引用本文： 陈致润, 陈林, 何振华, 刘莎, 文星雅, 肖玉蓉. ZFP36/ZFP36L1在慢性阻塞性肺疾病患者外周血中的表达及意义. 中国呼吸与危重监护杂志, 2024, 23(8): 537-545. doi: 10.7507/1671-6205.202403023 复制
慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是一种气流阻塞逐渐加重的疾病[1]，给健康和经济造成巨大损失[2]。慢阻肺急性加重通常是由感染、污染或气道损伤引起的呼吸道炎症加剧所致，进而导致痰液增多和气体滞留。炎症反应会促使趋化因子的释放，从而引起炎症细胞的聚集，并增加黏液分泌。这种相互作用会形成恶性循环，最终增加患者死亡的风险[3]。白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）/黏蛋白5B（mucin-5 subtype B，MUC5B）通路与这一恶性循环过程密切相关[4-5]。锌指蛋白36（zinc finger protein 36，ZFP36）家族蛋白是一类参与信使RNA（mRNA）代谢途径的RNA结合蛋白。该家族包括ZFP36（也称为tristetraprolin，TTP）、ZFP36L1、ZFP36L2和ZFP36L3[6]。它们通过结合mRNA 3'UTR中特定元件调节mRNA稳定性，参与基因表达调控[7]。在炎症疾病中，ZFP36家族蛋白调节T细胞反应和促炎细胞因子产生，缺失可能导致早期死亡[8]。ZFP36在多种疾病中发挥抗炎作用，但在慢阻肺方面还处于细胞和动物研究阶段，临床研究目前未见报道，ZFP36L1在炎症方面的生理靶点研究较少。这可能与ZFP36L1的表型具有早期致死性相关，ZFP36L1的种系缺失会导致绒毛膜尿囊融合缺陷、造血失败等严重先天性致死疾病发生[9-10]。ZFP36L1被认为与酒精性肝炎、银屑病、骨关节炎等疾病的慢性炎症相关[11-12]。因此本研究通过探究ZFP36家族中ZFP36、ZFP36L1在健康人群、慢阻肺稳定期、慢阻肺急性加重三组患者之间的表达差异，并与肺功能、炎症因子、呼吸困难评分等其他反映慢阻肺急性加重严重程度指标相结合，明确ZFP36/ZFP36L1在慢阻肺稳定期和急性加重期中的临床意义，以及在评估病情程度、近期预后中的临床价值。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取从2023年6月1日—2023年12月1日在南华大学附属第二医院呼吸与危重症医学科就诊的慢阻肺患者共63例，以及同期体检中心健康对照人群18例作为研究对象。纳入标准：① 年龄大于45岁；② 慢阻肺急性加重、慢阻肺的诊断均符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2021）》[13]。③ 入院前未接受抗菌药物、全身糖皮质激素治疗。排除标准：① 心、肝、肾和其他疾病严重的并发症，以及其他需要干预的活动性或慢性呼吸道疾病，如支气管扩张、活动性肺结核、肺栓塞、间质性肺病、哮喘等；② 合并有其他慢性炎症性疾病，包括慢性肝炎、银屑病、骨关节炎；③ 合并各系统恶性肿瘤，包括肺癌、胃癌、前列腺癌等；④ 无法独立进行肺功能测试或改良英国医学研究委员会呼吸困难问卷（modified Medical Research Council，mMRC）。脱落标准：各种原因造成慢阻肺急性加重患者无法完成所需病例资料，包括住院期间或者出院后3个月内死亡、各种原因失访（拒绝电话回访、预留联系方式有误等）视为脱落。本研究经南华大学衡阳医学院附属第二医院伦理委员会批准［伦审快（2024013）］，已进行临床试验注册（注册号ChiCTR1900026502）。
1.2 方法
1.2.1 资料收集
记录入组患者的年龄、性别、体重指数（body mass index，BMI）、吸烟情况、白细胞计数（white blood cell count，WBC）、中性粒细胞淋巴细胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、mMRC评分、住院事件等资料。肺功能由我院肺功能室专业技术人员采用耶格肺功能仪（MasterScreen）严格按照肺活量测定指南进行测量。每个患者测量3～5次，记录每次第1秒用力呼气容积占预计值百分比（forced expiratory volume in the first second as a percentage of predicted value，FEV1%pred）和第1秒用力呼气容积与用力肺活量比值（forced expiratory volume in the first second/forced vital capacity，FEV1/FVC），以确保存在3个合理的结果。对慢阻肺急性加重患者进行电话随访，追踪并记录出院后3个月内的加重次数，以及总住院次数。
1.2.2 ZFP36、ZFP36L1、IL-8表达检测
用含EDTA抗凝管采取所有患者空腹肘静脉血2 mL，以1 000 g离心15 min后，取上清（即血浆）−80℃保存待测。同时，用不含EDTA无酶抗凝管同意取血4 mL，室温静置2 h后，4℃ 1 000 g离心20 min，取上清（血清）−80℃保存待测。通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）检测血浆标本ZFP36、ZFP36L1、IL-8蛋白表达水平，试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司，并严格按照说明书操作。通过定量聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qPCR）检测血清标本ZFP36、ZFP36L1 mRNA表达水平，同徐锋等[14]PCR实验步骤，采用逆转录试剂盒（货号G3330），引物由上海茁彩生物科技有限公司提供（表1）。
表1
qPCR引物序列
1.3 统计学方法
运用SPSS26.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，行One Way ANOVA检验；不成正态分布的计量资料用中位数（四分位数）［M（P25，P75）］表示，行Kruskal-Wallis检验。以例数和构成比［例（%）］描述计数资料，行χ2检验，若不满足χ2条件，用Fisher确切概率法。Bonferroni法进行三组间的两两比较。斯皮尔曼（Spearman）秩、点二列（Pearson）确定ZFP36、ZFP36L1与各指标的相关性。诊断及预测价值采用受试者操作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC曲线）评估。曲线下面积（area under ROC curve，AUC）越大，诊断/预测价值越高。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 临床特征比较
本研究共收集了21份慢阻肺稳定期患者、42份慢阻肺急性加重患者以及18份体检中心的健康对照人群的血液标本；脱落0例。三组年龄、BMI、性别差异无统计学意义，吸烟情况三组差异具有统计学意义。进行两两比较，健康组与慢阻肺稳定组（χ2=5.37，P=0.04）、健康组与慢阻肺急性加重组（χ2=18.37，P=0.00）差异有统计学意义；而慢阻肺稳定组与慢阻肺急性加重组差异无统计学意义（χ2=3.66，P=0.08）。吸烟指数定义为每天吸烟支数×吸烟年数，三组差异有统计学意义。进行两两比较，健康组与慢阻肺稳定组（H=2.64，P=0.01）、健康组慢阻肺急性加重组（H=−4.28，P=0.00）差异有统计学意义；而慢阻肺稳定组与慢阻肺急性加重组（H=−1.34，P=0.18）差异无统计学意义。mMRC评分比较，慢阻肺稳定组与慢阻肺急性加重组差异有统计学意义。慢阻肺急性加重组和稳定期组的FEV1%pred、FEV1/FVC差异有统计学意义。三组WBC、NLR、CRP差异有统计学意义，两两比较后发现慢阻肺急性加重组WBC、NLR大于健康组和稳定组（P<0.05），健康人CRP小于慢阻肺稳定组和慢阻肺急性加重组，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。
表2
三组临床特征比较［例（%）/（x±s）/M（P25，P75）］
2.2 三组ZFP36、ZFP36L1、IL-8比较
慢阻肺急性加重组、慢阻肺稳定组患者和健康对照组三组间ZFP36、ZFP36L1和IL-8差异有统计学意义。进行两两比较，慢阻肺急性加重组血浆中ZFP36水平低于健康对照组（H=48.23，P=0.00）和慢阻肺稳定组（H=32.21，P=0.00），健康对照组血浆中ZFP36L1水平高于于慢阻肺稳定组（H=−38.36，P=0.00）和慢阻肺急性加重组（H=37.17，P=0.00）的。慢阻肺急性加重组的血浆IL-8水平高于健康对照组（H=−44.20，P=0.00）和慢阻肺稳定组（H=−15.19，P=0.04），而慢阻肺稳定组IL-8水平高于健康对照组（H=29.01，P=0.00）。结果见表3。
表3
三组ZFP36、ZFP36L1、IL-8比较［M（P25，P75），pg/mL］
2.3 ZFP36与ZFP36L1、IL-8等指标进行相关性分析
ZFP36水平与ZFP36L1、肺功能（FEV1%pred、FEV1/FVC）呈正相关，与IL-8、炎症指标、吸烟指数、mMRC评分、发生呼吸衰竭、3个月内再加重次数、总住院次数呈负相关，与住院时长、总住院费无相关性。结果见表4。
表4
ZFP36与各指标的相关性
2.4 ZFP36L1与炎症指标、肺功能等指标的相关性分析
ZFP36L1水平与IL-8水平、炎症指标（WBC、NLR、CRP）呈负相关，与吸烟指数、住院时长、总住院费、3个月内加重次数、总住院次数、发生呼吸衰竭、静脉使用激素、入住ICU、FEV1%pred、FEV1/FVC、mMRC评分无显著相关性。结果见表5。
表5
P36L1与炎症指标、肺功能等指标的相关性
2.5 ZFP36、ZFP36L1等指标在慢阻肺急性加重诊断中的价值
在临界值>402.61 pg/mL时，ZFP36诊断慢阻肺急性加重的AUC为0.980［95%置信区间（confidential interval，CI）0.950～1.000］，其敏感性和特异性分别为95.2%和90.5%，约登指数85.7%。在临界值>154.28 pg/mL时，IL-8诊断慢阻肺急性加重的AUC为0.740（95%CI 0.610～0.860），其敏感性和特异性分别为61.9%和81.0%，约登指数42.9%。在临界值>6.25×109/L时，WBC诊断慢阻肺急性加重的AUC为0.704（95%CI 0.570～0.837），其敏感性和特异性分别为81.0%和52.4%，约登指数33.4%。在临界值>34.3%时，FEV1%pred诊断慢阻肺急性加重的AUC为0.854（95%CI 0.762～0.947），其敏感性和特异性分别为73.8%和90.5%，约登指数64.3%。在临界值>3.231时，NLR诊断慢阻肺急性加重的AUC为0.810（95%CI 0.707～0.919），其敏感性和特异性分别为76.2%和76.2%，约登指数52.4%。ZFP36联合FEV1%pred诊断慢阻肺急性加重的AUC为0.985（95%CI：0.962～1.000）、敏感性92.9%，特异性100%，约登指数92.8%。结果见表6和图1。
表6
不同指标对慢阻肺急性加重的诊断效价
图1
不同指标对慢阻肺急性加重诊断的ROC曲线
2.6 ZFP36、ZFP36L1等指标与慢阻肺近期频繁加重的关系
以“出院后3个月内加重次数≥2次”为条件将慢阻肺急性加重患者分成≥2次的近期频繁加重组、<2次的非频繁加重组。在临界值>340.88 pg/mL时，ZFP36诊断慢阻肺急性加重频繁加重的AUC为0.730（95%CI：0.568-0.892），其敏感性和特异性分别为60.0%和81.5%，约登指数41.5%。在临界值>10.18×109/L时，WBC诊断慢阻肺急性加重频繁加重的AUC为0.706（95%CI： 0.545～0.868），其敏感性和特异性分别为53.3%和81.5%，约登指数34.8%。在临界值>3.37时，NLR诊断慢阻肺急性加重频繁加重的AUC为0.694（95%CI：0.535～0.853），其敏感性和特异性分别为100%和40.7%，约登指数40.7%。进一步绘制联合诊断的ROC曲线后发现，WBC联合NLR和ZFP36联合NLR的P值分别为0.04、0.01，AUC分别为0.696、0.748，95%CI分别为（0.531~0.862）、（0.586~0.910），敏感性分别为66.7%、66.7%，特异性分别为74.1%、88.9%，约登指数分别为64.3%、52.4%。然而，ZFP36L1、IL-8、CRP、FEV1%pred、FEV1/FVC对慢阻肺急性加重患者出院后近期频繁加重没有预测价值（均P>0.05）。结果见表7和图2。
表7
不同指标对慢阻肺近期频繁加重的预测效价
图2
不同指标对慢阻肺近期频繁加重预测的ROC曲线
2.7 ZFP36、ZFP36L1、IL-8诊断慢阻肺的价值
在临界值>502.93 pg/mL时，ZFP36诊断慢阻肺的AUC为0.889（95%CI： 0.791～0.987），其敏感性和特异性分别为61.9%和100%，约登指数为61.9%。在临界值>97.69 pg/mL时，ZFP36L1诊断慢阻肺的AUC为0.989（95%CI 0.968～1.000），其敏感性和特异性分别为90.5%和100%，约登指数为90.5%。在临界值>133.44 pg/mL时，IL-8诊断慢阻肺的AUC为0.981（95%CI：0.949～1.000），其敏感性和特异性分别为95.2%和94.4%，约登指数为89.6%。结果见表8和图3。
表8
ZFP36、ZFP36L1、IL-8诊断慢阻肺的价值
图3
不同指标对慢阻肺诊断的ROC曲线
2.8 三组血清ZFP36、ZPF36L1的mRNA表达水平
通过qPCR检测血清样本mRNA的表达，结果显示慢阻肺外周血ZFP36水平三组差异有统计学意义（P<0.05）。两两比较发现，慢阻肺急性加重组中ZFP36 mRNA表达水平比慢阻肺稳定组低（0.68±0.29比1.14±0.17，P=0.00）。而ZFP36L1在健康组中mRNA表达水平比慢阻肺稳定组高（15.22±8.22比5.06±5.68，P=0.00），慢阻肺稳定期组和急性加重期组之间差异无统计学意义（P=0.69）。结果见表9。
表9
不同组ZFP36、ZFP36L1的mRNA表达水平（x±s）
3 讨论
慢性气道炎症是导致慢阻肺患者气道黏液分泌增加、气道壁增厚、弹性减弱，最终导致气道狭窄和阻塞，影响气体交换和呼吸功能的主要原因[15]。此病理生理过程与IL-8/MUC5B通路密切相关。因此，深入研究IL-8在慢阻肺中的作用机制，发现更多IL-8可能的上游靶点，能为慢阻肺的治疗提供一定的思路。慢阻肺急性加重是导致慢阻肺患者疾病负担加重的直接原因。慢阻肺急性加重的诊断和预测生物标志物分别以中性粒细胞计数[16]和嗜酸性粒细胞计数[17]为主，但其诊断和预测准确度较低。因此，发现更为精准的生物标志物任重道远。
本研究发现，在慢阻肺急性加重组中平均IL-8水平最高，慢阻肺稳定组次之，健康组最低（分别为159.33、147.41和127.32 pg/mL）。而慢阻肺急性加重组血浆中ZFP36蛋白水平较低，并且与IL-8、炎症指标（NLR、WBC、CRP）呈负相关。此外，ZFP36与肺功能（FEV1%pred、FEV1/FVC）呈正相关，与吸烟指数呈负相关，与住院期间是否发生呼吸衰竭、出院后3个月内再加重次数、总住院次数呈负相关。IL-8在在转录后水平上[18]，调节肺上皮细胞中黏蛋白MUC5AC和MUC5B的表达，最后导致黏液黏稠度的增加，参与慢阻肺急性加重的发展过程[19-20]。感染后p38 MAP激酶及其上游激酶MKK3和下游激酶MK2、CNOT7/hCAF1、蛋白磷酸酶2A（PP2A）、GIGYF1/2的ZNF598上调促进ZFP36的表达[21-23]。ZFP36与IL-8 mRNA 3'非翻译区中富含AU的二分元素（ARE）相结合，破坏了细胞质蛋白的稳定性和相互作用，降低IL-8 mRNA的稳定性，从而加速IL-8的降解[24-25]。香烟烟雾暴露能降低小鼠ZFP36表达并损害ZFP36功能，在小鼠体内使用药物促进ZFP36的激活和稳定后，抑制了小鼠中性粒细胞炎症和气道重塑[26-27]。因此，我们推测ZFP36参与慢性气道炎症的分子信号机制可能为，ZFP36的3'非翻译区（UTR）富含AU元素（AREs）与IL-8 mRNA的ARE结构相互作用，导致IL-8 mRNA的稳定性降低，加速IL-8 mRNA的降解，在转录后水平上下调IL-8的表达水平，进而减少IL-8蛋白的表达水平。当IL-8与其受体结合时，形成异二聚体，激活受体上的JAK2，进而导致受体胞浆区域的酪氨酸残基磷酸化。这进一步引导STAT6蛋白聚集到受体区域，并通过SH2结构域与之结合。在此过程中，STAT6蛋白上的Y641位点酪氨酸残基被磷酸化，促使磷酸化的STAT6蛋白形成二聚体并迁移至细胞核，与特定的DNA元件结合，从而启动下游相关基因，包括MUC5B的转录和表达。最终导致气道黏液分泌减少，气道炎症减轻，肺功能改善，以及呼吸衰竭、频繁加重情况减少。
ZFP36L1 mRNA的水平在急性感染下约为Zfp36的13%，并超过ZFP36L2的3倍[28]。本研究中，在健康对照组血浆中ZFP36L1的水平高于稳定组（P=0.000），但在稳定组与慢阻肺急性加重组之间无显著差异。且ZFP36L1与IL-8水平和炎症指标的相关系数绝对值（IrI）没有ZFP36接近1，相关性较弱。与吸烟指数、住院事件、肺功能、mMRC评分均无显著相关性。在急性细菌性肺炎中，ZFP36可以完全弥补ZFP36L1的功能，ZFP36L1表达并不起不可或缺的作用[29]。因此，急性炎症背景下，ZFP36是促炎mRNA水平的主要调节因子，ZFP36L2起到协同调节作用，其本身变化并不明显。但二者mRNA在慢阻肺稳定组都有相当的水平表达，因此ZFP36L1可能在慢阻肺稳定期的慢性气道炎症中具有一定抗炎作用。
ZFP36、ZFP36L1在慢阻肺中的诊断价值暂未见文献报道。本研究发现ZFP36、ZFP36L1、IL-8均具有较高的慢阻肺诊断价值，其中ZFP36L1（AUC=0.989，95%CI 0.968～1.000）诊断价值最高，敏感性为90.5%，特异性为100%。而ZFP36L1对慢阻肺急性加重诊断及近期预后预测无显著意义（P>0.05）。
NLR、血小板淋巴细胞比值（platelet to lymphocyte ratio，PLR）、纤维蛋白原是目前诊断慢阻肺急性加重的主要生物标志物[30]。崔莉等[31]研究发现NLR的AUC（95%CI）为0.765（0.684～0.845），在三者中的诊断价值较高，其诊断敏感性为0.565，特异性为0.907。本研究发现ZFP36诊断慢阻肺急性加重的AUC明显高于NLR（0.98比0.81）。且敏感性、特异性也优于NLR（95.2%比76.2%、90.5%比76.2%），联合FEV1%pred诊断慢阻肺急性加重的特异性高达100%。因此抗炎因子ZFP36比炎症因子NLR、PLR更加准确地诊断慢阻肺急性加重，是更好的慢阻肺急性加重诊断指标。进一步绘制ZFP36、NLR预测慢阻肺急性加重患者出院90天内再次加重的ROC曲线，发现NLR预测慢阻肺急性加重患者出院90天内再次加重（AUC=0.694，95%CI 0.535～0.853，P=0.039），而CRP不能预测慢阻肺急性加重患者出院90天内再次加重（P=0.181）。与Feng等[32]的结果（AUC=0.580，95%CI 0.529～0.632，P=0.001）一致；但更重要的是，ZFP36预测90天内再次加重（AUC=0.73，95%CI 0.568～0.892）明显高于NLR，这可能与ZFP36在慢阻肺急性加重过程中表达增加，减少肺气肿样改变和气道重塑，改善肺功能相关[13]。因此，ZFP36相比于NLR，预测慢阻肺急性加重患者出院90天内再次加重的预测价值更高。
虽然ZFP36、ZFP36L1在慢阻肺诊断和慢阻肺急性加重的诊断、预后评估中具有较好的临床价值，但本研究仍存在许多局限性。首先，研究的样本量较小，还存在较大的偶然性，并且随访时间短，部分患者频繁加重期可能不在研究时间段内，所以总住院时长和总住院费与ZFP36无显著相关性。因此，需进一步增大样本量，进行多中心、长时间、大样本的实验进行验证。其次，样本来源相对单一，慢阻肺稳定期患者都来自门诊，慢阻肺急性加重患者都来自住院部，最终导致遗漏了一部分门诊轻度加重的患者和ICU病重患者的样本。希望在不久的将来能更加完善对ZFP36、ZFP36L1调控IL-8上下游通路的研究，为慢阻肺治疗提供更多的诊疗思路。
综上所述，外周血中ZFP36对慢阻肺急性加重具有良好的诊断价值。联合FEV1%pred可进一步增加诊断价值。作为慢阻肺患者出院3个月内频繁加重的预测指标，诊断敏感性、特异性优于NLR等炎症指标。ZFP36在慢阻肺急性加重中具有抗炎作用。外周血中ZFP36L1具有良好的慢阻肺诊断价值。未来还需要更多大型临床试验验证这些结论。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是一种气流阻塞逐渐加重的疾病[1]，给健康和经济造成巨大损失[2]。慢阻肺急性加重通常是由感染、污染或气道损伤引起的呼吸道炎症加剧所致，进而导致痰液增多和气体滞留。炎症反应会促使趋化因子的释放，从而引起炎症细胞的聚集，并增加黏液分泌。这种相互作用会形成恶性循环，最终增加患者死亡的风险[3]。白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）/黏蛋白5B（mucin-5 subtype B，MUC5B）通路与这一恶性循环过程密切相关[4-5]。锌指蛋白36（zinc finger protein 36，ZFP36）家族蛋白是一类参与信使RNA（mRNA）代谢途径的RNA结合蛋白。该家族包括ZFP36（也称为tristetraprolin，TTP）、ZFP36L1、ZFP36L2和ZFP36L3[6]。它们通过结合mRNA 3'UTR中特定元件调节mRNA稳定性，参与基因表达调控[7]。在炎症疾病中，ZFP36家族蛋白调节T细胞反应和促炎细胞因子产生，缺失可能导致早期死亡[8]。ZFP36在多种疾病中发挥抗炎作用，但在慢阻肺方面还处于细胞和动物研究阶段，临床研究目前未见报道，ZFP36L1在炎症方面的生理靶点研究较少。这可能与ZFP36L1的表型具有早期致死性相关，ZFP36L1的种系缺失会导致绒毛膜尿囊融合缺陷、造血失败等严重先天性致死疾病发生[9-10]。ZFP36L1被认为与酒精性肝炎、银屑病、骨关节炎等疾病的慢性炎症相关[11-12]。因此本研究通过探究ZFP36家族中ZFP36、ZFP36L1在健康人群、慢阻肺稳定期、慢阻肺急性加重三组患者之间的表达差异，并与肺功能、炎症因子、呼吸困难评分等其他反映慢阻肺急性加重严重程度指标相结合，明确ZFP36/ZFP36L1在慢阻肺稳定期和急性加重期中的临床意义，以及在评估病情程度、近期预后中的临床价值。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取从2023年6月1日—2023年12月1日在南华大学附属第二医院呼吸与危重症医学科就诊的慢阻肺患者共63例，以及同期体检中心健康对照人群18例作为研究对象。纳入标准：① 年龄大于45岁；② 慢阻肺急性加重、慢阻肺的诊断均符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2021）》[13]。③ 入院前未接受抗菌药物、全身糖皮质激素治疗。排除标准：① 心、肝、肾和其他疾病严重的并发症，以及其他需要干预的活动性或慢性呼吸道疾病，如支气管扩张、活动性肺结核、肺栓塞、间质性肺病、哮喘等；② 合并有其他慢性炎症性疾病，包括慢性肝炎、银屑病、骨关节炎；③ 合并各系统恶性肿瘤，包括肺癌、胃癌、前列腺癌等；④ 无法独立进行肺功能测试或改良英国医学研究委员会呼吸困难问卷（modified Medical Research Council，mMRC）。脱落标准：各种原因造成慢阻肺急性加重患者无法完成所需病例资料，包括住院期间或者出院后3个月内死亡、各种原因失访（拒绝电话回访、预留联系方式有误等）视为脱落。本研究经南华大学衡阳医学院附属第二医院伦理委员会批准［伦审快（2024013）］，已进行临床试验注册（注册号ChiCTR1900026502）。
1.2 方法
1.2.1 资料收集
记录入组患者的年龄、性别、体重指数（body mass index，BMI）、吸烟情况、白细胞计数（white blood cell count，WBC）、中性粒细胞淋巴细胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、mMRC评分、住院事件等资料。肺功能由我院肺功能室专业技术人员采用耶格肺功能仪（MasterScreen）严格按照肺活量测定指南进行测量。每个患者测量3～5次，记录每次第1秒用力呼气容积占预计值百分比（forced expiratory volume in the first second as a percentage of predicted value，FEV1%pred）和第1秒用力呼气容积与用力肺活量比值（forced expiratory volume in the first second/forced vital capacity，FEV1/FVC），以确保存在3个合理的结果。对慢阻肺急性加重患者进行电话随访，追踪并记录出院后3个月内的加重次数，以及总住院次数。
1.2.2 ZFP36、ZFP36L1、IL-8表达检测
用含EDTA抗凝管采取所有患者空腹肘静脉血2 mL，以1 000 g离心15 min后，取上清（即血浆）−80℃保存待测。同时，用不含EDTA无酶抗凝管同意取血4 mL，室温静置2 h后，4℃ 1 000 g离心20 min，取上清（血清）−80℃保存待测。通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）检测血浆标本ZFP36、ZFP36L1、IL-8蛋白表达水平，试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司，并严格按照说明书操作。通过定量聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qPCR）检测血清标本ZFP36、ZFP36L1 mRNA表达水平，同徐锋等[14]PCR实验步骤，采用逆转录试剂盒（货号G3330），引物由上海茁彩生物科技有限公司提供（表1）。
表1
qPCR引物序列
1.3 统计学方法
运用SPSS26.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，行One Way ANOVA检验；不成正态分布的计量资料用中位数（四分位数）［M（P25，P75）］表示，行Kruskal-Wallis检验。以例数和构成比［例（%）］描述计数资料，行χ2检验，若不满足χ2条件，用Fisher确切概率法。Bonferroni法进行三组间的两两比较。斯皮尔曼（Spearman）秩、点二列（Pearson）确定ZFP36、ZFP36L1与各指标的相关性。诊断及预测价值采用受试者操作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC曲线）评估。曲线下面积（area under ROC curve，AUC）越大，诊断/预测价值越高。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 临床特征比较
本研究共收集了21份慢阻肺稳定期患者、42份慢阻肺急性加重患者以及18份体检中心的健康对照人群的血液标本；脱落0例。三组年龄、BMI、性别差异无统计学意义，吸烟情况三组差异具有统计学意义。进行两两比较，健康组与慢阻肺稳定组（χ2=5.37，P=0.04）、健康组与慢阻肺急性加重组（χ2=18.37，P=0.00）差异有统计学意义；而慢阻肺稳定组与慢阻肺急性加重组差异无统计学意义（χ2=3.66，P=0.08）。吸烟指数定义为每天吸烟支数×吸烟年数，三组差异有统计学意义。进行两两比较，健康组与慢阻肺稳定组（H=2.64，P=0.01）、健康组慢阻肺急性加重组（H=−4.28，P=0.00）差异有统计学意义；而慢阻肺稳定组与慢阻肺急性加重组（H=−1.34，P=0.18）差异无统计学意义。mMRC评分比较，慢阻肺稳定组与慢阻肺急性加重组差异有统计学意义。慢阻肺急性加重组和稳定期组的FEV1%pred、FEV1/FVC差异有统计学意义。三组WBC、NLR、CRP差异有统计学意义，两两比较后发现慢阻肺急性加重组WBC、NLR大于健康组和稳定组（P<0.05），健康人CRP小于慢阻肺稳定组和慢阻肺急性加重组，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。
表2
三组临床特征比较［例（%）/（x±s）/M（P25，P75）］
2.2 三组ZFP36、ZFP36L1、IL-8比较
慢阻肺急性加重组、慢阻肺稳定组患者和健康对照组三组间ZFP36、ZFP36L1和IL-8差异有统计学意义。进行两两比较，慢阻肺急性加重组血浆中ZFP36水平低于健康对照组（H=48.23，P=0.00）和慢阻肺稳定组（H=32.21，P=0.00），健康对照组血浆中ZFP36L1水平高于于慢阻肺稳定组（H=−38.36，P=0.00）和慢阻肺急性加重组（H=37.17，P=0.00）的。慢阻肺急性加重组的血浆IL-8水平高于健康对照组（H=−44.20，P=0.00）和慢阻肺稳定组（H=−15.19，P=0.04），而慢阻肺稳定组IL-8水平高于健康对照组（H=29.01，P=0.00）。结果见表3。
表3
三组ZFP36、ZFP36L1、IL-8比较［M（P25，P75），pg/mL］
2.3 ZFP36与ZFP36L1、IL-8等指标进行相关性分析
ZFP36水平与ZFP36L1、肺功能（FEV1%pred、FEV1/FVC）呈正相关，与IL-8、炎症指标、吸烟指数、mMRC评分、发生呼吸衰竭、3个月内再加重次数、总住院次数呈负相关，与住院时长、总住院费无相关性。结果见表4。
表4
ZFP36与各指标的相关性
2.4 ZFP36L1与炎症指标、肺功能等指标的相关性分析
ZFP36L1水平与IL-8水平、炎症指标（WBC、NLR、CRP）呈负相关，与吸烟指数、住院时长、总住院费、3个月内加重次数、总住院次数、发生呼吸衰竭、静脉使用激素、入住ICU、FEV1%pred、FEV1/FVC、mMRC评分无显著相关性。结果见表5。
表5
P36L1与炎症指标、肺功能等指标的相关性
2.5 ZFP36、ZFP36L1等指标在慢阻肺急性加重诊断中的价值
在临界值>402.61 pg/mL时，ZFP36诊断慢阻肺急性加重的AUC为0.980［95%置信区间（confidential interval，CI）0.950～1.000］，其敏感性和特异性分别为95.2%和90.5%，约登指数85.7%。在临界值>154.28 pg/mL时，IL-8诊断慢阻肺急性加重的AUC为0.740（95%CI 0.610～0.860），其敏感性和特异性分别为61.9%和81.0%，约登指数42.9%。在临界值>6.25×109/L时，WBC诊断慢阻肺急性加重的AUC为0.704（95%CI 0.570～0.837），其敏感性和特异性分别为81.0%和52.4%，约登指数33.4%。在临界值>34.3%时，FEV1%pred诊断慢阻肺急性加重的AUC为0.854（95%CI 0.762～0.947），其敏感性和特异性分别为73.8%和90.5%，约登指数64.3%。在临界值>3.231时，NLR诊断慢阻肺急性加重的AUC为0.810（95%CI 0.707～0.919），其敏感性和特异性分别为76.2%和76.2%，约登指数52.4%。ZFP36联合FEV1%pred诊断慢阻肺急性加重的AUC为0.985（95%CI：0.962～1.000）、敏感性92.9%，特异性100%，约登指数92.8%。结果见表6和图1。
表6
不同指标对慢阻肺急性加重的诊断效价
图1
不同指标对慢阻肺急性加重诊断的ROC曲线
2.6 ZFP36、ZFP36L1等指标与慢阻肺近期频繁加重的关系
以“出院后3个月内加重次数≥2次”为条件将慢阻肺急性加重患者分成≥2次的近期频繁加重组、<2次的非频繁加重组。在临界值>340.88 pg/mL时，ZFP36诊断慢阻肺急性加重频繁加重的AUC为0.730（95%CI：0.568-0.892），其敏感性和特异性分别为60.0%和81.5%，约登指数41.5%。在临界值>10.18×109/L时，WBC诊断慢阻肺急性加重频繁加重的AUC为0.706（95%CI： 0.545～0.868），其敏感性和特异性分别为53.3%和81.5%，约登指数34.8%。在临界值>3.37时，NLR诊断慢阻肺急性加重频繁加重的AUC为0.694（95%CI：0.535～0.853），其敏感性和特异性分别为100%和40.7%，约登指数40.7%。进一步绘制联合诊断的ROC曲线后发现，WBC联合NLR和ZFP36联合NLR的P值分别为0.04、0.01，AUC分别为0.696、0.748，95%CI分别为（0.531~0.862）、（0.586~0.910），敏感性分别为66.7%、66.7%，特异性分别为74.1%、88.9%，约登指数分别为64.3%、52.4%。然而，ZFP36L1、IL-8、CRP、FEV1%pred、FEV1/FVC对慢阻肺急性加重患者出院后近期频繁加重没有预测价值（均P>0.05）。结果见表7和图2。
表7
不同指标对慢阻肺近期频繁加重的预测效价
图2
不同指标对慢阻肺近期频繁加重预测的ROC曲线
2.7 ZFP36、ZFP36L1、IL-8诊断慢阻肺的价值
在临界值>502.93 pg/mL时，ZFP36诊断慢阻肺的AUC为0.889（95%CI： 0.791～0.987），其敏感性和特异性分别为61.9%和100%，约登指数为61.9%。在临界值>97.69 pg/mL时，ZFP36L1诊断慢阻肺的AUC为0.989（95%CI 0.968～1.000），其敏感性和特异性分别为90.5%和100%，约登指数为90.5%。在临界值>133.44 pg/mL时，IL-8诊断慢阻肺的AUC为0.981（95%CI：0.949～1.000），其敏感性和特异性分别为95.2%和94.4%，约登指数为89.6%。结果见表8和图3。
表8
ZFP36、ZFP36L1、IL-8诊断慢阻肺的价值
图3
不同指标对慢阻肺诊断的ROC曲线
2.8 三组血清ZFP36、ZPF36L1的mRNA表达水平
通过qPCR检测血清样本mRNA的表达，结果显示慢阻肺外周血ZFP36水平三组差异有统计学意义（P<0.05）。两两比较发现，慢阻肺急性加重组中ZFP36 mRNA表达水平比慢阻肺稳定组低（0.68±0.29比1.14±0.17，P=0.00）。而ZFP36L1在健康组中mRNA表达水平比慢阻肺稳定组高（15.22±8.22比5.06±5.68，P=0.00），慢阻肺稳定期组和急性加重期组之间差异无统计学意义（P=0.69）。结果见表9。
表9
不同组ZFP36、ZFP36L1的mRNA表达水平（x±s）
3 讨论
慢性气道炎症是导致慢阻肺患者气道黏液分泌增加、气道壁增厚、弹性减弱，最终导致气道狭窄和阻塞，影响气体交换和呼吸功能的主要原因[15]。此病理生理过程与IL-8/MUC5B通路密切相关。因此，深入研究IL-8在慢阻肺中的作用机制，发现更多IL-8可能的上游靶点，能为慢阻肺的治疗提供一定的思路。慢阻肺急性加重是导致慢阻肺患者疾病负担加重的直接原因。慢阻肺急性加重的诊断和预测生物标志物分别以中性粒细胞计数[16]和嗜酸性粒细胞计数[17]为主，但其诊断和预测准确度较低。因此，发现更为精准的生物标志物任重道远。
本研究发现，在慢阻肺急性加重组中平均IL-8水平最高，慢阻肺稳定组次之，健康组最低（分别为159.33、147.41和127.32 pg/mL）。而慢阻肺急性加重组血浆中ZFP36蛋白水平较低，并且与IL-8、炎症指标（NLR、WBC、CRP）呈负相关。此外，ZFP36与肺功能（FEV1%pred、FEV1/FVC）呈正相关，与吸烟指数呈负相关，与住院期间是否发生呼吸衰竭、出院后3个月内再加重次数、总住院次数呈负相关。IL-8在在转录后水平上[18]，调节肺上皮细胞中黏蛋白MUC5AC和MUC5B的表达，最后导致黏液黏稠度的增加，参与慢阻肺急性加重的发展过程[19-20]。感染后p38 MAP激酶及其上游激酶MKK3和下游激酶MK2、CNOT7/hCAF1、蛋白磷酸酶2A（PP2A）、GIGYF1/2的ZNF598上调促进ZFP36的表达[21-23]。ZFP36与IL-8 mRNA 3'非翻译区中富含AU的二分元素（ARE）相结合，破坏了细胞质蛋白的稳定性和相互作用，降低IL-8 mRNA的稳定性，从而加速IL-8的降解[24-25]。香烟烟雾暴露能降低小鼠ZFP36表达并损害ZFP36功能，在小鼠体内使用药物促进ZFP36的激活和稳定后，抑制了小鼠中性粒细胞炎症和气道重塑[26-27]。因此，我们推测ZFP36参与慢性气道炎症的分子信号机制可能为，ZFP36的3'非翻译区（UTR）富含AU元素（AREs）与IL-8 mRNA的ARE结构相互作用，导致IL-8 mRNA的稳定性降低，加速IL-8 mRNA的降解，在转录后水平上下调IL-8的表达水平，进而减少IL-8蛋白的表达水平。当IL-8与其受体结合时，形成异二聚体，激活受体上的JAK2，进而导致受体胞浆区域的酪氨酸残基磷酸化。这进一步引导STAT6蛋白聚集到受体区域，并通过SH2结构域与之结合。在此过程中，STAT6蛋白上的Y641位点酪氨酸残基被磷酸化，促使磷酸化的STAT6蛋白形成二聚体并迁移至细胞核，与特定的DNA元件结合，从而启动下游相关基因，包括MUC5B的转录和表达。最终导致气道黏液分泌减少，气道炎症减轻，肺功能改善，以及呼吸衰竭、频繁加重情况减少。
ZFP36L1 mRNA的水平在急性感染下约为Zfp36的13%，并超过ZFP36L2的3倍[28]。本研究中，在健康对照组血浆中ZFP36L1的水平高于稳定组（P=0.000），但在稳定组与慢阻肺急性加重组之间无显著差异。且ZFP36L1与IL-8水平和炎症指标的相关系数绝对值（IrI）没有ZFP36接近1，相关性较弱。与吸烟指数、住院事件、肺功能、mMRC评分均无显著相关性。在急性细菌性肺炎中，ZFP36可以完全弥补ZFP36L1的功能，ZFP36L1表达并不起不可或缺的作用[29]。因此，急性炎症背景下，ZFP36是促炎mRNA水平的主要调节因子，ZFP36L2起到协同调节作用，其本身变化并不明显。但二者mRNA在慢阻肺稳定组都有相当的水平表达，因此ZFP36L1可能在慢阻肺稳定期的慢性气道炎症中具有一定抗炎作用。
ZFP36、ZFP36L1在慢阻肺中的诊断价值暂未见文献报道。本研究发现ZFP36、ZFP36L1、IL-8均具有较高的慢阻肺诊断价值，其中ZFP36L1（AUC=0.989，95%CI 0.968～1.000）诊断价值最高，敏感性为90.5%，特异性为100%。而ZFP36L1对慢阻肺急性加重诊断及近期预后预测无显著意义（P>0.05）。
NLR、血小板淋巴细胞比值（platelet to lymphocyte ratio，PLR）、纤维蛋白原是目前诊断慢阻肺急性加重的主要生物标志物[30]。崔莉等[31]研究发现NLR的AUC（95%CI）为0.765（0.684～0.845），在三者中的诊断价值较高，其诊断敏感性为0.565，特异性为0.907。本研究发现ZFP36诊断慢阻肺急性加重的AUC明显高于NLR（0.98比0.81）。且敏感性、特异性也优于NLR（95.2%比76.2%、90.5%比76.2%），联合FEV1%pred诊断慢阻肺急性加重的特异性高达100%。因此抗炎因子ZFP36比炎症因子NLR、PLR更加准确地诊断慢阻肺急性加重，是更好的慢阻肺急性加重诊断指标。进一步绘制ZFP36、NLR预测慢阻肺急性加重患者出院90天内再次加重的ROC曲线，发现NLR预测慢阻肺急性加重患者出院90天内再次加重（AUC=0.694，95%CI 0.535～0.853，P=0.039），而CRP不能预测慢阻肺急性加重患者出院90天内再次加重（P=0.181）。与Feng等[32]的结果（AUC=0.580，95%CI 0.529～0.632，P=0.001）一致；但更重要的是，ZFP36预测90天内再次加重（AUC=0.73，95%CI 0.568～0.892）明显高于NLR，这可能与ZFP36在慢阻肺急性加重过程中表达增加，减少肺气肿样改变和气道重塑，改善肺功能相关[13]。因此，ZFP36相比于NLR，预测慢阻肺急性加重患者出院90天内再次加重的预测价值更高。
虽然ZFP36、ZFP36L1在慢阻肺诊断和慢阻肺急性加重的诊断、预后评估中具有较好的临床价值，但本研究仍存在许多局限性。首先，研究的样本量较小，还存在较大的偶然性，并且随访时间短，部分患者频繁加重期可能不在研究时间段内，所以总住院时长和总住院费与ZFP36无显著相关性。因此，需进一步增大样本量，进行多中心、长时间、大样本的实验进行验证。其次，样本来源相对单一，慢阻肺稳定期患者都来自门诊，慢阻肺急性加重患者都来自住院部，最终导致遗漏了一部分门诊轻度加重的患者和ICU病重患者的样本。希望在不久的将来能更加完善对ZFP36、ZFP36L1调控IL-8上下游通路的研究，为慢阻肺治疗提供更多的诊疗思路。
综上所述，外周血中ZFP36对慢阻肺急性加重具有良好的诊断价值。联合FEV1%pred可进一步增加诊断价值。作为慢阻肺患者出院3个月内频繁加重的预测指标，诊断敏感性、特异性优于NLR等炎症指标。ZFP36在慢阻肺急性加重中具有抗炎作用。外周血中ZFP36L1具有良好的慢阻肺诊断价值。未来还需要更多大型临床试验验证这些结论。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
