，也可促进肿瘤死因子-α和Fas-L的表达[24, 25]。本研究中发现，CRH主要表达于神经元，而其受体CRHR1和下游信号PKC高表达于神经元和胶质细胞，提示CRH可能由神经元分泌，作用于神经胶质细胞而诱导IS癫痫发作；同时我们发现CRHR1和PKC表达于小胶质细胞，提示CRH诱导的炎症反应也可能参与IS的发病过程，炎症与癫痫发病的关系已被大量研究所证实。
综上，我们首次在人体脑标本发现CRH、CRHR1及其下游信号PKC高表达于IS致痫灶，且与癫痫痉挛发作有相关性，提示CRH信号途径可能参与了IS的发病机制。这些结果可为解释ACTH治疗IS有效提供依据，并为进一步筛选IS的治疗靶点提供线索。
