引用本文： 周艺, 罗朝辉, 贺星惠, 肖波. Robo3在颞叶癫痫大鼠模型中的动态表达研究. 癫痫杂志, 2016, 2(1): 34-37. doi: 10.7507/2096-0247.20160007 复制
癫痫是一种以神经元异常放电为特征的神经系统慢性疾病，而其中颞叶癫痫(Temporal lobe epilepsy, TLE)是常见的发作类型之一，在难治性癫痫中也是最常见的类型。目前关于TLE发生发展机制仍不明确，而探究其发病机制对于治疗是至关重要的[1]。病理学研究发现轴突出芽、突触重建是TLE最主要的病理学特征，而轴突导向分子为轴突出芽和突触重建提供了导向作用[2]。在突触形成过程中，许多因子都参与了这一过程，而轴突导向分子在轴突生长，突触形成等方面有着重要作用。目前发现的轴突导向因子有四大类：Ephrins、Slits、Netrins和Semaphorins。其中Slit主要通过Robo介导对轴突生长的排斥反应参与神经轴突迁移，并且这种相互作用具有高度的遗传保守性。Fang等[3]对TLE患者脑组织和TLE大鼠进行的研究发现，在TLE患者中，Slit2呈现高表达，且主要表达于神经元和神经胶质细胞，而正常人组织中则主要表达于神经元；而在TLE大鼠模型中发现，Slit2在急性期和静止期表达逐渐下降，在慢性期表达则明显上升，故推测Slit2分子与TLE异常神经网络的形成密切相关。Robo家族(Robo 1~4)为跨膜蛋白，其中Robo1、2、3主要表达于神经系统，由胞外区、跨膜区、胞内区组成，其中胞外区由Ig样功能区和纤维连接蛋白组成。信号传递至神经细胞内之后, 需要激活下游的信号分子发挥调节作用，引起细胞骨架成分的重组和细胞粘连的改变，影响神经元的迁移和神经纤维的生长[4, 5]。相关研究表明，Slit-Robo结合后可以调节细胞内Rho家族鸟苷三磷酸酶(RhoGTPase)的活性，从而调整骨架蛋白和激动蛋白在细胞内的分布，进而引导轴突的生长和神经细胞的迁移[6]。
Robo3是Robo家族中的一员，在中枢神经系统中广泛表达[7]。本研究通过检测TLE大鼠模型中Robo3的动态表达及变化规律，以探讨其在TLE的发生发展过程的作用。
材料与方法
1 实验动物与分组
SPF级健康雄性SD大鼠36只，体重230～250 g；由中南大学实验动物中心提供，并饲养于适宜的环境中，给予正常饲料和饮水。大鼠随机分为6组(n=6)：1个对照组和5个实验组，5个实验组分别采用氯化锂-匹罗卡品(LiCl-PILO)腹腔注射致痫后1 d(急性期)，7、14 d(静止期)，30、60 d(慢性期)进行取材；对照组注射等量生理盐水。所有实验均严格遵照中南大学动物伦理委员会规定进行。
2 动物模型建立
癫痫组大鼠先予LiCl(Sigma，美国)125 mg/kg腹腔注射，18 h再给予匹罗卡品(Pilocarpine, PILO，Sigma，美国)20 mg/kg腹腔注射。按Racine分级，癫痫发作达到Ⅳ级或以上的大鼠视为合格实验模型。如大鼠发作等级未达Ⅳ级，则每30 min重复腹腔注射PILO 10 mg/kg，总共注射6次之后发作仍未达Ⅳ级则为致痫不成功。当大鼠癫痫发作达Ⅴ级或Ⅳ级以上并持续40 min后，所有大鼠给予10%水合氯醛3 mg/kg腹腔注射终止发作。对照组大鼠注射等量生理盐水。
3 标本处理
10%水合氯醛3 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，去颅骨，快速取整个脑组织于冰床上，再分离出海马组织，放入冻存管中，最后放入液氮中速冻后置于-80℃冰箱保存备用。
4 Quantitative RT-PCR检测mRNA表达水平
用TRIzol(Invitrogen，美国)提取海马组织总RNA，分光光度计测定波长260、280 nm的吸收值，样品A260/A280在1.8~2.1为合格。使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara，大连)将RNA逆转录成cDNA，GAPDH为内参基因, 两者的引物设计如下: Robo3上游：5′-TTGGATCGAGCAAGTGAGTG-3′, 下游:5′-GTGGGTT TCCTTTGGTCTCA-3′; GAPDH上游：5′-CTCATGACC ACAGTCCATGC-3′, 下游：5′-TTCAGCTCTGGGATG ACCTT-3′。PCR设定反应条件如下：95℃5min，95℃20 s, 60℃30 s(40个循环)。利用7500 PCR系统软件对信号进行分析，观察扩增曲线、溶解曲线，每个实验样本重复三次，使用2-ΔΔCt法计算样本的相对表达值，观察Robo3 mRNA的表达水平。
5 Western blot检测蛋白表达水平
将海马组织至于研钵中，加入RIPA裂解液(普利莱，北京)在冰上捣碎，用BCA法测定蛋白浓度。分别配制10%的分离胶和4%的浓缩胶，将各组变性后的蛋白样品加至每孔中，开始电泳，浓缩胶电泳电压为80V，分离胶电泳电压为120V，待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。选取β-actin为内参基因。电泳结束后，以300 mA恒流转膜1.5 h，用5%的脱脂奶粉在室温下封闭1 h后加入一抗(Robo3: Proteintech, 美国, 1 :200；β-actin: Proteintech, 美国, 1:4 000)，4℃孵育过夜，孵育结束后用TBST洗3次，每次15 min，再加入HRP标记的二抗(Proteintech, 美国，1 :3 000)，孵育45 min，结束后用TBST洗3次，每次15 min。最后用ECL发光液进行显色曝光，采用proteinsimple化学发光仪器扫描收集图像。
6 统计学方法
采用SPSS 20.0软件包进行统计分析。各实验组与对照组间所测得数据采用独立样本t检验方法进行数据分析，组间比较采用One-way ANOVA分析方法进行数据分析，所得结果采用均值±标准差表示，P值< 0.05为差异有统计学意义。
结果
1 动物行为学观察
对照组大鼠无抽搐等异常表现，实验组大鼠在腹腔注射PILO后开始出现癫痫样发作，造模成功的大鼠中有3只大鼠分别在造模后1 d和3 d死亡，死亡率为6.8%。有4只大鼠一直未出现Ⅳ级或Ⅳ级以上发作，造模成功率为86.7%(26/30)。在慢性期的观察中，有3只大鼠没有出现自发痫性发作，予以剔除。
2 Quantitative RT-PCR
在对照组中，Robo3-mRNA的表达量较低；与对照组相比，致痫后急性期大鼠海马中Robo3-mRNA的水平无明显变化(P > 0.05)，而在致痫后的静止期和慢性期则逐渐降低，分别为对照组的0.67倍和0.53倍，至慢性期达最低值(P < 0.05)。实验组各组间的表达量均无统计学差异(P > 0.05)。见图 1。
图1
对照组和不同时间点实验组Robo3 mRNA相对表达量(* P < 0.05)
Figure1.
Relative expression of Robo3 mRNA in the control group and experimental groups (* P < 0.05)
3 Western blot
与PCR的结果相一致，在55kDa的位置上有阳性杂交带。在对照组中，Robo3的表达量较低；与对照组相比，致痫后急性期大鼠海马中Robo3的表达水平无明显变化(P > 0.05)，而在致痫后的静止期和慢性期则逐渐降低，分别为对照组的0.68倍和0.41倍，至慢性期达最低值(P < 0.05)。实验组各组间的表达量均无明显差异(P > 0.05)。见图 2。
图2
对照组和不同时间点实验组Robo3蛋白的表达量(* P < 0.05)
Figure2.
Relative expression of Robo3 protein in the control group and experimental groups (* P < 0.05)
讨论
癫痫的病因复杂，目前尚未有明确的定论，以往针对癫痫发病机制的研究发现，神经递质异常、离子通道基因突变、神经胶质细胞功能异常、突触联系异常、遗传因素等都与癫痫的发作密切相关[8]。而大量的研究发现，在基因或者其他不良环境的作用下，神经细胞会出现异常的电生理活动，进而导致神经细胞的异常生长，出现神经网络的重组，这些异常的神经网络又会导致神经细胞的兴奋性增高，故癫痫与异常的突触形成密切相关，这也是癫痫病因学假说的一种[9]。在TLE中，最主要的病理学特点就是在海马的多个部位可见轴突出芽与突触重建，所以在TLE发病机制的研究中，突触机制开始受到越来越多的关注。
轴突导向因子参与轴突的形成过程，它们通过接触吸引、接触排斥、化学吸引、化学排斥参与轴突的生长调节。其在脊椎动物中枢神经正常发育过程中有着重要的作用，并且在成年的脑组织中仍然有着广泛的表达，这就表明轴突导向分子可能参与了中枢神经系统兴奋性网络的调节。Robo家族是轴突导向因子Slits的配体，Robo3广泛表达于中枢神经系统，1999年，Yuan等[10]首先克隆出Robo3基因，Chen等[11]在随后的研究中发现，Robo3在脊髓的发育中的动态表达变化与Robo1、2不同，Robo1、2在没有跨越中线以前为低表达，跨越中线后则出现高表达；而Robo3在跨越中线前后的表达变化刚好与Robo1、2相反。Rajagopalan等[12, 13]发现，如果Robo3发生突变，则轴突就会偏离原来的位置进行生长，从而影响神经发育。还有研究在小鼠的发育过程中发现，Robo3与Cajial-retzius(CR)细胞和中间神经元共表达于壁层和皮质边缘，并且在Robo3基因突变的小鼠中，皮质的中间神经元的形态发生了变化，故推测Robo3可能参与了皮质发育过程中中间神经元的迁移和形态分化[14]。但关于Robo3是否参加了TLE海马环路内的轴突出芽与突触重建目前尚未有研究。而本实验发现，在PILO致痫后的大鼠模型中，Robo3的表达量和对照组相比是有差异的：在静止期和慢性期，Robo3的含量持续降低(P < 0.05)，并且在慢性期达到了最低值。如前述，Robo3需要与其下游信号分子结合后方可实现其生物学效应，以往的研究表明，Slit-Robo信号通路的下游分子为srGAP家族[15]，活化后的srGAP可以使Rho GTPases失活，而Rho GTPases在细胞骨架肌动蛋白的合成中有着重要的作用，并参与轴突的形成[16]。当Robo3的表达发生变化后，其下游被激活的srGAP家族也就会发生变化，从而引起轴突生长的异常。故猜测在正常的生理状态下，轴突导向分子主要起到维持正常神经网络的作用，而当神经元出现异常放电后，轴突导向分子及其受体的表达开始下调，轴突开始异位生长，建立起异常的神经网络，导致了神经元的异常放电，从而诱发癫痫。且本实验发现Robo3的含量在慢性期达到了最低值，而在慢性期模型中，大鼠出现痫性自发发作，也进一步证实Robo3表达量的降低与癫痫发作密切相关。
综上所述，本实验的研究发现，在LiCl-PILO的TLE大鼠模型中，Robo3在静止期和慢性期的大鼠海马中的表达随着时间的推移逐渐降低，并且在慢性期达到了最低值，表明Robo3可能参与了TLE的病理生理过程，推测其可能通过轴突导向作用参与TLE海马环路内的轴突出芽及突触重建，从而促进了TLE的形成与发展。但其在疾病中扮演的具体角色还不清楚，需要进一步深入研究，从而为其成为高特异性、敏感性的生物标记物提供依据，为抗癫痫药物的新的靶点提供方向。
癫痫是一种以神经元异常放电为特征的神经系统慢性疾病，而其中颞叶癫痫(Temporal lobe epilepsy, TLE)是常见的发作类型之一，在难治性癫痫中也是最常见的类型。目前关于TLE发生发展机制仍不明确，而探究其发病机制对于治疗是至关重要的[1]。病理学研究发现轴突出芽、突触重建是TLE最主要的病理学特征，而轴突导向分子为轴突出芽和突触重建提供了导向作用[2]。在突触形成过程中，许多因子都参与了这一过程，而轴突导向分子在轴突生长，突触形成等方面有着重要作用。目前发现的轴突导向因子有四大类：Ephrins、Slits、Netrins和Semaphorins。其中Slit主要通过Robo介导对轴突生长的排斥反应参与神经轴突迁移，并且这种相互作用具有高度的遗传保守性。Fang等[3]对TLE患者脑组织和TLE大鼠进行的研究发现，在TLE患者中，Slit2呈现高表达，且主要表达于神经元和神经胶质细胞，而正常人组织中则主要表达于神经元；而在TLE大鼠模型中发现，Slit2在急性期和静止期表达逐渐下降，在慢性期表达则明显上升，故推测Slit2分子与TLE异常神经网络的形成密切相关。Robo家族(Robo 1~4)为跨膜蛋白，其中Robo1、2、3主要表达于神经系统，由胞外区、跨膜区、胞内区组成，其中胞外区由Ig样功能区和纤维连接蛋白组成。信号传递至神经细胞内之后, 需要激活下游的信号分子发挥调节作用，引起细胞骨架成分的重组和细胞粘连的改变，影响神经元的迁移和神经纤维的生长[4, 5]。相关研究表明，Slit-Robo结合后可以调节细胞内Rho家族鸟苷三磷酸酶(RhoGTPase)的活性，从而调整骨架蛋白和激动蛋白在细胞内的分布，进而引导轴突的生长和神经细胞的迁移[6]。
Robo3是Robo家族中的一员，在中枢神经系统中广泛表达[7]。本研究通过检测TLE大鼠模型中Robo3的动态表达及变化规律，以探讨其在TLE的发生发展过程的作用。
材料与方法
1 实验动物与分组
SPF级健康雄性SD大鼠36只，体重230～250 g；由中南大学实验动物中心提供，并饲养于适宜的环境中，给予正常饲料和饮水。大鼠随机分为6组(n=6)：1个对照组和5个实验组，5个实验组分别采用氯化锂-匹罗卡品(LiCl-PILO)腹腔注射致痫后1 d(急性期)，7、14 d(静止期)，30、60 d(慢性期)进行取材；对照组注射等量生理盐水。所有实验均严格遵照中南大学动物伦理委员会规定进行。
2 动物模型建立
癫痫组大鼠先予LiCl(Sigma，美国)125 mg/kg腹腔注射，18 h再给予匹罗卡品(Pilocarpine, PILO，Sigma，美国)20 mg/kg腹腔注射。按Racine分级，癫痫发作达到Ⅳ级或以上的大鼠视为合格实验模型。如大鼠发作等级未达Ⅳ级，则每30 min重复腹腔注射PILO 10 mg/kg，总共注射6次之后发作仍未达Ⅳ级则为致痫不成功。当大鼠癫痫发作达Ⅴ级或Ⅳ级以上并持续40 min后，所有大鼠给予10%水合氯醛3 mg/kg腹腔注射终止发作。对照组大鼠注射等量生理盐水。
3 标本处理
10%水合氯醛3 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，去颅骨，快速取整个脑组织于冰床上，再分离出海马组织，放入冻存管中，最后放入液氮中速冻后置于-80℃冰箱保存备用。
4 Quantitative RT-PCR检测mRNA表达水平
用TRIzol(Invitrogen，美国)提取海马组织总RNA，分光光度计测定波长260、280 nm的吸收值，样品A260/A280在1.8~2.1为合格。使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara，大连)将RNA逆转录成cDNA，GAPDH为内参基因, 两者的引物设计如下: Robo3上游：5′-TTGGATCGAGCAAGTGAGTG-3′, 下游:5′-GTGGGTT TCCTTTGGTCTCA-3′; GAPDH上游：5′-CTCATGACC ACAGTCCATGC-3′, 下游：5′-TTCAGCTCTGGGATG ACCTT-3′。PCR设定反应条件如下：95℃5min，95℃20 s, 60℃30 s(40个循环)。利用7500 PCR系统软件对信号进行分析，观察扩增曲线、溶解曲线，每个实验样本重复三次，使用2-ΔΔCt法计算样本的相对表达值，观察Robo3 mRNA的表达水平。
5 Western blot检测蛋白表达水平
将海马组织至于研钵中，加入RIPA裂解液(普利莱，北京)在冰上捣碎，用BCA法测定蛋白浓度。分别配制10%的分离胶和4%的浓缩胶，将各组变性后的蛋白样品加至每孔中，开始电泳，浓缩胶电泳电压为80V，分离胶电泳电压为120V，待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。选取β-actin为内参基因。电泳结束后，以300 mA恒流转膜1.5 h，用5%的脱脂奶粉在室温下封闭1 h后加入一抗(Robo3: Proteintech, 美国, 1 :200；β-actin: Proteintech, 美国, 1:4 000)，4℃孵育过夜，孵育结束后用TBST洗3次，每次15 min，再加入HRP标记的二抗(Proteintech, 美国，1 :3 000)，孵育45 min，结束后用TBST洗3次，每次15 min。最后用ECL发光液进行显色曝光，采用proteinsimple化学发光仪器扫描收集图像。
6 统计学方法
采用SPSS 20.0软件包进行统计分析。各实验组与对照组间所测得数据采用独立样本t检验方法进行数据分析，组间比较采用One-way ANOVA分析方法进行数据分析，所得结果采用均值±标准差表示，P值< 0.05为差异有统计学意义。
结果
1 动物行为学观察
对照组大鼠无抽搐等异常表现，实验组大鼠在腹腔注射PILO后开始出现癫痫样发作，造模成功的大鼠中有3只大鼠分别在造模后1 d和3 d死亡，死亡率为6.8%。有4只大鼠一直未出现Ⅳ级或Ⅳ级以上发作，造模成功率为86.7%(26/30)。在慢性期的观察中，有3只大鼠没有出现自发痫性发作，予以剔除。
2 Quantitative RT-PCR
在对照组中，Robo3-mRNA的表达量较低；与对照组相比，致痫后急性期大鼠海马中Robo3-mRNA的水平无明显变化(P > 0.05)，而在致痫后的静止期和慢性期则逐渐降低，分别为对照组的0.67倍和0.53倍，至慢性期达最低值(P < 0.05)。实验组各组间的表达量均无统计学差异(P > 0.05)。见图 1。
图1
对照组和不同时间点实验组Robo3 mRNA相对表达量(* P < 0.05)
Figure1.
Relative expression of Robo3 mRNA in the control group and experimental groups (* P < 0.05)
3 Western blot
与PCR的结果相一致，在55kDa的位置上有阳性杂交带。在对照组中，Robo3的表达量较低；与对照组相比，致痫后急性期大鼠海马中Robo3的表达水平无明显变化(P > 0.05)，而在致痫后的静止期和慢性期则逐渐降低，分别为对照组的0.68倍和0.41倍，至慢性期达最低值(P < 0.05)。实验组各组间的表达量均无明显差异(P > 0.05)。见图 2。
图2
对照组和不同时间点实验组Robo3蛋白的表达量(* P < 0.05)
Figure2.
Relative expression of Robo3 protein in the control group and experimental groups (* P < 0.05)
讨论
癫痫的病因复杂，目前尚未有明确的定论，以往针对癫痫发病机制的研究发现，神经递质异常、离子通道基因突变、神经胶质细胞功能异常、突触联系异常、遗传因素等都与癫痫的发作密切相关[8]。而大量的研究发现，在基因或者其他不良环境的作用下，神经细胞会出现异常的电生理活动，进而导致神经细胞的异常生长，出现神经网络的重组，这些异常的神经网络又会导致神经细胞的兴奋性增高，故癫痫与异常的突触形成密切相关，这也是癫痫病因学假说的一种[9]。在TLE中，最主要的病理学特点就是在海马的多个部位可见轴突出芽与突触重建，所以在TLE发病机制的研究中，突触机制开始受到越来越多的关注。
轴突导向因子参与轴突的形成过程，它们通过接触吸引、接触排斥、化学吸引、化学排斥参与轴突的生长调节。其在脊椎动物中枢神经正常发育过程中有着重要的作用，并且在成年的脑组织中仍然有着广泛的表达，这就表明轴突导向分子可能参与了中枢神经系统兴奋性网络的调节。Robo家族是轴突导向因子Slits的配体，Robo3广泛表达于中枢神经系统，1999年，Yuan等[10]首先克隆出Robo3基因，Chen等[11]在随后的研究中发现，Robo3在脊髓的发育中的动态表达变化与Robo1、2不同，Robo1、2在没有跨越中线以前为低表达，跨越中线后则出现高表达；而Robo3在跨越中线前后的表达变化刚好与Robo1、2相反。Rajagopalan等[12, 13]发现，如果Robo3发生突变，则轴突就会偏离原来的位置进行生长，从而影响神经发育。还有研究在小鼠的发育过程中发现，Robo3与Cajial-retzius(CR)细胞和中间神经元共表达于壁层和皮质边缘，并且在Robo3基因突变的小鼠中，皮质的中间神经元的形态发生了变化，故推测Robo3可能参与了皮质发育过程中中间神经元的迁移和形态分化[14]。但关于Robo3是否参加了TLE海马环路内的轴突出芽与突触重建目前尚未有研究。而本实验发现，在PILO致痫后的大鼠模型中，Robo3的表达量和对照组相比是有差异的：在静止期和慢性期，Robo3的含量持续降低(P < 0.05)，并且在慢性期达到了最低值。如前述，Robo3需要与其下游信号分子结合后方可实现其生物学效应，以往的研究表明，Slit-Robo信号通路的下游分子为srGAP家族[15]，活化后的srGAP可以使Rho GTPases失活，而Rho GTPases在细胞骨架肌动蛋白的合成中有着重要的作用，并参与轴突的形成[16]。当Robo3的表达发生变化后，其下游被激活的srGAP家族也就会发生变化，从而引起轴突生长的异常。故猜测在正常的生理状态下，轴突导向分子主要起到维持正常神经网络的作用，而当神经元出现异常放电后，轴突导向分子及其受体的表达开始下调，轴突开始异位生长，建立起异常的神经网络，导致了神经元的异常放电，从而诱发癫痫。且本实验发现Robo3的含量在慢性期达到了最低值，而在慢性期模型中，大鼠出现痫性自发发作，也进一步证实Robo3表达量的降低与癫痫发作密切相关。
综上所述，本实验的研究发现，在LiCl-PILO的TLE大鼠模型中，Robo3在静止期和慢性期的大鼠海马中的表达随着时间的推移逐渐降低，并且在慢性期达到了最低值，表明Robo3可能参与了TLE的病理生理过程，推测其可能通过轴突导向作用参与TLE海马环路内的轴突出芽及突触重建，从而促进了TLE的形成与发展。但其在疾病中扮演的具体角色还不清楚，需要进一步深入研究，从而为其成为高特异性、敏感性的生物标记物提供依据，为抗癫痫药物的新的靶点提供方向。
