引用本文： 徐婷, 袁名扬, 侯德仁. 多发性硬化与炎症性肠病的因果关联：一项两样本双向孟德尔随机化研究. 中国循证医学杂志, 2024, 24(8): 893-898. doi: 10.7507/1672-2531.202311156 复制
多发性硬化症是一种可以影响中枢神经系统的自身免疫性疾病。最常见的临床表现是视神经炎、脑干和脊髓综合征[1]。它是影响年轻成人中最常见的非创伤性致残性疾病。过去几年里，多发性硬化症患病率呈显著上升趋势[2]。最新估计表明，全球受多发性硬化症影响的人数超过200万[3]。现有研究已证实，多发性硬化症的发展受环境暴露和遗传易感性的影响，但该疾病的确切发病机制尚未完全阐明[4]。有研究表明，自身免疫性疾病的存在与多发性硬化症的易感性增加有关[5]。多发性硬化症与其他自身免疫性疾病之间可能存在共享的遗传因素或环境因素暴露[6]。
炎症性肠病是一组慢性炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，主要影响消化道的黏膜层。炎症性肠病的病因在很大程度上仍然未知，目前主要认为其是由个体的遗传易感性催化下对肠道微生物的异常和持续的免疫反应引起的[7]。既往的很多观察性研究发现，炎症性肠病与多发性硬化相互合并的风险增加[8, 9]，2022年发布的一项系统评价发现，多发性硬化症患者中炎症性肠病的患病率更高，反之，在多发性硬化症患者中，发生克罗恩病或溃疡性结肠炎的风险同样较高[10]。
这些研究表明多发性硬化与炎症性肠病之间似乎存在某种关联，但是这些研究并不能说明二者存在因果关系，因为观察性研究易受到混杂因素的反向因果关系的影响，从而使两者间的方向性和因果关系仍存在不确定性。因此，有必要利用更可靠的方法来评估疾病之间的因果关系。
孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）是一种遗传流行病学方法，利用单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms，SNP）作为工具变量，评估暴露与结果之间的潜在因果关系[11]。混杂因素是流行病学研究中因果推断的重要妨碍因素。然而，MR是利用基因变异在后代中的随机分配原则，因为个体的基因型在受孕时确定，并在此后保持不变[12]。因此MR可以尽量绕过潜在问题，如混杂因素、逆向因果偏倚以及观察性研究中随机对照实验的代表性和可行性等来推断因果关联。据我们所知，目前还没有可用的MR研究多发性硬化与炎症性肠病之间可能的因果关系。因此，我们决定应用MR方法来研究多发性硬化与炎症性肠病的因果关联。
1 方法
1.1 研究设计
本研究从全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）数据库中筛选了多发性硬化、溃疡性结肠炎与克罗恩病的数据集进行双向MR分析。MR分析需要满足以下三个假设：① 工具变量与暴露因素（多发性硬化）强相关；② 工具变量不和混杂因素相关；③ 工具变量只能通过暴露因素影响结局变量（炎症性肠病）。反向MR研究将炎症性肠病作为暴露变量，多发性硬化作为结局变量，但仍遵循以上三大假设。
1.2 数据来源
本研究的数据来自OpenGWAS公开可获取的疾病数据库。研究数据来源见表1。
表1
双样本MR研究中GWAS数据库的基本特征
1.3 SNP的选择
本研究根据MR研究的核心假设使用R软件包TwoSampleMR来确定所使用的SNP。首先，筛选出与暴露因素多发性硬化、溃疡性结肠炎和克罗恩病有显著相关的SNP（P=5×10−8），并调整参数r2=0.001，kb=10 000，去除r2>0.001的SNP，以排除连锁不平衡的影响。然后再将暴露变量和结局变量合并，对齐等位基因，排除具有中间等位基因频率的回文SNP。并利用MR-PRESSO检验[13]剔除离群SNP。最后计算F统计量确保不存在弱工具变量（F>10），F统计量计算公式为
[14]。
1.4 MR分析
在协同了暴露与结局的GWAS效应等位基因后，使用逆方差加权（inverse variance weighted，IVW）[15]、加权中位数法（weighted median，WM）[16]、MR-Egger[17]方法进行MR分析。IVW方法因为较为准确，作为分析结果的主要方法，另外两种方法用以辅助分析，用以判断和IVW方法所得到的结论方向是否一致。为了确保分析结果的稳健性和有效性，我们还进行了敏感性分析。Cochran’s Q检验[18]来检查异质性，MR-Egger回归方法通过截距项评估潜在的多效性。此外，还使用了留一法进行敏感性分析，以判断单个SNP是否对每个MR研究的结果产生过大影响。
1.5 统计分析
采用R软件（版本4.1.2）进行统计分析。将P<0.05视为有统计学意义。结果以比值比（odds ratio，OR）及其相应的95%可信区间（confidence interval，CI）呈现。当OR>1且P<0.05时，表示正相关；当OR<1且P<0.05时，表示负相关。这些统计阈值用于评估变量之间关系的强度和显著性。
2 结果
2.1 多发性硬化与炎症性肠病的因果影响
2.1.1 多发性硬化与溃疡性结肠炎的因果效应
多发性硬化数据集中共筛选出49个与多发性硬化显著相关的独立SNP，当这些SNP与结局变量溃疡性结肠炎相关联时，有5个SNP丢失，但未发现回文SNP。MR-PRESSO分析时发现15个离群SNP（rs1131265、rs11554159、rs12210359、rs2857700、rs3748817、rs4410871、rs4780355、rs4796791、rs4976646、rs60600003、rs7923837、rs842639、rs926382、3rs9277535、rs9967792）。将上诉SNP剔除后再次进行IVW分析，结果显示，遗传预测的多发性硬化患者发生溃疡性结肠炎风险升高［IVW：OR=1.07，95%CI（1.012，1.134），P=0.018］。WM与MR-Egger方法与IVW方法得到的结果方向一致（表2）。Cochran’ Q检验结果显示P<0.05，表明存在异质性，但本研究采用随机效应模型进行分析，减少了异质性影响。MR-Egger截距并未显示水平多效性（intercept=0.003，P=0.81）。留一法分析表明，该结果并不受单个SNP影响（图1）。
表2
多发性硬化与溃疡性结肠炎发生风险的两样本孟德尔随机化分析
图1
多发性硬化对溃疡性结肠炎的留一法分析结果
2.1.2 多发性硬化与克罗恩病的因果效应
当49个SNP与结局变量克罗恩病相关联时，有4个SNP丢失。同时发现了6个回文SNP（rs1131265、rs12296430、rs1359062、rs212405、rs9736016、rs9989735），去除它们后，IVW分析［OR=1.043，95%CI（0.959，1.134），P=0.328］未发现多发性硬化对克罗恩病之间的因果关联。MR-PRESSO分析发现离群值，但是去除这些离群SNP后，还剩30个SNP进行分析，并不影响最终结果［OR=0.987，95%CI（0.922，1.057），P=0.715］（图2a）。Cochran Q检验（P<0.05）表明存在异质性。多效性检验MR-Egger回归的截距为−0.005（P=0.627），表明不存在潜在的水平多效性。留一分析表明，rs2857700与其他SNP扮演着矛盾的角色（图2b）。
图2
多发性硬化对克罗恩病的MR分析结果
a：MR分析结果；b：留一法分析结果。
2.2 反向MR分析
以炎症性肠病为暴露因素，多发性硬化为结局变量。溃疡性结肠炎数据库中筛选出87个与溃疡性结肠炎显著相关的独立SNP，经过筛选后，最终确定71个SNP作为工具变量，IVW结果显示，溃疡性结肠炎对多发性硬化存在影响［IVW：OR=1.109，95%CI（1.005，1.165），P<0.001］，但是MR-Egger分析与IVW分析结果方向不一致（图3a），因此认为溃疡性结肠炎和多发性硬化之间可能不存在因果效应。从克罗恩病数据库中确定了44个SNP作为工具变量，IVW表明克罗恩病和多发性硬化之间不存在因果效应［IVW：OR=1.027，95%CI（0.981，1.075），P=0.248］（图3b）。两个结果的敏感性分析均显示反向MR的结果可靠（图4a、图4b）。
图3
反向MR分析结果
a：溃疡性结肠炎；b：克罗恩病。
图4
反向MR敏感性分析结果
a：溃疡性结肠炎；b：克罗恩病。
3 讨论
本研究进行了双向和双样本MR研究，以检验多发性硬化与炎症性肠病风险之间的因果效应。研究结果支持多发性硬化是溃疡性结肠炎发病风险的危险因素，但不是克罗恩病的危险因素。且本研究没有证据表明克罗恩病与溃疡性结肠炎和多发性硬化的发病风险存在因果关系。
在既往的流行病学研究中，普遍认为多发性硬化与溃疡性结肠炎之间存在关联，但是具体的关系尚存在争议。Nabizadeh等[19]在2023年的一项Meta分析发现溃疡性结肠炎可使多发性硬化症的风险增加50%以上，但多发性硬化症不会增加溃疡性结肠炎发生的风险。但另一项有关多发性硬化与炎症性肠病的Meta分析则认为多发性硬化症患者患溃疡性结肠炎的风险增加，反之亦然[10]。2021年，Yang等[20]一项关于多发性硬化症和炎症性肠病之间的共同遗传结构的研究认为，多发性硬化和溃疡性结肠炎之间的遗传相关性明显大于多发性硬化和克罗恩病之间的遗传相关性，我们的研究结果与这一观点契合。
溃疡性结肠炎是一种慢性疾病，始于直肠，通常以连续方式向近端延伸，穿过部分或整个结肠，其炎症侵袭局限于黏膜表面[21]。其发病机制涉及肠道微生物群的生态失调，炎症应激导致肠道屏障功能破坏，免疫反应失衡等[22]。因此多发性硬化与溃疡性结肠炎的关联机制可能涉及以下几个方面。第一、可能与辅助性T细胞（Th）17细胞有关，既往多发性硬化与溃疡性结肠炎的免疫机制研究表明，Th17细胞及其分泌的细胞因子在多发性硬化与溃疡性结肠炎都发挥了作用。溃疡性结肠炎局部可产生较多的白细胞介素（IL）、IL-13和Th17细胞因子，细胞因子的作用导致肠道黏膜的炎症反应，引起溃疡性结肠炎的病理改变[23]。在多发性硬化症中，应激诱导的Th17细胞活化参与了神经元损伤和炎症过程。这些细胞因子可能导致血脑屏障的破坏，使得免疫细胞进入中枢神经系统，引发炎症反应并损伤神经组织[24]。多发性硬化与溃疡性结肠炎IL-17生成增加表明Th17细胞共同参与两种疾病的作用机制。第二，可能与脑与肠道的相互作用相关，微生物群在维持肠道屏障平衡方面起着重要作用，值得注意的是，常见的多发性硬化动物模型中也观察到了微生物群的改变[25]。肠道微环境有能力调节自身反应性T细胞的激活和分化，并将它们引导到中枢神经系统[26]。当肠道通透性发生变化时，通过黏膜的有害或免疫原性抗原进入的流量增加，从而导致调节或持续的神经免疫失调[27]。目前还需要进一步的基础研究来探索这种关系背后的潜在共享机制。
本研究有以下优势，首先，这是首次利用公共数据库和双样本孟德尔随机化方法来评估多发性硬化症和炎症性肠病之间的因果关系。与传统的观察性研究相比，这种方法减少了混杂因素、反向因果关系和暴露偏倚等因素对结果造成的影响。其次，我们还使用了多种MR方法来获得更准确的结果。最后，采用敏感性分析方法验证了研究结果的可靠性。当然，我们的研究也存在一些局限性。本研究中所使用数据库的研究人群主要是欧洲人群。因此，在将本研究的结论应用于其他种族群体时，有必要谨慎处理。此外，GWAS数据来自不同机构的数据，可能使用疾病诊断标准不同，而且缺乏按年龄、性别分组的亚组数据，无法比较亚组间的因果效应差异。
总的来说，本研究为多发性硬化症和炎症性肠病之间的因果关系提供了更新和更可靠的证据，本研究显示多发性硬化会增加溃疡性结肠炎的发生风险。因此临床医生应警惕多发性硬化患者的炎症性肠病发病风险，及时进行早期筛查与治疗。
声明 本文无任何利益冲突。
多发性硬化症是一种可以影响中枢神经系统的自身免疫性疾病。最常见的临床表现是视神经炎、脑干和脊髓综合征[1]。它是影响年轻成人中最常见的非创伤性致残性疾病。过去几年里，多发性硬化症患病率呈显著上升趋势[2]。最新估计表明，全球受多发性硬化症影响的人数超过200万[3]。现有研究已证实，多发性硬化症的发展受环境暴露和遗传易感性的影响，但该疾病的确切发病机制尚未完全阐明[4]。有研究表明，自身免疫性疾病的存在与多发性硬化症的易感性增加有关[5]。多发性硬化症与其他自身免疫性疾病之间可能存在共享的遗传因素或环境因素暴露[6]。
炎症性肠病是一组慢性炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，主要影响消化道的黏膜层。炎症性肠病的病因在很大程度上仍然未知，目前主要认为其是由个体的遗传易感性催化下对肠道微生物的异常和持续的免疫反应引起的[7]。既往的很多观察性研究发现，炎症性肠病与多发性硬化相互合并的风险增加[8, 9]，2022年发布的一项系统评价发现，多发性硬化症患者中炎症性肠病的患病率更高，反之，在多发性硬化症患者中，发生克罗恩病或溃疡性结肠炎的风险同样较高[10]。
这些研究表明多发性硬化与炎症性肠病之间似乎存在某种关联，但是这些研究并不能说明二者存在因果关系，因为观察性研究易受到混杂因素的反向因果关系的影响，从而使两者间的方向性和因果关系仍存在不确定性。因此，有必要利用更可靠的方法来评估疾病之间的因果关系。
孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）是一种遗传流行病学方法，利用单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms，SNP）作为工具变量，评估暴露与结果之间的潜在因果关系[11]。混杂因素是流行病学研究中因果推断的重要妨碍因素。然而，MR是利用基因变异在后代中的随机分配原则，因为个体的基因型在受孕时确定，并在此后保持不变[12]。因此MR可以尽量绕过潜在问题，如混杂因素、逆向因果偏倚以及观察性研究中随机对照实验的代表性和可行性等来推断因果关联。据我们所知，目前还没有可用的MR研究多发性硬化与炎症性肠病之间可能的因果关系。因此，我们决定应用MR方法来研究多发性硬化与炎症性肠病的因果关联。
1 方法
1.1 研究设计
本研究从全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）数据库中筛选了多发性硬化、溃疡性结肠炎与克罗恩病的数据集进行双向MR分析。MR分析需要满足以下三个假设：① 工具变量与暴露因素（多发性硬化）强相关；② 工具变量不和混杂因素相关；③ 工具变量只能通过暴露因素影响结局变量（炎症性肠病）。反向MR研究将炎症性肠病作为暴露变量，多发性硬化作为结局变量，但仍遵循以上三大假设。
1.2 数据来源
本研究的数据来自OpenGWAS公开可获取的疾病数据库。研究数据来源见表1。
表1
双样本MR研究中GWAS数据库的基本特征
1.3 SNP的选择
本研究根据MR研究的核心假设使用R软件包TwoSampleMR来确定所使用的SNP。首先，筛选出与暴露因素多发性硬化、溃疡性结肠炎和克罗恩病有显著相关的SNP（P=5×10−8），并调整参数r2=0.001，kb=10 000，去除r2>0.001的SNP，以排除连锁不平衡的影响。然后再将暴露变量和结局变量合并，对齐等位基因，排除具有中间等位基因频率的回文SNP。并利用MR-PRESSO检验[13]剔除离群SNP。最后计算F统计量确保不存在弱工具变量（F>10），F统计量计算公式为[14]。
1.4 MR分析
在协同了暴露与结局的GWAS效应等位基因后，使用逆方差加权（inverse variance weighted，IVW）[15]、加权中位数法（weighted median，WM）[16]、MR-Egger[17]方法进行MR分析。IVW方法因为较为准确，作为分析结果的主要方法，另外两种方法用以辅助分析，用以判断和IVW方法所得到的结论方向是否一致。为了确保分析结果的稳健性和有效性，我们还进行了敏感性分析。Cochran’s Q检验[18]来检查异质性，MR-Egger回归方法通过截距项评估潜在的多效性。此外，还使用了留一法进行敏感性分析，以判断单个SNP是否对每个MR研究的结果产生过大影响。
1.5 统计分析
采用R软件（版本4.1.2）进行统计分析。将P<0.05视为有统计学意义。结果以比值比（odds ratio，OR）及其相应的95%可信区间（confidence interval，CI）呈现。当OR>1且P<0.05时，表示正相关；当OR<1且P<0.05时，表示负相关。这些统计阈值用于评估变量之间关系的强度和显著性。
2 结果
2.1 多发性硬化与炎症性肠病的因果影响
2.1.1 多发性硬化与溃疡性结肠炎的因果效应
多发性硬化数据集中共筛选出49个与多发性硬化显著相关的独立SNP，当这些SNP与结局变量溃疡性结肠炎相关联时，有5个SNP丢失，但未发现回文SNP。MR-PRESSO分析时发现15个离群SNP（rs1131265、rs11554159、rs12210359、rs2857700、rs3748817、rs4410871、rs4780355、rs4796791、rs4976646、rs60600003、rs7923837、rs842639、rs926382、3rs9277535、rs9967792）。将上诉SNP剔除后再次进行IVW分析，结果显示，遗传预测的多发性硬化患者发生溃疡性结肠炎风险升高［IVW：OR=1.07，95%CI（1.012，1.134），P=0.018］。WM与MR-Egger方法与IVW方法得到的结果方向一致（表2）。Cochran’ Q检验结果显示P<0.05，表明存在异质性，但本研究采用随机效应模型进行分析，减少了异质性影响。MR-Egger截距并未显示水平多效性（intercept=0.003，P=0.81）。留一法分析表明，该结果并不受单个SNP影响（图1）。
表2
多发性硬化与溃疡性结肠炎发生风险的两样本孟德尔随机化分析
图1
多发性硬化对溃疡性结肠炎的留一法分析结果
2.1.2 多发性硬化与克罗恩病的因果效应
当49个SNP与结局变量克罗恩病相关联时，有4个SNP丢失。同时发现了6个回文SNP（rs1131265、rs12296430、rs1359062、rs212405、rs9736016、rs9989735），去除它们后，IVW分析［OR=1.043，95%CI（0.959，1.134），P=0.328］未发现多发性硬化对克罗恩病之间的因果关联。MR-PRESSO分析发现离群值，但是去除这些离群SNP后，还剩30个SNP进行分析，并不影响最终结果［OR=0.987，95%CI（0.922，1.057），P=0.715］（图2a）。Cochran Q检验（P<0.05）表明存在异质性。多效性检验MR-Egger回归的截距为−0.005（P=0.627），表明不存在潜在的水平多效性。留一分析表明，rs2857700与其他SNP扮演着矛盾的角色（图2b）。
图2
多发性硬化对克罗恩病的MR分析结果
a：MR分析结果；b：留一法分析结果。
2.2 反向MR分析
以炎症性肠病为暴露因素，多发性硬化为结局变量。溃疡性结肠炎数据库中筛选出87个与溃疡性结肠炎显著相关的独立SNP，经过筛选后，最终确定71个SNP作为工具变量，IVW结果显示，溃疡性结肠炎对多发性硬化存在影响［IVW：OR=1.109，95%CI（1.005，1.165），P<0.001］，但是MR-Egger分析与IVW分析结果方向不一致（图3a），因此认为溃疡性结肠炎和多发性硬化之间可能不存在因果效应。从克罗恩病数据库中确定了44个SNP作为工具变量，IVW表明克罗恩病和多发性硬化之间不存在因果效应［IVW：OR=1.027，95%CI（0.981，1.075），P=0.248］（图3b）。两个结果的敏感性分析均显示反向MR的结果可靠（图4a、图4b）。
图3
反向MR分析结果
a：溃疡性结肠炎；b：克罗恩病。
图4
反向MR敏感性分析结果
a：溃疡性结肠炎；b：克罗恩病。
3 讨论
本研究进行了双向和双样本MR研究，以检验多发性硬化与炎症性肠病风险之间的因果效应。研究结果支持多发性硬化是溃疡性结肠炎发病风险的危险因素，但不是克罗恩病的危险因素。且本研究没有证据表明克罗恩病与溃疡性结肠炎和多发性硬化的发病风险存在因果关系。
在既往的流行病学研究中，普遍认为多发性硬化与溃疡性结肠炎之间存在关联，但是具体的关系尚存在争议。Nabizadeh等[19]在2023年的一项Meta分析发现溃疡性结肠炎可使多发性硬化症的风险增加50%以上，但多发性硬化症不会增加溃疡性结肠炎发生的风险。但另一项有关多发性硬化与炎症性肠病的Meta分析则认为多发性硬化症患者患溃疡性结肠炎的风险增加，反之亦然[10]。2021年，Yang等[20]一项关于多发性硬化症和炎症性肠病之间的共同遗传结构的研究认为，多发性硬化和溃疡性结肠炎之间的遗传相关性明显大于多发性硬化和克罗恩病之间的遗传相关性，我们的研究结果与这一观点契合。
溃疡性结肠炎是一种慢性疾病，始于直肠，通常以连续方式向近端延伸，穿过部分或整个结肠，其炎症侵袭局限于黏膜表面[21]。其发病机制涉及肠道微生物群的生态失调，炎症应激导致肠道屏障功能破坏，免疫反应失衡等[22]。因此多发性硬化与溃疡性结肠炎的关联机制可能涉及以下几个方面。第一、可能与辅助性T细胞（Th）17细胞有关，既往多发性硬化与溃疡性结肠炎的免疫机制研究表明，Th17细胞及其分泌的细胞因子在多发性硬化与溃疡性结肠炎都发挥了作用。溃疡性结肠炎局部可产生较多的白细胞介素（IL）、IL-13和Th17细胞因子，细胞因子的作用导致肠道黏膜的炎症反应，引起溃疡性结肠炎的病理改变[23]。在多发性硬化症中，应激诱导的Th17细胞活化参与了神经元损伤和炎症过程。这些细胞因子可能导致血脑屏障的破坏，使得免疫细胞进入中枢神经系统，引发炎症反应并损伤神经组织[24]。多发性硬化与溃疡性结肠炎IL-17生成增加表明Th17细胞共同参与两种疾病的作用机制。第二，可能与脑与肠道的相互作用相关，微生物群在维持肠道屏障平衡方面起着重要作用，值得注意的是，常见的多发性硬化动物模型中也观察到了微生物群的改变[25]。肠道微环境有能力调节自身反应性T细胞的激活和分化，并将它们引导到中枢神经系统[26]。当肠道通透性发生变化时，通过黏膜的有害或免疫原性抗原进入的流量增加，从而导致调节或持续的神经免疫失调[27]。目前还需要进一步的基础研究来探索这种关系背后的潜在共享机制。
本研究有以下优势，首先，这是首次利用公共数据库和双样本孟德尔随机化方法来评估多发性硬化症和炎症性肠病之间的因果关系。与传统的观察性研究相比，这种方法减少了混杂因素、反向因果关系和暴露偏倚等因素对结果造成的影响。其次，我们还使用了多种MR方法来获得更准确的结果。最后，采用敏感性分析方法验证了研究结果的可靠性。当然，我们的研究也存在一些局限性。本研究中所使用数据库的研究人群主要是欧洲人群。因此，在将本研究的结论应用于其他种族群体时，有必要谨慎处理。此外，GWAS数据来自不同机构的数据，可能使用疾病诊断标准不同，而且缺乏按年龄、性别分组的亚组数据，无法比较亚组间的因果效应差异。
总的来说，本研究为多发性硬化症和炎症性肠病之间的因果关系提供了更新和更可靠的证据，本研究显示多发性硬化会增加溃疡性结肠炎的发生风险。因此临床医生应警惕多发性硬化患者的炎症性肠病发病风险，及时进行早期筛查与治疗。
声明 本文无任何利益冲突。
