miR-155/COX-2/PGE2信号通路在薯蓣皂苷改善哮喘小鼠气道炎症中的作用_《中国呼吸与危重监护杂志》

作者：

梁敏 ¹ , 边俊梅 ¹ , 熊诗思 ¹ , 李弯 ¹ ,  江震 ²

1. 武汉大学附属同仁医院（武汉市第三医院）儿科（湖北武汉 430074）;
2. 武汉市第九医院（湖北武汉 430074）;

关键词：

薯蓣皂苷哮喘气道炎症 microRNA-155 环氧合酶2/前列腺素E2

DOI：

10.7507/1671-6205.202111005

视频：

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摘要 全文 图表 视频 参考文献 施引文献 补充材料

目的探究薯蓣皂苷（dioscin，Dio）对哮喘小鼠气道炎症的作用及microRNA-155（miR-155）/环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）/前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）通路在其中的变化。方法 70只小鼠随机分为对照（control）组、模型组、抑制剂（inhibitor）阴性对照组（inhibitor-NC组）、miR-155 inhibitor组、Dio组、Dio+miR-155模拟物（mimic）阴性对照组（Dio+mimic-NC组）、Dio+miR-155 mimic组，每组10只。采用屋尘螨诱导制备哮喘小鼠模型；酶联免疫吸附试验检测小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中PGE2、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotriene 1，CysLTs）、半胱氨酰白三烯受体1（cysteinyl leukotriene receptor 1，CysLTR1）和白细胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5、IL-13水平；苏木精–伊红和高碘酸希夫染色观察气道周围炎症细胞的浸润情况及杯状细胞分泌黏液的情况；实时荧光定量聚合酶链反应检测小鼠肺组织miR-155、COX-2 mRNA的表达水平；蛋白印迹法检测小鼠肺组织COX-2蛋白表达。结果 miR-155 inhibitor和Dio能降低哮喘小鼠BALF中PGE2、TNF-α、CysLTs、CysLTR1和IL-4、IL-5、IL-13水平，减轻肺组织炎症细胞浸润和杯状细胞黏液分泌情况，并降低肺组织miR-155、COX-2的mRNA和蛋白表达；而miR-155 mimic能明显削弱Dio的抗哮喘作用。结论 Dio的抗哮喘作用可能与抑制miR-155/COX-2/PGE2途径，进而减轻哮喘小鼠气道炎症有关。

引用本文： 梁敏, 边俊梅, 熊诗思, 李弯, 江震. miR-155/COX-2/PGE2信号通路在薯蓣皂苷改善哮喘小鼠气道炎症中的作用. 中国呼吸与危重监护杂志, 2022, 21(11): 790-796. doi: 10.7507/1671-6205.202111005 复制

哮喘是以气道炎症、气道高反应性和气道重塑为主要病理生理特征的气道炎性疾病^[1]，其病因和发病机制复杂，大量临床研究证实Th1/Th2、Th17/Treg介导的免疫应答和炎症在哮喘发病机制中发挥重要作用^[2-3]。近年来，不少研究发现微RNA（microRNA，miRNA，miR）通过调控靶基因参与机体病理生理过程，在哮喘发生、发展过程中，多种miRNA存在异常表达，如miR-144-3p^[4]、miR-155、miR-30a-3p^[5]等。miR-155是一种内源性非编码RNA，在活化的B细胞、T细胞、树突状细胞和巨噬细胞高度表达，主要参与免疫细胞的发育和免疫反应^[6-7]。在哮喘中，miR-155可以结合环氧合酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2），并维持COX-2 mRNA的稳定性^[8]，此外，miR-155表达与哮喘人气道平滑肌细胞中COX-2的表达呈正相关，可增强COX-2的表达和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的分泌，并通过调控COX-2/PGE2途径参与哮喘发病^[9-10]。

薯蓣皂苷（dioscin，Dio）是一种甾体皂苷，在许多药用植物中大量表达，例如薯蓣。这种天然产物具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒和保肝活性^[11]，对卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）诱导的哮喘小鼠的气道炎症具有显著的改善作用^[12-13]，通过抑制COX-2水平，可减轻博来霉素诱导的小鼠肺部炎症反应^[14]。然而，关于Dio对哮喘的作用机制的研究较少，尤其是屋尘螨（house dust mite，HDM）诱导的哮喘的影响研究。因此，我们探讨了Dio在HDM诱导的哮喘小鼠模型中的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性健康SPF级Balb/c小鼠70只，6～8周龄，体重18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证为SCXK（京）2019-0009。小鼠饲养于武汉大学（医学研究院）［使用许可证为SYXK（鄂）20180102］，放在可控制的光照下保持12 h明暗交替，温度（20±2）℃，相对湿度45%～60%，可以自由获取食物和水。研究得到本院实验动物伦理委员会核准同意（批准号20190000237）。

1.2 药品及试剂

Dio（HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司，货号B21176）；HDM（美国Greer Labs，货号XPB81D3A25）；小鼠miR-155抑制剂（inhibitor）和inhibitor阴性对照、miR-155模拟物（mimic）和mimic阴性对照以及PCR引物序列购自Gene Pharma公司（中国上海）；放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、苏木精–伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂和二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒（碧云天生物科技公司，批号分别为C0105、P0013B、P0012S）；小鼠PGE2、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（ml037542、ml002095、ml064310、ml063157、ml063123，上海酶联生物科技有限公司）；小鼠半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotriene 1，CysLTs。货号CD-106750）、半胱氨酰白三烯受体1（cysteinyl leukotriene receptor 1，CysLTR1。货号CD-103254）ELISA试剂盒（武汉纯度生物科技有限公司）；高碘酸希夫（periodic acid-schiff，PAS）染色试剂盒（G1285，北京索莱宝科技有限公司）；兔抗小鼠COX-2（ab179800）、β-肌动蛋白（β-actin。货号ab8227）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG二抗（ab205718）购自英国Abcam公司。iMark680多功能酶标仪（美国Bio-Rad公司）、BX61电动显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制备及药物处理

小鼠适应性饲养7 d后开始实验。70只小鼠随机分为对照（control）组、模型组、inhibitor阴性对照组（inhibitor-NC组）、miR-155 inhibitor组、Dio组、Dio+miR-155 mimic阴性对照组（Dio+mimic-NC组）、Dio+miR-155 mimic组，每组10只。其中，对照组、模型组、Dio组用于探索Dio的作用；inhibitor-NC组、miR-155 inhibitor组、Dio+mimic-NC组、Dio+miR-155 mimic组用于探索Dio作用机制。根据文献［15］的方法制备哮喘小鼠模型：除对照组外，其余组小鼠分别在实验第1、7、14 d腹腔注射HDM 0.1 mL（0.5 mg/mL），第21～23 d开始连续3 d滴鼻，每天1次滴鼻10 μL的HDM（2.5 mg/mL）激发；对照组给予等量PBS溶液。于第17 d开始，inhibitor-NC组与miR-155 inhibitor组尾静脉注射0.3 mL的miR-155 inhibitor阴性对照和miR-155 inhibitor；Dio+mimic-NC组和Dio+miR-155 mimic组尾静脉注射0.3 mL的miR-155 mimic阴性对照和miR-155 mimic，然后给予Dio混悬液（60 mg/kg）灌胃^[12]，1次/d，共7次；Dio组给予Dio混悬液（60 mg/kg）灌胃，1次/d，共7次^[12]；最后一次激发24 h后处死小鼠并取材。

1.3.2 小鼠一般状态观察

观察致敏和激发前后各组小鼠的行为学变化，是否有气促、呼吸困难、打喷嚏、烦躁不安、喘息等典型的哮喘症状。

1.3.3 支气管肺泡灌洗液中炎性相关因子的测定

处死小鼠，放入75%乙醇中浸泡2 min后暴露气管，行气管插管，结扎右肺，用注射器将0.3 mL的生理盐水溶液缓慢注入左肺后回抽，以上过程重复3次，合并3次支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），纱布过滤去除黏液后离心（4 ℃、2000 r/min离心10 min），取上清保存于–20 ℃冰箱。按照ELISA试剂盒说明书的操作检测各组小鼠BALF中PGE2、TNF-α、CysLTs、CysLTR1和Th2型细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）水平。

1.3.4 肺组织病理学变化

取出小鼠的肺组织，生理盐水冲洗后，滤纸吸干表面水分；左侧肺组织分为两部分，一部分液氮速冻后，–80 ℃冰箱保存，用于蛋白印迹法（Western blot），另一部分用于实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）；取右侧肺组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，进行HE和PAS染色，观察气道周围炎症细胞的浸润情况及杯状细胞分泌黏液的情况；并对各组病理学进行分级评分；每只小鼠肺切片任取5个独立区域进行评分，并取平均值。评分标准^[16-17]如下，0分为无炎症细胞，染色面积<5%；1分为少许炎症细胞，染色面积5%～25%；2分为炎症细胞形成环状，层厚为1个细胞，肺泡壁轻度增厚，染色面积25%～50%；3分为炎症细胞成环状，层厚为2～4个细胞，肺泡壁显著增厚染色面积50%～75%；4分为炎症细胞成环状，层厚>4个细胞，肺泡壁显著增厚，染色面积>75%。

1.3.5 RT-qPCR检测肺组织miR-155、COX-2 mRNA的表达

使用TRIzol从各组织细胞中提取总RNA，按照试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，进行PCR扩增。反应体系（20 μL）：cDNA（200 ng/μL）2 μL，SYBR^® Premix Ex Taq^TM（2×）10 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH₂O 7.2 μL。反应条件：94 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，75 ℃延伸20 s，进行40个循环。用U6或甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为对照，miR-155、COX-2 mRNA的相对表达量采用2^–ΔΔCt方法计算。见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

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基因	引物序列
miR-155	F: 5′-GCCTTAATGCTAATCGTGATAG-3′
R: 5′-TTCCGTATGCATCATGTGAGTA‐3′
U6	F: 5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′
R: 5′-AAGAAACGATACAGATTGGAGTA-3′
COX-2	F: 5′-CAAGCACAATAGATGCACAAGAAG-3′
R: 5′-ATATAGAATGCGTAGAGAGGGGAG-3′
GAPDH	F: 5′-ATGGGTGTGAACCACGAGA‐3′
R: 5′-CAGGGATGATGTTCTGGGCA‐3′

1.3.6 Western blot检测肺组织COX-2蛋白表达

按照试剂盒说明书的操作提取肺组织中的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后取等量蛋白质样品上样，十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗（COX-2按1∶1000的比例稀释；β-actin按1∶2000的比例稀释），4 ℃下孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG二抗（1∶5000）室温孵育1 h，电化学发光显色，以β-actin为内参，通过与内参的灰度比，得出目的条带的相对表达水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0和Image pro plus 6.0软件进行统计分析。数据用均数±标准差（±s）表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间有差异进一步采用SNK-q检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠的一般状态

模型组和inhibitor-NC组小鼠出现抓耳搔鼻、打喷嚏、烦躁不安、喘息等典型的哮喘症状，而miR-155 inhibitor组、Dio组和Dio+mimic-NC组小鼠的哮喘症状较HDM组明显减少，Dio+miR-155 mimic组小鼠的哮喘症状较Dio组明显增多，对照组小鼠表现正常。

2.2 各组小鼠肺组织病理学变化

对照组支气管和肺泡结构清晰，未见明显异常，且未见杯状细胞增生；模型组和inhibitor-NC组小鼠肺组织支气管和血管壁周围可见大量炎症细胞浸润，杯状细胞增生明显（P<0.05）；与模型组相比，miR-155 inhibitor组、Dio组和Dio+mimic-NC组小鼠肺组织气道炎症明显减轻，黏液分泌减少（P<0.05）；与Dio组相比，Dio+miR-155 mimic组小鼠肺组织气道炎症增加，黏液分泌增加（P<0.05）；与inhibitor-NC组相比，miR-155 inhibitor组小鼠肺组织气道炎症明显减轻，黏液分泌减少（P<0.05）；与Dio+mimic-NC组相比，Dio+miR-155 mimic组小鼠肺组织气道炎症增加，黏液分泌增加（P<0.05）；见图1、表2。

图1 各组小鼠肺组织病理学变化（HE染色、PAS染色，200×）

对照组（①）小鼠肺部支气管和肺泡结构清晰；模型组（②）和inhibitor-NC组（③）小鼠肺组织支气管和血管壁周围可见大量炎症细胞浸润，杯状细胞增生明显；miR-155 inhibitor组（④）、Dio组（⑤）和Dio+mimic-NC组（⑥）小鼠肺组织气道周围炎症细胞浸润和黏液分泌减少；Dio+miR-155 mimic组（⑦）小鼠肺组织气道炎症增加，黏液分泌增加。

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表2 各组小鼠肺组织病理评分［（

），分，n=10］

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组别	炎症评分	黏液评分
对照组	0.00±0.00	0.00±0.00
模型组	3.26±0.25^a	2.34±0.21^a
inhibitor-NC组	3.23±0.24^a	2.36±0.24^a
miR-155 inhibitor组	1.75±0.17^abd	1.22±0.13^abd
Dio组	1.86±0.15^ab	1.41±0.15^ab
Dio+mimic-NC组	1.84±0.16^ab	1.43±0.17^ab
Dio+miR-155 mimic组	2.30±0.19^abce	1.87±0.18^abce
F值	364.707	226.018
P值	0.000	0.000
与对照组相比，^aP<0.05；与模型组相比，^bP<0.05；与Dio组相比，^cP<0.05；与inhibitor-NC组相比，^dP<0.05；与Dio+mimic-NC组相比，^eP<0.05。

2.3 各组小鼠BALF中炎性因子水平

与对照组相比，模型组和inhibitor-NC组小鼠BALF中PGE2、TNF-α、CysLTs、CysLTR1和IL-4、IL-5、IL-13水平显著升高（P<0.05）；与模型组相比，miR-155 inhibitor组、Dio组和Dio+mimic-NC组小鼠BALF中上述指标水平明显降低（P<0.05）；与Dio组相比，Dio+miR-155 mimic组小鼠BALF中上述指标水平明显升高（P<0.05）；与inhibitor-NC组相比，miR-155 inhibitor组小鼠BALF中上述指标水平明显降低（P<0.05）；与Dio+mimic-NC组相比，Dio+miR-155 mimic组小鼠BALF中上述指标水平明显升高（P<0.05）；见表3。

表3 各组小鼠BALF中炎性因子水平［（

），pg/mL，n=10］

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组别	PGE2	TNF-α	CysLTs	CysLTR1	IL-4	IL-5	IL-13
对照组	82.17±8.15	51.29±6.04	17.53±1.86	12.66±1.35	11.54±1.39	40.21±6.05	82.30±9.24
模型组	174.34±13.22^a	116.30±7.59^a	38.61±2.47^a	33.74±2.01^a	97.26±11.08^a	127.60±14.29^a	165.17±20.52^a
inhibitor-NC组	168.45±14.17^a	120.54±8.13^a	40.39±3.02^a	31.86±2.55^a	100.15±10.93^a	130.45±15.36^a	171.29±21.30^a
miR-155 inhibitor组	116.27±10.26^abd	77.51±6.25^abd	23.42±2.18^abd	20.53±2.24^abd	52.48±6.73^abd	65.12±8.74^abd	108.06±15.81^abd
Dio组	125.98±12.21^ab	84.86±7.73^ab	29.08±2.45^ab	25.61±1.98^ab	64.10±7.82^ab	78.34±10.51^ab	113.42±14.57^ab
Dio+mimic-NC组	120.53±11.46^ab	87.21±8.42^ab	28.33±1.97^ab	23.49±2.12^ab	60.35±7.45^ab	73.50±8.47^ab	108.96±13.23^ab
Dio+miR-155 mimic组	157.30±13.55^abce	99.75±9.24^abce	36.70±2.83^ace	29.58±2.30^abce	85.04±10.16^abce	109.26±14.30^abce	140.15±17.64^abce
F值	76.101	95.523	120.561	119.513	130.076	85.939	39.477
P值	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
与对照组相比，^aP<0.05；与模型组相比，^bP<0.05；与Dio组相比，^cP<0.05；与inhibitor-NC组相比，^dP<0.05；与Dio+mimic-NC组相比，^eP<0.05。

2.4 各组小鼠肺组织miR-155、COX-2 mRNA的表达

与对照组相比，模型组和inhibitor-NC组小鼠肺组织miR-155、COX-2 mRNA的表达显著升高（P<0.05）；与模型组相比，miR-155 inhibitor组、Dio组和Dio+mimic-NC组小鼠miR-155、COX-2 mRNA的表达明显降低（P<0.05）；与Dio组相比，Dio+miR-155 mimic组小鼠COX-2 mRNA的表达明显升高（P<0.05）；与inhibitor-NC组相比，miR-155 inhibitor组小鼠肺组织miR-155、COX-2 mRNA的表达明显降低（P<0.05）；与Dio+mimic-NC组相比，Dio+miR-155 mimic组小鼠肺组织COX-2 mRNA的表达明显升高（P<0.05）；见表4。

表4 各组小鼠肺组织miR-155、COX-2的表达［（

），n=10］

表选项

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组别	miR-155	COX-2 mRNA	COX-2蛋白
对照组	1.00±0.00	1.00±0.00	0.35±0.04
模型组	1.89±0.12^a	2.06±0.19^a	0.86±0.07^a
inhibitor-NC组	1.92±0.15^a	1.99±0.17^a	0.83±0.05^a
miR-155 inhibitor组	1.43±0.13^abd	1.36±0.12^abd	0.41±0.06^bd
Dio组	1.56±0.11^ab	1.51±0.16^ab	0.53±0.04^ab
Dio+mimic-NC组	1.59±0.16^ab	1.55±0.14^ab	0.55±0.05^ab
Dio+miR-155 mimic组	1.70±0.15^ab	1.83±0.19^ace	0.70±0.06^abce
F值	59.906	61.228	135.846
P值	0.000	0.000	0.000
与对照组相比，^aP<0.05；与模型组相比，^bP<0.05；与Dio组相比，^cP<0.05；与inhibitor-NC组相比，^dP<0.05；与Dio+mimic-NC组相比，^eP<0.05。

2.5 各组小鼠肺组织COX-2蛋白表达

与对照组相比，模型组和inhibitor-NC组小鼠肺组织COX-2蛋白表达显著升高（P<0.05）；与模型组相比，miR-155 inhibitor组、Dio组和Dio+mimic-NC组小鼠COX-2蛋白表达明显降低（P<0.05）；与Dio组相比，Dio+miR-155 mimic组小鼠COX-2蛋白表达明显升高（P<0.05）；与inhibitor-NC组相比，miR-155 inhibitor组小鼠肺组织COX-2蛋白表达明显降低（P<0.05）；与Dio+mimic-NC组相比，Dio+miR-155 mimic组小鼠肺组织COX-2蛋白表达明显升高（P<0.05）；见图2、表4。

图2 各组小鼠肺组织COX-2蛋白表达Western blot检测像

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3 讨论

MiR-155是一种多效性microRNA，在调节炎症反应中起关键作用。研究表明，哮喘患者的miR-155和COX-2、PGE2水平均升高；且在哮喘气道平滑肌细胞中增加miR-155的表达可以提高COX-2蛋白的丰度，从而增加PGE2的分泌，使用COX-2选择性抑制剂NS-398处理哮喘气道平滑肌细胞可完全抑制PGE2的分泌^[9]；表明PGE2的分泌需要COX-2，抑制miR-155表达可以降低COX-2蛋白表达和PGE2分泌。COX-2通常在炎症过程中被诱导，调节Th1、Th2和Th17细胞，与过敏原诱导的肺部炎症的恶化、全身性炎症和体内IgE产生有关^[18-19]。PGE2在过敏性肺部炎症期间在气道中产生，是一种有效的平滑肌松弛剂，同时也是一种有效的促炎介质，与多种炎症性疾病有关。有研究显示，PGE2可通过EP2促进B细胞分泌IgE，促进体内抗原特异性IgE反应，有助于哮喘的发展^[20]。在本研究中，在HDM诱导的哮喘小鼠中，miR-155和COX-2表达均升高，同时BALF中PGE2、TNF-α、CysLTs、CysLTR1水平和Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13水平均升高。CysLTs通过其受体CysLTR1可促使嗜酸性粒细胞聚集，促进气道黏液分泌，引起气道重塑，是哮喘发病过程中最重要的炎症介质之一^[2]。病理结果显示肺组织有大量炎症细胞浸润和杯状细胞增生；而下调miR-155表达后，COX-2和PGE2、TNF-α、CysLTs、CysLTR1、Th2细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）水平均降低，肺部炎症减轻，这与以往的研究结果一致；提示，miR-155/COX-2/PGE2轴可能在调节哮喘气道炎症中起关键作用。

Dio是一类从药用植物中分离出的甾体皂甙，已被证实具有抗哮喘作用，可抑制肺组织NF-κB活化和MAPK信号通路，进而抑制肺过敏性炎性因子生成，改善OVA诱发的哮喘模型中的气道炎症^[12-13]。Zhang等^[21]的研究显示，Dio可通过调节miR-34a/Sirt1信号通路，降低COX-2和炎症因子的表达，抑制炎症、氧化–硝化应激和细胞凋亡，减轻顺铂引起的肾损伤；这表明Dio可通过调控miRNA，进而影响mRNA的表达。作为COX-2的上游调控因子，miR-155是否参与Dio对COX-2的调节及哮喘的改善作用还未可知。在本研究中，给予Dio干预后，发现哮喘小鼠肺组织中miR-155表达降低，同时COX-2、PGE2、TNF-α、CysLTs、CysLTR1水平均降低，肺部炎症减轻，与miR-155 inhibitor治疗效果一致；提示，Dio的抗哮喘作用可能与降低miR-155的表达有关。为了进一步验证此结果，本研究在Dio干预的基础上给予miR-155 mimic以上调miR-155表达，结果显示，Dio对COX-2表达的抑制作用和抗哮喘作用被miR-155减弱。提示，Dio可能通过下调miR-155，降低COX-2的表达，进而抑制炎症相关细胞因子的释放，减轻哮喘小鼠气道炎症。

综上所述，Dio的抗哮喘作用可能与抑制miR-155/COX-2/PGE2通路，进而减轻哮喘小鼠气道炎症有关。但本研究尚存在一定不足，首先，miR-155有多个靶基因，除了调节COX-2/PGE2信号通路外，是否有其他途径参与Dio对哮喘气道炎症的改善作用仍有待进一步分析；其次，未对miR-155/COX-2/PGE2途径下游相关免疫应答细胞因子（如Th1、Th2）水平进行检测，后续会进行补充。此外，PGE2在哮喘发病机制中的作用存在一定争议，一些研究表明PGE2在哮喘的发生、发展中起保护性作用^[22]；这与本研究结果看似矛盾，通过查阅资料发现，PGE2在哮喘中的作用（促进或抑制哮喘病理特征）可能与E-前列腺素（EP）受体亚型（EP1、2、3和4）有关，这些亚型在不同的驻留和浸润气道细胞上以不同水平表达^[23]。而Dio对PGE2的抑制作用是通过何种受体发挥抗哮喘作用的还未可知。因此，在未来的研究中将对PGE2受体亚型进行分析，进一步明确Dio的抗哮喘机制。

利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。