引用本文： 童霞, 张华, 彭玲, 张鑫, 张兰兰. 单细胞荟萃分析 SARS-CoV-2 感染后 T 淋巴细胞在各个器官中的功能差异. 中国呼吸与危重监护杂志, 2022, 21(5): 330-339. doi: 10.7507/1671-6205.202201042 复制
新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19，简称新冠肺炎）患者血液中的 T 淋巴细胞的数量低于健康对照组，与无症状者相比，有症状的新冠肺炎患者淋巴细胞减少更为突出，与无肺炎表现的患者相比，有症状患者的淋巴细胞减少也更为突出[1-7]。与中度患者相比，重症新冠肺炎患者 CD4+ T 和 CD8+ T 淋巴细胞数均进一步下降[8-13]。值得注意的是，较低的淋巴细胞计数被发现是严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染导致的死亡的临床预测因素[9, 14]。在新冠肺炎老年患者中，血液中高数量的淋巴细胞预示更好的预后[15-17]。输注携带高水平中和性抗体滴度的恢复期血浆后，新冠肺炎患者临床症状明显改善，前瞻性入组的严重新冠肺炎患者的淋巴细胞数量显著增加[18]。研究表明，血管紧张素转换酶 2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是介导 SARS-CoV-1 和 SARS-CoV-2 入胞的高亲和力受体，而免疫细胞中始终没有 ACE2 的表达[19-21]，这表明直接的病毒感染可能不是导致 T 淋巴细胞减少的原因，这值得进一步研究。此外，虽然这两种冠状病毒都有零星的病毒进入淋巴细胞的现象，但病毒似乎不能在这种细胞类型中复制，因此这种中止性感染的生物学意义并不确定[2, 22]。
对于新冠肺炎患者，是否每个器官中的 T 淋巴细胞具有相对特异的功能，目前仍然未知。在此，我们应用生物信息学方法，利用公共数据库高通量基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）及单细胞技术的分析方法，分析了 SARS-CoV-2 感染患者各器官的 T 淋巴细胞在体内的功能差异。现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 数据收集
单细胞转录组测序（single cell RNA sequencing，scRNA）/单细胞核转录组测序（single nucleus RNA sequencing，snRNA）测序数据来自 GEO（
1.2 单细胞测序数据分析流程
1.2.1 scRNA/snRNA 数据处理
使用函数 Read10X 将 CellRanger（10X Genomics）输出文件读入 Seurat。使用 Seurat 包（v4.0）分析 scRNA/snRNA 测序数据[27]，具体分析流程见网页（
1.2.2 细胞簇注释及数据可视化
使用已知细胞标记基因进行细胞类型注释[31]，分为四个主要细胞群：EPCAM+（上皮细胞）、CLDN5+（内皮细胞）、PTPRC+（免疫细胞）和COL1A2+（间质细胞）。使用 Subset()提取出免疫细胞，然后使用文献经典的 T 淋巴细胞标记基因（CD3E）标记 T 淋巴细胞，提取出 T 淋巴细胞。然后将来自 7 个器官的 T 淋巴细胞的细胞群体合并在一起，生成 1 个合并后的 Seurat 对象。使用 Seurat 函数 FindNeighbors 和 FindClusters 进行细胞聚类，UMAP 降维后生成最终的 Seurat 对象。UMAP 图、小提琴图、条形图、热图及点状图由 Seurat 中的 R 包 ggplot2、pheatmap 构建。所有热图均基于聚类平均基因表达以考虑细胞间转录组随机性，并且数据自动缩放以进行可视化。
1.2.3 寻找差异表达基因及 SARS-CoV-2 入侵基因选择
使用FindMarkers函数寻找肺与其他不同器官T淋巴细胞类群的标记基因。FindAllMarkers 函数会自动寻找每个类群和其他每个类群之间的标记基因。根据文献报道选择 SARS-CoV-2 入侵基因[32]，检索式为"ACE2", "BSG", "NRP1", "HSPA5", "AXL", "KREMEN1", "ASGL1", "HSPG2", "SLC35A1", "CLEC4D", "CD4", "SR-B1", "FURIN", "PCSK1", "PRSS1", "ST14", "CTSB", "CTSL", "TMPRSS2"，一方面提取上述入侵基因阳性的 T 淋巴细胞，比较不同器官 T 淋巴细胞中入侵基因阳性的细胞比例，一方面直接比较上述入侵基因在不同器官T淋巴细胞中 RNA 表达量。由于呼吸系统是 SARS-CoV-2 入侵的主要器官，肺的 T 淋巴细胞是感染病毒的首要 T 淋巴细胞[33]，设定肺的 T 淋巴细胞为参照物，比较常见干扰素基因 FOS、BST2、IFI27[34]的表达。
1.2.4 富集分析
使用基因本体论（gene ontology，GO）对差异表达基因进行富集分析（
1.3 统计学方法
所有计算或分析均使用 Prism 8 软件包（GraphPad）或 R 语言进行。采用双侧 t 检验比较组间差异，所有数据均表示为平均值±标准误差。P<0.05 为差异有统计学意义。使用 Wilcoxon 秩和统计检验对每个集群的差异表达基因进行分析。
2 结果
2.1 新冠肺炎患者多器官 T 淋巴细胞地图构建
从所选的 GEO 数据库中，获取了新冠肺炎患者 16 个肝脏、19 个心脏、2 个脾脏、6 个大脑、58 个肺、21 个肾脏、5 个胰腺组织的 scRNA/snRNA 数据，同时利用 PTPRC、CD3E 标记基因并提取出 T 淋巴细胞，构建 T 淋巴细胞地图，生成聚类分析 UMAP 图，分为 13 个群（图1a）。分析各器官的 T 淋巴细胞的高表达基因，总共发现 2517 个高变基因，包括胰腺 674 个、脾脏 15 个、肺 362 个、肾脏 468 个、心脏 288 个、脑 193 个、肝脏 517 个，其中最高的是胰腺（图1b）。分析各器官的前 50 位高表达基因，可以看出胰腺和肺的共有基因较多（图1c）。各器官中排列前 10 的高变基因分别为：脑，GFAP、LINGO1、MT−ND1、MT−ND2、SLC26A3、RASGEF1B、LINC00486、DHFR、MTRNR2L8、AC105402.3；肺，RPL41、CCL4、CCL4L2、RPS12、RPL34、RPLP1、RPS15A、RPL10、RPL39、RPS27；脾脏，INO80D、LINGO1、SLC26A3、RASGEF1B、DHFR、MTRNR2L8、IGHA1、FP671120.1、FP236383.1、MIB1；肝脏，PIP4K2A、CNOT6L、AC016831.7、KCNQ5、TOX、AUTS2、PLCB1、NCAM1、HDAC9、ADAMTS17；肾脏，MKL1、HSPH1、PLCG2、FP236383.1、FP671120.1、ABHD3、AC016831.7、KIAA1551、LINC00486、FNDC3B；胰腺，PRSS2、SST、REG1A、INS、CELA3A、CLPS、PRSS1、REG1B、GCG、TTR；心脏：MED13、TNRC6B、CMIP、RAPGEF1、TBC1D22A、BIRC6、AKAP13、MBD5、INPP5D、PPP6R3（图1d）。
图1
新冠肺炎患者不同器官的 T 淋巴细胞地图、聚类分析及差异表达基因分析图
a. 示意图显示了整个研究的分析工作流程。b. 新冠肺炎不同器官的 T 淋巴细胞差异表达基因个数。c. 每个器官 T 淋巴细胞的前 50 个标记基因表达的热图。红色高表达；蓝色低表达。d. 小提琴图显示了各器官中 T 淋巴细胞前 10 名高表达的基因以及这些基因在其余器官中的表达。
2.2 新冠肺炎患者不同器官 T 淋巴细胞异质性
在各个器官的 T 淋巴细胞中入侵基因 AXL、ASGL1、SR-B1、PRSS1、CTSB、TMPRSS2 阳性细胞比例为 0，入侵基因 ASGL1、SR-B1 RNA 未检测到。不同器官的 T 淋巴细胞中其他入侵基因表达存在明显的异质性，作为主要的入侵基因，ACE2 表达较低，表达最高者为肾脏（图2a），肺和胰腺的表达量高于其他器官（图2b）。对各个器官的 T 淋巴细胞功能 GO 富集分析显示，不同器官 T 淋巴细胞亚群富集到的信号通路不同：肺主要涉及蛋白合成（图2c），肾脏主要涉及表观遗传（图2d），脑的 T 淋巴细胞主要富集细胞周期（图2e），肝脏主要涉及到免疫反应（图2f），胰腺与肺相似，主要跟蛋白合成相关（图2g），心脏主要富集免疫应答（图2h），脾脏的T淋巴细胞主要跟凋亡相关（图2i）。
图2
各个器官的 T 淋巴细胞中入侵基因以及高表达基因的富集分析
a. 不同器官 T 淋巴细胞 SARS-CoV-2 入侵基因阳性的细胞数比例。b. 点状图显示入侵基因在各器官 T 淋巴细胞群的表达情况，肺和胰腺的表达量高于其他器官。c～i. GO 富集分析对每个器官差异基因进行富集分析，显示不同器官 T 淋巴细胞亚群富集到的信号通路不同。红框内显示各脏器明显富集的信号通路。其中肺明显富集到了蛋白合成相关的信号通路（cytoplasmic translation，ribonucleoprotein complex biogenesis），肾脏明显富集到了表观遗传相关的信号通路（histone modification），脑主要富集细胞周期（regulation of cell cycle G1/S phase transition，cell cycle G1/S phase transition），肝脏主要涉及到免疫反应（histone modification），胰腺主要跟蛋白合成相关（cytoplasmic translation，ribonucleoprotein complex biogenesis，ribosome assembly），心脏主要富集免疫应答（immune response-regulating signaling pathway，immune response-regulating cell surface receptor signaling pathway），而脾脏主要跟凋亡相关（negative regulation of execution phase of apoptosis）
2.3 新冠肺炎患者不同器官 T 淋巴细胞相关性
对各个器官 T 淋巴细胞相关性的分析显示，心肝肾的相关性大（图3a），利用维恩图验证各个器官的富集信号通路的相关性，筛选出了细胞间交互的基因（图3b）。通过 GO 富集分析，心脏与肝脏交互的基因主要集中在免疫应答，肝脏与肾脏交互的基因主要集中在表观遗传；肝脏与脑交互的基因主要激活 wnt 信号通路；心脏、脑、肝脏与肾脏交互的基因主要集中在肽的修饰；心脏、肝脏与肾脏交互的基因主要集中在细胞周期；脑、肾脏与肝脏交互的基因主要集中在能量代谢；肺与胰腺交互的基因主要集中在蛋白质合成；脑与肾脏交互的基因主要集中在 cAMP 合成（图3c）。
图3
新冠肺炎患者不同器官 T 淋巴细胞相关性
a. 热图显示每个器官 T 淋巴细胞亚群中基因表达的相关性分析，提示心肝肾的相关性大（色阶：红色，相关性最高； 蓝色，相关性最低）。b. 维恩图显示在不同器官 T 淋巴细胞上调的基因。图表下方的黑色连接点表示相交的组织簇，纵轴代表交互的基因数目，横轴每个器官的基因数目。c. GO 富集分析对不同器官共同表达的差异基因进行富集分析（色阶：红色，
2.4 肺是感染新冠肺炎后应答干扰素的独特器官
与肺比较，其余器官的 T 淋巴细胞的干扰素信号通路降低，说明肺是一个在感染新冠肺炎后应答干扰素的独特器官（图4a～f）。常见干扰素基因中 FOS 在肺组织明显高表达，BST2在胰腺组织明显高表达（图4g）。
图4
与干扰素相关的基因在肺与其他器官中 T 淋巴细胞的表达差异
a～f. 分析新冠肺炎患者其他器官组织与肺组织 T 淋巴细胞亚群中的差异基因，火山图显示心脏、肝脏、脑、脾脏、胰腺、肾脏组织与肺组织相比上调及下调基因（红色是上调显著的基因，绿色是下调显著的基因）。GSEA 对差异基因进行富集分析，显示相对于其他器官组织，肺组织 T 淋巴细胞群明显富集到干扰素相关信号通路（NES：富集通路得分的统计量，为正，表示通路基因集富集在排序序列前方；为负，表示某一功能基因集富集在排序序列后方。Norminal
2.5 代谢基因在不同器官间 T 淋巴细胞异质性
再次设定肺的 T 淋巴细胞为对照，脑的脂肪酸合成信号通路下降（图5a）；肝脏的脂肪酸合成和氨基酸的转运下调（图5b）；心脏的脂肪酸合成增加与脂肪酸的结合下调（图5c）；肾脏的脂肪酸转运降低与糖的转运增强（图5d）；胰腺的氨基酸合成增加与脂肪酶下降（图5e）；脾脏的碳水化合物以及脂肪下调（图5f）。
图5
代谢基因在肺与其他器官中 T 淋巴细胞的表达差异
a. 肺组织与脑组织 T 淋巴细胞差异基因富集到脂肪酸代谢；b. 肺组织与肝组织 T 淋巴细胞差异基因富集到脂肪酸、氨基酸代谢；c. 心脏组织与肺组织 T 淋巴细胞差异基因中，心脏组织明显富集到脂质代谢过程，肺组织富集到了脂肪酸代谢过程；d. 肾脏组织与肺组织 T 淋巴细胞差异基因中，肾脏组织明显富集到了脂肪酸代谢，肺组织富集到了糖代谢；e. 胰腺组织与肺组织 T 淋巴细胞差异基因中，胰腺组织明显富集到了氨基酸及糖代谢过程，肺组织富集到了脂代谢；f. 脾脏组织与肺组织 T 淋巴细胞差异基因中，肺组织富集到了碳水化合物及脂质代谢。
3 讨论
本研究应用生物信息学方法，利用单细胞荟萃方法，通过挖掘公开发表在 GEO 数据库的基因数据集，提取常见的各个器官的T淋巴细胞，在单细胞层面揭示了各个器官 T 淋巴细胞的功能异质性。同时发现干扰素信号通路在肺的 T 淋巴细胞高表达，且对脂肪酸的结合起主要调控作用。
既往研究发现 SARS-CoV-2 感染患者普遍存在体液免疫反应，并且抗 SARS-CoV-2 IgG 滴度的多少与循环病毒特异性 CD4+ 和CD8+ T 淋巴细胞的广度密切相关[12, 36-37]。一项研究报告了一组具有干细胞样记忆表型的多功能 SARS-CoV-2 特异性 T 淋巴细胞群，具有这些 T 淋巴细胞群的个体为无症状和轻度新冠肺炎者[38]；这表明在没有抗体的情况下，强大而广泛的 T 淋巴细胞反应可能足以提供针对 SARS-CoV-2 的免疫保护[10, 12, 39-43]。因此，在新冠肺炎进展的临床过程中，T 淋巴细胞与抗体反应之间的有效合作可能代表了候选疫苗设计的关键[12-13, 36, 42, 44-47]。
在严重的新冠肺炎病例中，包括免疫细胞病变在内的免疫失衡，其分子机制尚未得到解释[48]。有文献分析了 SARS-CoV-2 宿主细胞进入受体 ACE2 和进入相关蛋白酶（TMPRSS2、CTSL和FURIN）在免疫系统中的转录组和蛋白组表达数据，发现免疫细胞中没有检测到ACE2，但观察到TMPRSS2、CTSL和FURIN有不同的转录组和蛋白质组表达[49]。SARS-CoV-2 宿主细胞进入受体ACE2在免疫系统成分或血系细胞中无法检测到表达，表明它在新冠肺炎中并不能介导免疫细胞病变[50]。我们的分析结果也表明，多个器官的 T 淋巴细胞中 ACE2 的表达非常低，但是肺与胰腺的其他入侵基因表达量相对较高（图2）。
文献提示 Ⅰ 型干扰素、丝裂原激活蛋白激酶和铁蛋白酶途径在疾病活动时被激活，在患者病情改善后逐渐恢复[34]。新冠肺炎患者的干扰素信号在淋巴细胞中升高，但在单核细胞中减弱[51]。再次提示 T 淋巴细胞在发病过程中的重要作用。对新冠肺炎患者的 CD4+ T 淋巴细胞的分析显示，住院治疗与细胞毒性滤泡辅助细胞和细胞毒性 T 辅助细胞的增加有关，而调节性 T 淋巴细胞则减少[10]。我们的分析结果表明，相对于其他器官，干扰素信号通路在肺部的 T 淋巴细胞中的表达增高（图4）。这有可能是肺作为响应 SARS-CoV-2 的主要器官，刺激应答干扰素而致。其他器官因为远离肺部，其 T 淋巴细胞的活化并不明显。
T 淋巴细胞在初始激活、增殖、或处于幼稚状态或静止、记忆状态时，有不同的能量和合成代谢需求。因此，生物能量是 T 淋巴细胞在健康和疾病中做出充分免疫反应的关键[52]。文献报道，T 淋巴细胞、单核细胞和粒细胞表现出线粒体质量增加，但只有 T 淋巴细胞积累了细胞内活性氧，代谢静止，并表现出线粒体结构的破坏，而在恢复过程中，T 淋巴细胞的活性氧下降到与未感染的对照组一致[52]。在转录方面，来自危重新冠肺炎患者的 T 淋巴细胞显示出对活性氧反应基因、以及与线粒体功能和 basigin 网络相关的基因的诱导[53]。提示 T 淋巴细胞代谢在疾病中的重要作用。该文献还报道，在没有症状或症状轻微的新冠肺炎患者中检测到 T 淋巴细胞脂肪酸摄取量明显增加[53]。我们利用肺 T 淋巴细胞作为参照，比较其他器官与肺在代谢途径方面的差异，结果也提示肺部对脂肪酸的结合表达高。
综上所述，本研究结果表明 T 淋巴细胞在新冠肺炎患者各个器官中的特殊异质性。研究提示了肺的 T 淋巴细胞独特的干扰素活化以及脂肪酸结合的特征，并导致新冠肺炎患者的代谢功能紊乱，下一步应该利用循环血液的 T 淋巴细胞的亚群进一步鉴定血液中干扰素活化的 T 淋巴细胞是否主要来源于肺部，还应解决其他专门针对 T 淋巴细胞代谢的药物是否能改善新冠肺炎重症患者的预后。本研究加强了在新冠肺炎中代谢的证据。由于代谢对免疫严重失调的T淋巴细胞具有特异性，它可能作为新冠肺炎治疗的靶标。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19，简称新冠肺炎）患者血液中的 T 淋巴细胞的数量低于健康对照组，与无症状者相比，有症状的新冠肺炎患者淋巴细胞减少更为突出，与无肺炎表现的患者相比，有症状患者的淋巴细胞减少也更为突出[1-7]。与中度患者相比，重症新冠肺炎患者 CD4+ T 和 CD8+ T 淋巴细胞数均进一步下降[8-13]。值得注意的是，较低的淋巴细胞计数被发现是严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染导致的死亡的临床预测因素[9, 14]。在新冠肺炎老年患者中，血液中高数量的淋巴细胞预示更好的预后[15-17]。输注携带高水平中和性抗体滴度的恢复期血浆后，新冠肺炎患者临床症状明显改善，前瞻性入组的严重新冠肺炎患者的淋巴细胞数量显著增加[18]。研究表明，血管紧张素转换酶 2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是介导 SARS-CoV-1 和 SARS-CoV-2 入胞的高亲和力受体，而免疫细胞中始终没有 ACE2 的表达[19-21]，这表明直接的病毒感染可能不是导致 T 淋巴细胞减少的原因，这值得进一步研究。此外，虽然这两种冠状病毒都有零星的病毒进入淋巴细胞的现象，但病毒似乎不能在这种细胞类型中复制，因此这种中止性感染的生物学意义并不确定[2, 22]。
对于新冠肺炎患者，是否每个器官中的 T 淋巴细胞具有相对特异的功能，目前仍然未知。在此，我们应用生物信息学方法，利用公共数据库高通量基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）及单细胞技术的分析方法，分析了 SARS-CoV-2 感染患者各器官的 T 淋巴细胞在体内的功能差异。现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 数据收集
单细胞转录组测序（single cell RNA sequencing，scRNA）/单细胞核转录组测序（single nucleus RNA sequencing，snRNA）测序数据来自 GEO（
1.2 单细胞测序数据分析流程
1.2.1 scRNA/snRNA 数据处理
使用函数 Read10X 将 CellRanger（10X Genomics）输出文件读入 Seurat。使用 Seurat 包（v4.0）分析 scRNA/snRNA 测序数据[27]，具体分析流程见网页（
1.2.2 细胞簇注释及数据可视化
使用已知细胞标记基因进行细胞类型注释[31]，分为四个主要细胞群：EPCAM+（上皮细胞）、CLDN5+（内皮细胞）、PTPRC+（免疫细胞）和COL1A2+（间质细胞）。使用 Subset()提取出免疫细胞，然后使用文献经典的 T 淋巴细胞标记基因（CD3E）标记 T 淋巴细胞，提取出 T 淋巴细胞。然后将来自 7 个器官的 T 淋巴细胞的细胞群体合并在一起，生成 1 个合并后的 Seurat 对象。使用 Seurat 函数 FindNeighbors 和 FindClusters 进行细胞聚类，UMAP 降维后生成最终的 Seurat 对象。UMAP 图、小提琴图、条形图、热图及点状图由 Seurat 中的 R 包 ggplot2、pheatmap 构建。所有热图均基于聚类平均基因表达以考虑细胞间转录组随机性，并且数据自动缩放以进行可视化。
1.2.3 寻找差异表达基因及 SARS-CoV-2 入侵基因选择
使用FindMarkers函数寻找肺与其他不同器官T淋巴细胞类群的标记基因。FindAllMarkers 函数会自动寻找每个类群和其他每个类群之间的标记基因。根据文献报道选择 SARS-CoV-2 入侵基因[32]，检索式为"ACE2", "BSG", "NRP1", "HSPA5", "AXL", "KREMEN1", "ASGL1", "HSPG2", "SLC35A1", "CLEC4D", "CD4", "SR-B1", "FURIN", "PCSK1", "PRSS1", "ST14", "CTSB", "CTSL", "TMPRSS2"，一方面提取上述入侵基因阳性的 T 淋巴细胞，比较不同器官 T 淋巴细胞中入侵基因阳性的细胞比例，一方面直接比较上述入侵基因在不同器官T淋巴细胞中 RNA 表达量。由于呼吸系统是 SARS-CoV-2 入侵的主要器官，肺的 T 淋巴细胞是感染病毒的首要 T 淋巴细胞[33]，设定肺的 T 淋巴细胞为参照物，比较常见干扰素基因 FOS、BST2、IFI27[34]的表达。
1.2.4 富集分析
使用基因本体论（gene ontology，GO）对差异表达基因进行富集分析（
1.3 统计学方法
所有计算或分析均使用 Prism 8 软件包（GraphPad）或 R 语言进行。采用双侧 t 检验比较组间差异，所有数据均表示为平均值±标准误差。P<0.05 为差异有统计学意义。使用 Wilcoxon 秩和统计检验对每个集群的差异表达基因进行分析。
2 结果
2.1 新冠肺炎患者多器官 T 淋巴细胞地图构建
从所选的 GEO 数据库中，获取了新冠肺炎患者 16 个肝脏、19 个心脏、2 个脾脏、6 个大脑、58 个肺、21 个肾脏、5 个胰腺组织的 scRNA/snRNA 数据，同时利用 PTPRC、CD3E 标记基因并提取出 T 淋巴细胞，构建 T 淋巴细胞地图，生成聚类分析 UMAP 图，分为 13 个群（图1a）。分析各器官的 T 淋巴细胞的高表达基因，总共发现 2517 个高变基因，包括胰腺 674 个、脾脏 15 个、肺 362 个、肾脏 468 个、心脏 288 个、脑 193 个、肝脏 517 个，其中最高的是胰腺（图1b）。分析各器官的前 50 位高表达基因，可以看出胰腺和肺的共有基因较多（图1c）。各器官中排列前 10 的高变基因分别为：脑，GFAP、LINGO1、MT−ND1、MT−ND2、SLC26A3、RASGEF1B、LINC00486、DHFR、MTRNR2L8、AC105402.3；肺，RPL41、CCL4、CCL4L2、RPS12、RPL34、RPLP1、RPS15A、RPL10、RPL39、RPS27；脾脏，INO80D、LINGO1、SLC26A3、RASGEF1B、DHFR、MTRNR2L8、IGHA1、FP671120.1、FP236383.1、MIB1；肝脏，PIP4K2A、CNOT6L、AC016831.7、KCNQ5、TOX、AUTS2、PLCB1、NCAM1、HDAC9、ADAMTS17；肾脏，MKL1、HSPH1、PLCG2、FP236383.1、FP671120.1、ABHD3、AC016831.7、KIAA1551、LINC00486、FNDC3B；胰腺，PRSS2、SST、REG1A、INS、CELA3A、CLPS、PRSS1、REG1B、GCG、TTR；心脏：MED13、TNRC6B、CMIP、RAPGEF1、TBC1D22A、BIRC6、AKAP13、MBD5、INPP5D、PPP6R3（图1d）。
图1
新冠肺炎患者不同器官的 T 淋巴细胞地图、聚类分析及差异表达基因分析图
a. 示意图显示了整个研究的分析工作流程。b. 新冠肺炎不同器官的 T 淋巴细胞差异表达基因个数。c. 每个器官 T 淋巴细胞的前 50 个标记基因表达的热图。红色高表达；蓝色低表达。d. 小提琴图显示了各器官中 T 淋巴细胞前 10 名高表达的基因以及这些基因在其余器官中的表达。
2.2 新冠肺炎患者不同器官 T 淋巴细胞异质性
在各个器官的 T 淋巴细胞中入侵基因 AXL、ASGL1、SR-B1、PRSS1、CTSB、TMPRSS2 阳性细胞比例为 0，入侵基因 ASGL1、SR-B1 RNA 未检测到。不同器官的 T 淋巴细胞中其他入侵基因表达存在明显的异质性，作为主要的入侵基因，ACE2 表达较低，表达最高者为肾脏（图2a），肺和胰腺的表达量高于其他器官（图2b）。对各个器官的 T 淋巴细胞功能 GO 富集分析显示，不同器官 T 淋巴细胞亚群富集到的信号通路不同：肺主要涉及蛋白合成（图2c），肾脏主要涉及表观遗传（图2d），脑的 T 淋巴细胞主要富集细胞周期（图2e），肝脏主要涉及到免疫反应（图2f），胰腺与肺相似，主要跟蛋白合成相关（图2g），心脏主要富集免疫应答（图2h），脾脏的T淋巴细胞主要跟凋亡相关（图2i）。
图2
各个器官的 T 淋巴细胞中入侵基因以及高表达基因的富集分析
a. 不同器官 T 淋巴细胞 SARS-CoV-2 入侵基因阳性的细胞数比例。b. 点状图显示入侵基因在各器官 T 淋巴细胞群的表达情况，肺和胰腺的表达量高于其他器官。c～i. GO 富集分析对每个器官差异基因进行富集分析，显示不同器官 T 淋巴细胞亚群富集到的信号通路不同。红框内显示各脏器明显富集的信号通路。其中肺明显富集到了蛋白合成相关的信号通路（cytoplasmic translation，ribonucleoprotein complex biogenesis），肾脏明显富集到了表观遗传相关的信号通路（histone modification），脑主要富集细胞周期（regulation of cell cycle G1/S phase transition，cell cycle G1/S phase transition），肝脏主要涉及到免疫反应（histone modification），胰腺主要跟蛋白合成相关（cytoplasmic translation，ribonucleoprotein complex biogenesis，ribosome assembly），心脏主要富集免疫应答（immune response-regulating signaling pathway，immune response-regulating cell surface receptor signaling pathway），而脾脏主要跟凋亡相关（negative regulation of execution phase of apoptosis）
2.3 新冠肺炎患者不同器官 T 淋巴细胞相关性
对各个器官 T 淋巴细胞相关性的分析显示，心肝肾的相关性大（图3a），利用维恩图验证各个器官的富集信号通路的相关性，筛选出了细胞间交互的基因（图3b）。通过 GO 富集分析，心脏与肝脏交互的基因主要集中在免疫应答，肝脏与肾脏交互的基因主要集中在表观遗传；肝脏与脑交互的基因主要激活 wnt 信号通路；心脏、脑、肝脏与肾脏交互的基因主要集中在肽的修饰；心脏、肝脏与肾脏交互的基因主要集中在细胞周期；脑、肾脏与肝脏交互的基因主要集中在能量代谢；肺与胰腺交互的基因主要集中在蛋白质合成；脑与肾脏交互的基因主要集中在 cAMP 合成（图3c）。
图3
新冠肺炎患者不同器官 T 淋巴细胞相关性
a. 热图显示每个器官 T 淋巴细胞亚群中基因表达的相关性分析，提示心肝肾的相关性大（色阶：红色，相关性最高； 蓝色，相关性最低）。b. 维恩图显示在不同器官 T 淋巴细胞上调的基因。图表下方的黑色连接点表示相交的组织簇，纵轴代表交互的基因数目，横轴每个器官的基因数目。c. GO 富集分析对不同器官共同表达的差异基因进行富集分析（色阶：红色，
2.4 肺是感染新冠肺炎后应答干扰素的独特器官
与肺比较，其余器官的 T 淋巴细胞的干扰素信号通路降低，说明肺是一个在感染新冠肺炎后应答干扰素的独特器官（图4a～f）。常见干扰素基因中 FOS 在肺组织明显高表达，BST2在胰腺组织明显高表达（图4g）。
图4
与干扰素相关的基因在肺与其他器官中 T 淋巴细胞的表达差异
a～f. 分析新冠肺炎患者其他器官组织与肺组织 T 淋巴细胞亚群中的差异基因，火山图显示心脏、肝脏、脑、脾脏、胰腺、肾脏组织与肺组织相比上调及下调基因（红色是上调显著的基因，绿色是下调显著的基因）。GSEA 对差异基因进行富集分析，显示相对于其他器官组织，肺组织 T 淋巴细胞群明显富集到干扰素相关信号通路（NES：富集通路得分的统计量，为正，表示通路基因集富集在排序序列前方；为负，表示某一功能基因集富集在排序序列后方。Norminal
2.5 代谢基因在不同器官间 T 淋巴细胞异质性
再次设定肺的 T 淋巴细胞为对照，脑的脂肪酸合成信号通路下降（图5a）；肝脏的脂肪酸合成和氨基酸的转运下调（图5b）；心脏的脂肪酸合成增加与脂肪酸的结合下调（图5c）；肾脏的脂肪酸转运降低与糖的转运增强（图5d）；胰腺的氨基酸合成增加与脂肪酶下降（图5e）；脾脏的碳水化合物以及脂肪下调（图5f）。
图5
代谢基因在肺与其他器官中 T 淋巴细胞的表达差异
a. 肺组织与脑组织 T 淋巴细胞差异基因富集到脂肪酸代谢；b. 肺组织与肝组织 T 淋巴细胞差异基因富集到脂肪酸、氨基酸代谢；c. 心脏组织与肺组织 T 淋巴细胞差异基因中，心脏组织明显富集到脂质代谢过程，肺组织富集到了脂肪酸代谢过程；d. 肾脏组织与肺组织 T 淋巴细胞差异基因中，肾脏组织明显富集到了脂肪酸代谢，肺组织富集到了糖代谢；e. 胰腺组织与肺组织 T 淋巴细胞差异基因中，胰腺组织明显富集到了氨基酸及糖代谢过程，肺组织富集到了脂代谢；f. 脾脏组织与肺组织 T 淋巴细胞差异基因中，肺组织富集到了碳水化合物及脂质代谢。
3 讨论
本研究应用生物信息学方法，利用单细胞荟萃方法，通过挖掘公开发表在 GEO 数据库的基因数据集，提取常见的各个器官的T淋巴细胞，在单细胞层面揭示了各个器官 T 淋巴细胞的功能异质性。同时发现干扰素信号通路在肺的 T 淋巴细胞高表达，且对脂肪酸的结合起主要调控作用。
既往研究发现 SARS-CoV-2 感染患者普遍存在体液免疫反应，并且抗 SARS-CoV-2 IgG 滴度的多少与循环病毒特异性 CD4+ 和CD8+ T 淋巴细胞的广度密切相关[12, 36-37]。一项研究报告了一组具有干细胞样记忆表型的多功能 SARS-CoV-2 特异性 T 淋巴细胞群，具有这些 T 淋巴细胞群的个体为无症状和轻度新冠肺炎者[38]；这表明在没有抗体的情况下，强大而广泛的 T 淋巴细胞反应可能足以提供针对 SARS-CoV-2 的免疫保护[10, 12, 39-43]。因此，在新冠肺炎进展的临床过程中，T 淋巴细胞与抗体反应之间的有效合作可能代表了候选疫苗设计的关键[12-13, 36, 42, 44-47]。
在严重的新冠肺炎病例中，包括免疫细胞病变在内的免疫失衡，其分子机制尚未得到解释[48]。有文献分析了 SARS-CoV-2 宿主细胞进入受体 ACE2 和进入相关蛋白酶（TMPRSS2、CTSL和FURIN）在免疫系统中的转录组和蛋白组表达数据，发现免疫细胞中没有检测到ACE2，但观察到TMPRSS2、CTSL和FURIN有不同的转录组和蛋白质组表达[49]。SARS-CoV-2 宿主细胞进入受体ACE2在免疫系统成分或血系细胞中无法检测到表达，表明它在新冠肺炎中并不能介导免疫细胞病变[50]。我们的分析结果也表明，多个器官的 T 淋巴细胞中 ACE2 的表达非常低，但是肺与胰腺的其他入侵基因表达量相对较高（图2）。
文献提示 Ⅰ 型干扰素、丝裂原激活蛋白激酶和铁蛋白酶途径在疾病活动时被激活，在患者病情改善后逐渐恢复[34]。新冠肺炎患者的干扰素信号在淋巴细胞中升高，但在单核细胞中减弱[51]。再次提示 T 淋巴细胞在发病过程中的重要作用。对新冠肺炎患者的 CD4+ T 淋巴细胞的分析显示，住院治疗与细胞毒性滤泡辅助细胞和细胞毒性 T 辅助细胞的增加有关，而调节性 T 淋巴细胞则减少[10]。我们的分析结果表明，相对于其他器官，干扰素信号通路在肺部的 T 淋巴细胞中的表达增高（图4）。这有可能是肺作为响应 SARS-CoV-2 的主要器官，刺激应答干扰素而致。其他器官因为远离肺部，其 T 淋巴细胞的活化并不明显。
T 淋巴细胞在初始激活、增殖、或处于幼稚状态或静止、记忆状态时，有不同的能量和合成代谢需求。因此，生物能量是 T 淋巴细胞在健康和疾病中做出充分免疫反应的关键[52]。文献报道，T 淋巴细胞、单核细胞和粒细胞表现出线粒体质量增加，但只有 T 淋巴细胞积累了细胞内活性氧，代谢静止，并表现出线粒体结构的破坏，而在恢复过程中，T 淋巴细胞的活性氧下降到与未感染的对照组一致[52]。在转录方面，来自危重新冠肺炎患者的 T 淋巴细胞显示出对活性氧反应基因、以及与线粒体功能和 basigin 网络相关的基因的诱导[53]。提示 T 淋巴细胞代谢在疾病中的重要作用。该文献还报道，在没有症状或症状轻微的新冠肺炎患者中检测到 T 淋巴细胞脂肪酸摄取量明显增加[53]。我们利用肺 T 淋巴细胞作为参照，比较其他器官与肺在代谢途径方面的差异，结果也提示肺部对脂肪酸的结合表达高。
综上所述，本研究结果表明 T 淋巴细胞在新冠肺炎患者各个器官中的特殊异质性。研究提示了肺的 T 淋巴细胞独特的干扰素活化以及脂肪酸结合的特征，并导致新冠肺炎患者的代谢功能紊乱，下一步应该利用循环血液的 T 淋巴细胞的亚群进一步鉴定血液中干扰素活化的 T 淋巴细胞是否主要来源于肺部，还应解决其他专门针对 T 淋巴细胞代谢的药物是否能改善新冠肺炎重症患者的预后。本研究加强了在新冠肺炎中代谢的证据。由于代谢对免疫严重失调的T淋巴细胞具有特异性，它可能作为新冠肺炎治疗的靶标。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
