引用本文： 拉周措毛, 李玲义, 高瑞, 刘虹. 藏、汉族OSAHS患者血液流变学指标以及PI3K/AKT/NF-κB p65信号通路中HIF-1α/2α表达的差异性研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2022, 21(7): 471-477. doi: 10.7507/1671-6205.202007070 复制
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是一种常见的慢性病，临床表现为夜间打鼾、白天嗜睡、认知功能衰退等[1]。男性OSAHS患病率为2%～4%，女性患病率为1%～2%。研究发现世代居住在高原的藏族在氧的摄取、运输与利用方面明显优于汉族[2]，在呼吸暂停低通气指数（apnea-hypopnea index，AHI）相近的情况下，藏族中重度OSAHS患者睡眠时平均血氧饱和度和睡眠期最低血氧饱和度明显低于汉族[3]。OSAHS易导致心血管疾病以及代谢性疾病，是缺血性脑卒中[4]、冠状动脉粥样硬化性心脏病[5]、肺动脉栓塞[6]等血栓性疾病的独立危险因素。间歇性缺氧是OSAHS的标志性表现，低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/低氧诱导因子2α（hypoxia-inducible factor-2α，HIF-2α）是调节间歇性缺氧的关键基因，也是目前临床上较为认可的OSAHS的诊断标志物[7-8]，其上游的PI3K/AKT/NF-κB p65是参与多种慢性炎症疾病病理的重要通路，其中包括OSAHS[9]。本研究拟探讨藏族和汉族OSAHS患者血液流变学以及血液代谢中HIF-1α/2α表达水平的差异性。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 临床资料
纳入2017年1月—2019年12月在青海大学附属医院经多导睡眠图（polysomnography，PSG）确诊的藏族OSAHS患者（简称T-OSAHS组）、汉族OSAHS患者（简称H-OSAHS组），以及接受体检的藏族健康人（简称T-HP组）、汉族健康人（简称H-HP组），每组30例。AHI是每小时睡眠中呼吸暂停和低通气的总和，已被广泛用作OSAHS的诊断和评估标准[10]。本研究中健康人的AHI<5次/h，重度OSAHS患者的AHI>20次/h。OSAHS诊断标准参照我国2009年制定的《阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊断和外科治疗指南》及美国睡眠医学会2009年制定的《成人阻塞性睡眠呼吸暂停评价、管理与长期治疗临床指南》。藏族受试者纳入标准：（1）长期生活于海拔2260 m至少3年的藏族人；（2）家人3代以内与其他民族均未通婚。排除标准：（1）有其他睡眠障碍［国际睡眠障碍分类（ICSD-II）诊断］或接受过与睡眠有关的呼吸障碍治疗的病史；（2）合并有冠状动脉粥样硬化性心脏病、肺血栓栓塞症、深静脉血栓形成、缺血性脑卒中、近期有感染、手术或创伤的患者；（3）怀孕或者哺乳期的女性。该研究得到了青海大学附属医院医学伦理委员会和生物安全管理委员会的审查和批准（AF-RHEC-0062-01号）。所有参与者均签署知情同意书并积极配合该项研究。
1.1.2 试剂
TRIzol、逆转录试剂盒、实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）试剂均购自大连Takara公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；人外周血单核细胞分离液试剂盒购自上海研谨生物科技公司；一抗兔抗磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K；ab32089，英国Abcam公司）；一抗兔抗丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT；ab38449，英国Abcam公司）；一抗兔抗核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65抗体（ab32536，英国Abcam公司）；一抗兔抗HIF-1α抗体（ab51608，英国Abcam公司）；一抗兔抗HIF-2α抗体（ab109616，英国Abcam公司）；二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab205718，英国Abcam公司）；RIPA裂解液、3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体和鼠源IgG抗体购自康为世纪生物科技有限公司。
1.1.3 主要仪器设备
全自动血液分析仪（日本Sysmex XE 21000，Hysenmek）；全自动清洗旋转式锥板式全血黏度仪（北京宏润达科技发展有限公司）；超净台（山东博科生物产业有限公司）；实时荧光定量PCR仪和凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；多导睡眠检测仪（美国飞利浦Alex 6）。
1.2 方法
1.2.1 基线观察指标
对参与者的性别、年龄、体重指数（body mass index，BMI）进行采集和比较，对OSAHS患者的睡眠进行监测。睡眠监测采用便携式多导睡眠图检测仪，主要检测夜间连续的呼吸、动脉血氧饱和度、脑电图、心电图、心率等指标。PSG记录睡眠状态人体的多种电生理活动，如眼球运动波、脑电波、肌肉活动电波、呼吸动作等，综合分析以上活动，对睡眠质量和异常情况进行评估。监测前患者应避免剧烈运动，保持情绪稳定，监测当日白天尽量少睡，以保证夜间睡眠质量。
1.2.2 血样的采集与处理
所有受试者在入院次日或体检当日早晨7点，抽取肘前静脉血15 mL，其中10 mL置于肝素抗凝试管中，另外5 mL加入乙二胺四乙酸抗凝管中用于分离细胞。5 mL的血浆送至青海大学附属医院检验科用全自动血液分析仪进行血常规检测，测定受试者静脉血中红细胞计数、血红蛋白的含量及红细胞比容。另外5 mL血浆采用全自动清洗旋转式锥板式全血黏度仪检测血样的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血浆黏度比和红细胞聚集指数。
1.2.3 受试者外周血单个核细胞的分离
将乙二胺四乙酸抗凝管中的血液，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，–80 ℃保存备用。
1.2.4 RNA提取及RT-qPCR检测受试者外周血单个核细胞中PI3K、AKT、NF-κB p65、HIF-1α和HIF-2α mRNA水平
使用TRIzol试剂提取外周血单个核细胞总RNA，操作过程严格按照制造商的说明书进行。测定总RNA浓度，通过反转录合成cDNA，将其作为模板进行RT-qPCR。反转录条件为：95 ℃预变性1 min；94 ℃变性1 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，总共35个循环。以GAPDH作为内参，采用2–△△Ct法对结果进行计算。引物序列见表1。
表1
引物序列
1.2.5 蛋白免疫印迹检测外周血单个核细胞中PI3K、AKT、NF-κB p65、HIF-1α和HIF-2α的蛋白水平
采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达水平。使用RIPA裂解液提取外周血单个核细胞的总蛋白，通过BCA试剂盒测定蛋白浓度。等量蛋白经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将其转移到PVDF膜上，随后用5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，分别用相应的抗PI3K（稀释比1∶400）、抗AKT（稀释比1∶300）、抗NF-κB p65（稀释比1∶400）、抗HIF-1α（稀释比1∶300）、抗HIF-2α（稀释比1∶300）抗体4 ℃孵育过夜，用含吐温20的Tris盐缓冲液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）漂洗之后，与HRP标记的IgG抗体（稀释比1∶1000）室温孵育1 h。TBST漂洗，ECL显影液显影。基于每种蛋白质与GAPDH的灰度比，使用Image J软件进行蛋白质定量分析。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件。符合正态分布的计量数据均用均数±标准差（
±s）表示。两组间比较采用独立样本 t 检验，三组及三组以上比较采用ANOVA方差分析，随后采用Tukey-Kramer校正进行多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人的基本资料比较
由表2可见本调查中藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人性别和年龄的基本情况：H-OSAHS组的BMI与H-HP组相比差异无统计学意义（P>0.05），H-OSAHS组的BMI与T-OSAHS组相比差异无统计学意义（P>0.05）。
表2
四组受试者基本情况［例/（
）］
2.2 藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人的血液指标比较
藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人血液中的红细胞数目差异均不显著（P>0.05）。与藏族健康人相比，藏族OSAHS患者血液中的血红蛋白含量显著增加（P<0.05）；与汉族健康人相比，汉族OSAHS患者血液中的血红蛋白含量显著增加（P<0.05）；与藏族OSAHS患者相比，汉族OSAHS患者血液中的血红蛋白含量无显著改变（P>0.05）。结果见表3。
表3
各组血液指标比较（
）
2.3 藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人血液流变学指标的比较
与藏族健康人相比，藏族OSAHS患者的全血黏度高剪切率（图1a）、全血黏度低剪切率（图1b）、血浆黏度比（图1c）、红细胞聚集指数（图1d）和红细胞比容（图1e）均显著增加（均 P<0.05），且汉族OSAHS患者的上述血液流变学指标均显著高于汉族健康人（均 P<0.05）。但是，与藏族OSAHS患者相比，汉族OSAHS患者的上述5种血液流变学指标均显著降低（均 P<0.05）。
图1
四组受试者的血液流变学指标比较
a. 全血黏度高剪切率；b. 全血黏度低剪切率；c. 血浆黏度比；d. 红细胞聚集指数；e. 红细胞比容。与T-HP组比较，*
2.4 藏、汉族OSAHS患者血红蛋白与血流变指标的相关性关系
藏族OSAHS患者和汉族OSAHS患者血红蛋白与全血黏度高剪切率和红细胞聚集指数均呈正相关性（P<0.05），而与全血黏度剪切率、血浆黏度比和红细胞比容均无显著相关性（P>0.05）。结果见表4。
表4
藏族和汉族OSAHS患者血红蛋白与血液流变学指标的相关性
2.5 藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人外周血单个核细胞中基因mRNA水平的比较
藏族OSAHS患者外周血单个核细胞中PI3K（图2a）、AKT（图2b）、NF-κB p65（图2c）和HIF-1α（图2d）水平显著高于藏族健康人（均 P<0.05），而HIF-2α（图2e）的mRNA水平显著低于藏族健康人（P<0.05）。汉族OSAHS患者的外周血单个核细胞中PI3K、AKT、NF-κB p65和HIF-1α基因的mRNA水平显著高于汉族健康人（均 P<0.05），而HIF-2α的mRNA水平显著低于汉族健康人（P<0.05）。另外，与藏族OSAHS患者相比，汉族OSAHS患者外周血单个核细胞中PI3K、AKT、NF-κB p65和HIF-1α基因的mRNA水平显著降低（均 P<0.05），而HIF-2α的mRNA水平显著增加（均 P<0.05）。
图2
四组受试者外周血单个核细胞基因mRNA水平比较
a. PI3K；b. AKT；c. NF-κB p65；d. HIF-1α；e. HIF-2α。与T-HP组比较，*
2.6 藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人外周血单个核细胞中基因蛋白水平的比较
藏族OSAHS患者外周血单个核细胞中PI3K（图3a）、p-AKT（图3b）、NF-κB p65（图3c）和HIF-1α（图3d）的蛋白水平显著高于藏族健康人（均P<0.05），而藏族OSAHS患者外周血单个核细胞中HIF-2α（图3e）的蛋白水平显著低于藏族健康人（P<0.05）。与汉族健康人相比，汉族OSAHS患者的外周血单个核细胞中PI3K、p-AKT、NF-κB p65和HIF-1α蛋白表达量显著增加（P<0.05），而汉族OSAHS患者的外周血单个核细胞中HIF-2α的蛋白表达量显著减少（P<0.05）。此外，藏族OSAHS患者的外周血单个核细胞中PI3K、p-AKT、NF-κB p65和HIF-1α的蛋白表达量显著高于汉族OSAHS患者（P<0.05），而HIF-2α的蛋白表达量显著低于汉族OSAHS患者（P<0.05）。
图3
四组受试者外周血单个核细胞蛋白水平比较
a. PI3K；b. p-AKT/t-AKT；c. NF-κB p65；d. HIF-1α；e. HIF-2α。与T-HP组比较，*
2.7 藏、汉族OSAHS患者外周血单个核细胞中HIF-1α/2α的蛋白表达与血液流变学的相关性
藏、汉族OSAHS患者外周血单个核细胞中HIF-1α的蛋白表达与全血黏度高剪切率、血浆黏度比、红细胞聚集指数和血红蛋白含量呈正相关（P<0.05），而与红细胞计数呈负相关（P<0.05）。但是，藏、汉族OSAHS患者外周血单个核细胞中HIF-1α的蛋白表达与全血黏度低剪切率和红细胞比容无显著相关性（P>0.05）。结果见表5。藏、汉族OSAHS患者外周血单个核细胞中HIF-2α的蛋白表达与上述这7种指标均无显著相关性（P>0.05）。结果见表6。
表5
OSAHS组中HIF-1α蛋白表达与血液流变学的相关性
表6
OSAHS组中HIF-2α蛋白表达与血液流变学的相关性
3 讨论
我们的研究结果表明，藏族重度OSAHS患者的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血浆黏度比、红细胞聚集指数、红细胞比容均显著高于藏族健康人，且汉族重度OSAHS患者的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血浆黏度比、红细胞聚集指数、红细胞比容均显著高于汉族健康人。此外，研究结果证明OSAHS患者外周血单个核细胞中HIF-1α的mRNA和蛋白水平上调，HIF-2α的mRNA和蛋白水平下调。
OSAHS易并发各种心脑血管和代谢疾病。病理生理学上，该病的特征是反复完全或部分上气道塌陷，导致气流中断和睡眠中持续吸气。尽管呼吸压力增加，但上气道塌陷会导致阻塞性低通气或呼吸暂停，通过即时和长期机制影响睡眠结构和全身。OSAHS患者血浆黏度和纤维蛋白原的升高以及早晨血小板聚集的普遍增加可能是导致心血管事件发生率增加的原因[11]。血管系统中的血流模式和血流动力不均匀，高切应力可上调抗动脉粥样硬化的基因，而低切应力不均匀和不规则的血液分布诱导了促进内皮异常和动脉粥样硬化的基因[11]。本研究中，我们发现OSAHS患者全血中的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血浆黏度比均增加。血液黏度增高会引起血流阻力增加，使血流速度减慢，最后导致血流停滞，直接影响脏器血液供应，导致疾病。全血黏度增加，可引起巨球蛋白血症、先天性高纤维蛋白血症等血浆蛋白异常疾病，也可造成血细胞聚集性增加、膜的流动性和稳定性下降引起血液在流动时阻力增加。血液的流动性与血液的粘滞性有关，影响血液黏度的因素众多，红细胞比容是影响血液黏度最主要的因素，红细胞比容越高血液黏度越大[12]。红细胞聚集性增高，多见于红细胞膜的性质结构异常性疾病如高血压、冠心病、糖尿病等，可导致低剪切率下血液黏度增高。OSAHS引发血液流变学指标改变的机制可能主要有两点：由于夜间反复低通气或者呼吸暂停导致缺氧，促红细胞生成素生成增多，引起血液中红细胞增多，全血黏度增加；夜间缺氧刺激交感神经兴奋升高，排汗、排尿以及呼吸频率增多，引起血液黏度增加[13]。
HIF蛋白家族由α和β亚单位组成，通过形成异二聚体发挥作用。HIF-1α和HIF-2α两种主要亚型介导了所有细胞对缺氧的反应[14-15]。先前研究报道间歇性缺氧后HIF-1α表达增加[16]，HIF靶基因表达增加，包括糖酵解、缺氧途径和细胞外基质重塑[17]。这些基因的表达作为一个“缺氧”信号，与更坏的预后相关。本研究结果表明藏族OSAHS患者HIF-1α的mRNA和蛋白表达量显著高于藏族健康人和汉族OSAHS患者，汉族OSAHS患者HIF-1α的mRNA和蛋白表达量显著低于汉族健康人；同时，藏族OSAHS患者的HIF-2α的mRNA和蛋白表达量显著低于藏族健康人和汉族OSAHS患者，汉族OSAHS患者的HIF-2α的mRNA和蛋白表达量显著低于藏族OSAHS患者。这与先前报道结果相一致[3]。在慢性间歇低氧的大鼠动物模型中，HIF-1α的蛋白水平和转录活性显著增加，HIF-2α的表达下降[18]。而HIF-1α受主要炎症反应性转录因子NF-κB的调节[19-20]，在缺乏NF-κB的情况下，HIF-1α基因不能有效转录，因此即使长时间暴露于缺氧环境中，也看不到稳定或活性。研究发现OSAHS患者通过激活NF-κB炎症信号通路发挥作用[18]。缺氧大鼠脑内HIF-1α、NF-κB的mRNA表达明显上调，并可出现明显的脑病，表现为胞浆嗜酸性、空泡形成和脑充血的致密神经元[18]。NF-κB通过HIF-1α的转录调控将先天免疫与缺氧反应联系起来。在缺血过程中，营养物质和氧气向受损组织的流动减少，HIF-1α激活诱导恢复血液供应、营养和能量生产的基因，从而维持组织的完整性和稳态[21]。研究表明，间歇性缺氧增加颈动脉球中HIF-1α蛋白表达量，并降低HIF-2α蛋白表达量[22-23]。间歇性缺氧降低HIF-2α的表达是由于依赖性钙蛋白酶增加蛋白质降解[22, 24]，而钙蛋白酶对HIF-2α的降解涉及HIF-2α蛋白的C端部分[24]。
综上所述，本研究发现OSAHS患者的外周血单个核细胞中NF-κB p65依赖的炎症通路被激活，上调HIF-1α的基因和蛋白表达量，同时下调HIF-2α的基因和蛋白表达量，且藏族OSAHS患者的血液流变学指标的含量均大于汉族OSAHS患者。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是一种常见的慢性病，临床表现为夜间打鼾、白天嗜睡、认知功能衰退等[1]。男性OSAHS患病率为2%～4%，女性患病率为1%～2%。研究发现世代居住在高原的藏族在氧的摄取、运输与利用方面明显优于汉族[2]，在呼吸暂停低通气指数（apnea-hypopnea index，AHI）相近的情况下，藏族中重度OSAHS患者睡眠时平均血氧饱和度和睡眠期最低血氧饱和度明显低于汉族[3]。OSAHS易导致心血管疾病以及代谢性疾病，是缺血性脑卒中[4]、冠状动脉粥样硬化性心脏病[5]、肺动脉栓塞[6]等血栓性疾病的独立危险因素。间歇性缺氧是OSAHS的标志性表现，低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/低氧诱导因子2α（hypoxia-inducible factor-2α，HIF-2α）是调节间歇性缺氧的关键基因，也是目前临床上较为认可的OSAHS的诊断标志物[7-8]，其上游的PI3K/AKT/NF-κB p65是参与多种慢性炎症疾病病理的重要通路，其中包括OSAHS[9]。本研究拟探讨藏族和汉族OSAHS患者血液流变学以及血液代谢中HIF-1α/2α表达水平的差异性。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 临床资料
纳入2017年1月—2019年12月在青海大学附属医院经多导睡眠图（polysomnography，PSG）确诊的藏族OSAHS患者（简称T-OSAHS组）、汉族OSAHS患者（简称H-OSAHS组），以及接受体检的藏族健康人（简称T-HP组）、汉族健康人（简称H-HP组），每组30例。AHI是每小时睡眠中呼吸暂停和低通气的总和，已被广泛用作OSAHS的诊断和评估标准[10]。本研究中健康人的AHI<5次/h，重度OSAHS患者的AHI>20次/h。OSAHS诊断标准参照我国2009年制定的《阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊断和外科治疗指南》及美国睡眠医学会2009年制定的《成人阻塞性睡眠呼吸暂停评价、管理与长期治疗临床指南》。藏族受试者纳入标准：（1）长期生活于海拔2260 m至少3年的藏族人；（2）家人3代以内与其他民族均未通婚。排除标准：（1）有其他睡眠障碍［国际睡眠障碍分类（ICSD-II）诊断］或接受过与睡眠有关的呼吸障碍治疗的病史；（2）合并有冠状动脉粥样硬化性心脏病、肺血栓栓塞症、深静脉血栓形成、缺血性脑卒中、近期有感染、手术或创伤的患者；（3）怀孕或者哺乳期的女性。该研究得到了青海大学附属医院医学伦理委员会和生物安全管理委员会的审查和批准（AF-RHEC-0062-01号）。所有参与者均签署知情同意书并积极配合该项研究。
1.1.2 试剂
TRIzol、逆转录试剂盒、实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）试剂均购自大连Takara公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；人外周血单核细胞分离液试剂盒购自上海研谨生物科技公司；一抗兔抗磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K；ab32089，英国Abcam公司）；一抗兔抗丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT；ab38449，英国Abcam公司）；一抗兔抗核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65抗体（ab32536，英国Abcam公司）；一抗兔抗HIF-1α抗体（ab51608，英国Abcam公司）；一抗兔抗HIF-2α抗体（ab109616，英国Abcam公司）；二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab205718，英国Abcam公司）；RIPA裂解液、3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体和鼠源IgG抗体购自康为世纪生物科技有限公司。
1.1.3 主要仪器设备
全自动血液分析仪（日本Sysmex XE 21000，Hysenmek）；全自动清洗旋转式锥板式全血黏度仪（北京宏润达科技发展有限公司）；超净台（山东博科生物产业有限公司）；实时荧光定量PCR仪和凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；多导睡眠检测仪（美国飞利浦Alex 6）。
1.2 方法
1.2.1 基线观察指标
对参与者的性别、年龄、体重指数（body mass index，BMI）进行采集和比较，对OSAHS患者的睡眠进行监测。睡眠监测采用便携式多导睡眠图检测仪，主要检测夜间连续的呼吸、动脉血氧饱和度、脑电图、心电图、心率等指标。PSG记录睡眠状态人体的多种电生理活动，如眼球运动波、脑电波、肌肉活动电波、呼吸动作等，综合分析以上活动，对睡眠质量和异常情况进行评估。监测前患者应避免剧烈运动，保持情绪稳定，监测当日白天尽量少睡，以保证夜间睡眠质量。
1.2.2 血样的采集与处理
所有受试者在入院次日或体检当日早晨7点，抽取肘前静脉血15 mL，其中10 mL置于肝素抗凝试管中，另外5 mL加入乙二胺四乙酸抗凝管中用于分离细胞。5 mL的血浆送至青海大学附属医院检验科用全自动血液分析仪进行血常规检测，测定受试者静脉血中红细胞计数、血红蛋白的含量及红细胞比容。另外5 mL血浆采用全自动清洗旋转式锥板式全血黏度仪检测血样的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血浆黏度比和红细胞聚集指数。
1.2.3 受试者外周血单个核细胞的分离
将乙二胺四乙酸抗凝管中的血液，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，–80 ℃保存备用。
1.2.4 RNA提取及RT-qPCR检测受试者外周血单个核细胞中PI3K、AKT、NF-κB p65、HIF-1α和HIF-2α mRNA水平
使用TRIzol试剂提取外周血单个核细胞总RNA，操作过程严格按照制造商的说明书进行。测定总RNA浓度，通过反转录合成cDNA，将其作为模板进行RT-qPCR。反转录条件为：95 ℃预变性1 min；94 ℃变性1 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，总共35个循环。以GAPDH作为内参，采用2–△△Ct法对结果进行计算。引物序列见表1。
表1
引物序列
1.2.5 蛋白免疫印迹检测外周血单个核细胞中PI3K、AKT、NF-κB p65、HIF-1α和HIF-2α的蛋白水平
采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达水平。使用RIPA裂解液提取外周血单个核细胞的总蛋白，通过BCA试剂盒测定蛋白浓度。等量蛋白经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将其转移到PVDF膜上，随后用5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，分别用相应的抗PI3K（稀释比1∶400）、抗AKT（稀释比1∶300）、抗NF-κB p65（稀释比1∶400）、抗HIF-1α（稀释比1∶300）、抗HIF-2α（稀释比1∶300）抗体4 ℃孵育过夜，用含吐温20的Tris盐缓冲液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）漂洗之后，与HRP标记的IgG抗体（稀释比1∶1000）室温孵育1 h。TBST漂洗，ECL显影液显影。基于每种蛋白质与GAPDH的灰度比，使用Image J软件进行蛋白质定量分析。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件。符合正态分布的计量数据均用均数±标准差（±s）表示。两组间比较采用独立样本 t 检验，三组及三组以上比较采用ANOVA方差分析，随后采用Tukey-Kramer校正进行多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人的基本资料比较
由表2可见本调查中藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人性别和年龄的基本情况：H-OSAHS组的BMI与H-HP组相比差异无统计学意义（P>0.05），H-OSAHS组的BMI与T-OSAHS组相比差异无统计学意义（P>0.05）。
表2
四组受试者基本情况［例/（）］
2.2 藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人的血液指标比较
藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人血液中的红细胞数目差异均不显著（P>0.05）。与藏族健康人相比，藏族OSAHS患者血液中的血红蛋白含量显著增加（P<0.05）；与汉族健康人相比，汉族OSAHS患者血液中的血红蛋白含量显著增加（P<0.05）；与藏族OSAHS患者相比，汉族OSAHS患者血液中的血红蛋白含量无显著改变（P>0.05）。结果见表3。
表3
各组血液指标比较（）
2.3 藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人血液流变学指标的比较
与藏族健康人相比，藏族OSAHS患者的全血黏度高剪切率（图1a）、全血黏度低剪切率（图1b）、血浆黏度比（图1c）、红细胞聚集指数（图1d）和红细胞比容（图1e）均显著增加（均 P<0.05），且汉族OSAHS患者的上述血液流变学指标均显著高于汉族健康人（均 P<0.05）。但是，与藏族OSAHS患者相比，汉族OSAHS患者的上述5种血液流变学指标均显著降低（均 P<0.05）。
图1
四组受试者的血液流变学指标比较
a. 全血黏度高剪切率；b. 全血黏度低剪切率；c. 血浆黏度比；d. 红细胞聚集指数；e. 红细胞比容。与T-HP组比较，*
2.4 藏、汉族OSAHS患者血红蛋白与血流变指标的相关性关系
藏族OSAHS患者和汉族OSAHS患者血红蛋白与全血黏度高剪切率和红细胞聚集指数均呈正相关性（P<0.05），而与全血黏度剪切率、血浆黏度比和红细胞比容均无显著相关性（P>0.05）。结果见表4。
表4
藏族和汉族OSAHS患者血红蛋白与血液流变学指标的相关性
2.5 藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人外周血单个核细胞中基因mRNA水平的比较
藏族OSAHS患者外周血单个核细胞中PI3K（图2a）、AKT（图2b）、NF-κB p65（图2c）和HIF-1α（图2d）水平显著高于藏族健康人（均 P<0.05），而HIF-2α（图2e）的mRNA水平显著低于藏族健康人（P<0.05）。汉族OSAHS患者的外周血单个核细胞中PI3K、AKT、NF-κB p65和HIF-1α基因的mRNA水平显著高于汉族健康人（均 P<0.05），而HIF-2α的mRNA水平显著低于汉族健康人（P<0.05）。另外，与藏族OSAHS患者相比，汉族OSAHS患者外周血单个核细胞中PI3K、AKT、NF-κB p65和HIF-1α基因的mRNA水平显著降低（均 P<0.05），而HIF-2α的mRNA水平显著增加（均 P<0.05）。
图2
四组受试者外周血单个核细胞基因mRNA水平比较
a. PI3K；b. AKT；c. NF-κB p65；d. HIF-1α；e. HIF-2α。与T-HP组比较，*
2.6 藏、汉族OSAHS患者和藏、汉族健康人外周血单个核细胞中基因蛋白水平的比较
藏族OSAHS患者外周血单个核细胞中PI3K（图3a）、p-AKT（图3b）、NF-κB p65（图3c）和HIF-1α（图3d）的蛋白水平显著高于藏族健康人（均P<0.05），而藏族OSAHS患者外周血单个核细胞中HIF-2α（图3e）的蛋白水平显著低于藏族健康人（P<0.05）。与汉族健康人相比，汉族OSAHS患者的外周血单个核细胞中PI3K、p-AKT、NF-κB p65和HIF-1α蛋白表达量显著增加（P<0.05），而汉族OSAHS患者的外周血单个核细胞中HIF-2α的蛋白表达量显著减少（P<0.05）。此外，藏族OSAHS患者的外周血单个核细胞中PI3K、p-AKT、NF-κB p65和HIF-1α的蛋白表达量显著高于汉族OSAHS患者（P<0.05），而HIF-2α的蛋白表达量显著低于汉族OSAHS患者（P<0.05）。
图3
四组受试者外周血单个核细胞蛋白水平比较
a. PI3K；b. p-AKT/t-AKT；c. NF-κB p65；d. HIF-1α；e. HIF-2α。与T-HP组比较，*
2.7 藏、汉族OSAHS患者外周血单个核细胞中HIF-1α/2α的蛋白表达与血液流变学的相关性
藏、汉族OSAHS患者外周血单个核细胞中HIF-1α的蛋白表达与全血黏度高剪切率、血浆黏度比、红细胞聚集指数和血红蛋白含量呈正相关（P<0.05），而与红细胞计数呈负相关（P<0.05）。但是，藏、汉族OSAHS患者外周血单个核细胞中HIF-1α的蛋白表达与全血黏度低剪切率和红细胞比容无显著相关性（P>0.05）。结果见表5。藏、汉族OSAHS患者外周血单个核细胞中HIF-2α的蛋白表达与上述这7种指标均无显著相关性（P>0.05）。结果见表6。
表5
OSAHS组中HIF-1α蛋白表达与血液流变学的相关性
表6
OSAHS组中HIF-2α蛋白表达与血液流变学的相关性
3 讨论
我们的研究结果表明，藏族重度OSAHS患者的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血浆黏度比、红细胞聚集指数、红细胞比容均显著高于藏族健康人，且汉族重度OSAHS患者的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血浆黏度比、红细胞聚集指数、红细胞比容均显著高于汉族健康人。此外，研究结果证明OSAHS患者外周血单个核细胞中HIF-1α的mRNA和蛋白水平上调，HIF-2α的mRNA和蛋白水平下调。
OSAHS易并发各种心脑血管和代谢疾病。病理生理学上，该病的特征是反复完全或部分上气道塌陷，导致气流中断和睡眠中持续吸气。尽管呼吸压力增加，但上气道塌陷会导致阻塞性低通气或呼吸暂停，通过即时和长期机制影响睡眠结构和全身。OSAHS患者血浆黏度和纤维蛋白原的升高以及早晨血小板聚集的普遍增加可能是导致心血管事件发生率增加的原因[11]。血管系统中的血流模式和血流动力不均匀，高切应力可上调抗动脉粥样硬化的基因，而低切应力不均匀和不规则的血液分布诱导了促进内皮异常和动脉粥样硬化的基因[11]。本研究中，我们发现OSAHS患者全血中的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血浆黏度比均增加。血液黏度增高会引起血流阻力增加，使血流速度减慢，最后导致血流停滞，直接影响脏器血液供应，导致疾病。全血黏度增加，可引起巨球蛋白血症、先天性高纤维蛋白血症等血浆蛋白异常疾病，也可造成血细胞聚集性增加、膜的流动性和稳定性下降引起血液在流动时阻力增加。血液的流动性与血液的粘滞性有关，影响血液黏度的因素众多，红细胞比容是影响血液黏度最主要的因素，红细胞比容越高血液黏度越大[12]。红细胞聚集性增高，多见于红细胞膜的性质结构异常性疾病如高血压、冠心病、糖尿病等，可导致低剪切率下血液黏度增高。OSAHS引发血液流变学指标改变的机制可能主要有两点：由于夜间反复低通气或者呼吸暂停导致缺氧，促红细胞生成素生成增多，引起血液中红细胞增多，全血黏度增加；夜间缺氧刺激交感神经兴奋升高，排汗、排尿以及呼吸频率增多，引起血液黏度增加[13]。
HIF蛋白家族由α和β亚单位组成，通过形成异二聚体发挥作用。HIF-1α和HIF-2α两种主要亚型介导了所有细胞对缺氧的反应[14-15]。先前研究报道间歇性缺氧后HIF-1α表达增加[16]，HIF靶基因表达增加，包括糖酵解、缺氧途径和细胞外基质重塑[17]。这些基因的表达作为一个“缺氧”信号，与更坏的预后相关。本研究结果表明藏族OSAHS患者HIF-1α的mRNA和蛋白表达量显著高于藏族健康人和汉族OSAHS患者，汉族OSAHS患者HIF-1α的mRNA和蛋白表达量显著低于汉族健康人；同时，藏族OSAHS患者的HIF-2α的mRNA和蛋白表达量显著低于藏族健康人和汉族OSAHS患者，汉族OSAHS患者的HIF-2α的mRNA和蛋白表达量显著低于藏族OSAHS患者。这与先前报道结果相一致[3]。在慢性间歇低氧的大鼠动物模型中，HIF-1α的蛋白水平和转录活性显著增加，HIF-2α的表达下降[18]。而HIF-1α受主要炎症反应性转录因子NF-κB的调节[19-20]，在缺乏NF-κB的情况下，HIF-1α基因不能有效转录，因此即使长时间暴露于缺氧环境中，也看不到稳定或活性。研究发现OSAHS患者通过激活NF-κB炎症信号通路发挥作用[18]。缺氧大鼠脑内HIF-1α、NF-κB的mRNA表达明显上调，并可出现明显的脑病，表现为胞浆嗜酸性、空泡形成和脑充血的致密神经元[18]。NF-κB通过HIF-1α的转录调控将先天免疫与缺氧反应联系起来。在缺血过程中，营养物质和氧气向受损组织的流动减少，HIF-1α激活诱导恢复血液供应、营养和能量生产的基因，从而维持组织的完整性和稳态[21]。研究表明，间歇性缺氧增加颈动脉球中HIF-1α蛋白表达量，并降低HIF-2α蛋白表达量[22-23]。间歇性缺氧降低HIF-2α的表达是由于依赖性钙蛋白酶增加蛋白质降解[22, 24]，而钙蛋白酶对HIF-2α的降解涉及HIF-2α蛋白的C端部分[24]。
综上所述，本研究发现OSAHS患者的外周血单个核细胞中NF-κB p65依赖的炎症通路被激活，上调HIF-1α的基因和蛋白表达量，同时下调HIF-2α的基因和蛋白表达量，且藏族OSAHS患者的血液流变学指标的含量均大于汉族OSAHS患者。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
