引用本文： 钟有清, 周向东, 李琪, 覃英娇. TLR5 rs5744174 基因多态性与肺炎链球菌肺炎的相关性. 中国呼吸与危重监护杂志, 2020, 19(4): 342-345. doi: 10.7507/1671-6205.201908050 复制
肺炎是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症，可由理化因素、免疫损伤、过敏及细菌、真菌、病毒、寄生虫等致病微生物等因素引起[1]。肺炎链球菌肺炎是肺炎的一种常见类型，也是最常见的感染性疾病，其发病率及病死率均较高，对儿童及老人健康的威胁极大[2]。研究表明，肺炎链球菌肺炎与肺组织炎症反应密切相关[3]。Toll 样受体（toll-like receptors，TLRs）是识别各种病原体及宿主细胞感染的一种跨膜蛋白，能够参与调控细菌及病毒的感染过程，在人体调控炎症反应中具有重要的作用。Cao 等[4]研究表明，TLR5 基因的多态性可能与乙肝病毒感染性相关的严重肝病的发展有关。然而 TLR5 基因的多态性是否与肺炎链球菌肺炎有关，目前尚鲜有报道。基于此，本研究通过分析 TLR5 rs5744174 基因多态性，以期探讨其与肺炎链球菌肺炎的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取 2014 年 1 月至 2018 年 10 月本院收治的 106 例肺炎链球菌肺炎患者为观察组研究对象，其中男 61 例，女 45 例，年龄 40～75 岁，平均年龄（64.0±15.3）岁。纳入标准：（1）符合肺炎链球菌肺炎诊断标准[5]；（2）经临床、实验室检查等确诊为肺炎链球菌肺炎；（3）患者均已签署知情同意书。排除标准：（1）伴有免疫缺陷或自身免疫性疾病；（2）伴有恶性肿瘤疾病患者；（3）伴有呼吸道结构异常患者；（4）伴有肺纤维化、哮喘疾病患者；（5）原发性纤毛运动障碍、脓毒症等其他器官严重疾病患者。
同期选取在本院参与体检的 85 例正常人作为对照组研究对象，男 47 例，女 38 例，年龄 40～69 岁，平均年龄（58.2±14.3）岁。两组受试者性别、体重指数（body mass index，BMI）、高血压、高血脂、冠心病等一般资料相比，差异无统计学意义（均P>0.05）。
1.2 方法
1.2.1 临床资料的收集
分别于肺炎链球菌肺炎患者入院当天及健康体检者体检当日收集受试者的临床资料，包括性别、年龄、BMI、吸烟、嗜酒、高血压、高血脂、糖尿病、冠心病等。
1.2.2 基因组 DNA 提取
分别抽取受试者肘静脉血 2 mL 于乙二胺四乙酸抗凝管中，采用 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA，提取过程严格按照试剂盒说明书进行，DNA 提取试剂盒购自北京纽朴生物技术有限公司。
1.2.3 DNA 分离与基因分型
通过 PCR 测序，确定 TLR5 rs5744174 的基因型，引物由 Program Primer 5 和 NCBI 数据库设计，并由上海生工生物工程有限公司合成。TLR5 rs5744174 引物序列：上游 5’-CCCCTTCAGAGAATCCCAGC-3’，下游引物 5’-ACCTGGGGATGGTCCTTGAAC-3’。反应体系 50 μL，反应条件：95 ℃ 2 min 扩增，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，共 42 个循环；最后 72 ℃ 5 min 延伸。最后根据测序结果的峰值数据确定单核苷酸多态性。
1.2.4 支气管肺泡灌洗液的采集
观察组患者分别于病变肺段快速注入灭菌后的生理盐水，每次灌洗量 20～50 mL，共灌洗 3 次，通过 25～100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）负压将第二次的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）吸引至无菌管中，BALF 立即进行检测或及时保存于冰盒中，及时待检。
1.2.5 BALF 中细胞分类计数及 C 反应蛋白水平检测
将 BALF 充分混匀后，在离心机上离心 10 min（4 ℃，1200 r/min），取上清液检测 C 反应蛋白（C reactive protein，CRP）的水平，检测试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司，检测步骤参见试剂盒说明书。取离心后的细胞沉淀成分，用不含 Ca2+、Ma2+ 的 Hank’s 液冲洗，并离心 2 次，弃去上清后，加 Hank’s 液 1 mL 制成细胞悬液。取 200 μL 细胞悬液于 1.5 mL 离心管中，加入 20 μL 台盼蓝染色 3 min，染色结束后，在 Countstar 计数板上计白细胞总数，细胞经瑞氏染色后涂片，并置于光学显微镜下进行计数，每张涂片均随机选择 3 个视野，每个视野随机选择 100 个细胞，分别统计并计算中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的百分比。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 21.0 进行数据分析。计量资料先进行正态分布检验，符合正态分布，采用均数±标准差（
±s）进行描述。进行方差齐性检验，若方差齐，两组数据的组间比较采用 t 检验，多组数据比较采用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
观察组与对照组性别、BMI、高血压、高血脂、冠心病比例相比，差异无统计学意义（均 P>0.05）；观察组与对照组年龄、吸烟、嗜酒、糖尿病比例相比，差异有统计学意义（均 P<0.05）。结果见表 1。
表1
观察组与对照组一般资料（
）
2.2 TLR5 rs5744174 基因型和等位基因频率比较
观察组与对照组 TLR5 rs5744174 基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律检验水准（观察组 χ2=16.89，对照组 χ2=10.76，P>0.05），观察组与对照组 TLR5 rs5744174（C<T）基因型及等位基因分布频率相比，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表 2。
表2
TLR5 rs5744174 基因型和等位基因频率比较
2.3 TLR5 rs5744174 各基因型间临床资料比较
肺炎链球菌肺炎患者三种基因型间性别、年龄、吸烟、嗜酒、高血压、高血脂、冠心病等临床资料相比较，差异无统计学意义（均P>0.05）；糖尿病比例相比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表 3。
表3
TLR5 rs5744174 各基因型间临床资料比较（
）
2.4 TLR5 rs5744174 各基因型间 BALF 指标比较
肺炎链球菌肺炎患者三种基因型间 BALF 中中性粒细胞百分比、CRP 水平相比较，差异有统计学意义（均 P<0.05）；白细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、巨噬细胞百分比水平相比，差异无统计学意义（均 P>0.05）。结果见表 4。
表4
TLR5 rs5744174 各基因型间 BALF 指标比较（
）
3 讨论
肺炎链球菌为革兰阳性球菌，是人类呼吸道的主要致病菌，是导致中耳炎、肺炎、脑膜炎及菌血症的主要原因。肺炎链球菌可在呼吸道自体转移，当机体抵抗力降低或机体免疫功能受损时，有毒力的肺炎链球菌可进入组织、血液，进而导致感染的发生[6]。其中肺炎链球菌肺炎在儿童及老人中发病率较高，是临床威胁人类健康的重要传染性疾病之一[7]。研究表明，不同基因背景可能影响肺炎患者炎症的反应强度[8]。然而，目前肺炎链球菌肺炎的发病机制尚未明确，与宿主遗传因素的关系仍有待探究。
TLRs 基因是是一类跨膜受体，通过对病原体相关分子模式的识别及信号级联反应，可启动激活信号转导途径，介导机体的天然免疫和获得性免疫，诱导免疫效应分子表达[9]。目前研究较多的 TLRs 是 TLR2、TLR4 与 TLR5。TLR5 作为 TLRs 中的一员，主要通过革兰阳/阴性菌的菌毛结合蛋白识别，激活免疫信号通路，在菌毛蛋白识别中具有重要作用[10]。王伟等[11]研究表明，TLR5 rs5744174 的基因型频率在卒中风痰瘀阻证患者与健康对照组之间的分布差异有统计学意义。龚爱媚等[12]研究表明广西人抗中性粒细胞胞浆抗体相关性小血管炎与健康对照组中 TLR5 rs2072493 基因型（AA、AG、GG）及等位基因频率相比，差异无统计学意义。本研究结果显示，观察组与对照组 TLR5 rs5744174 基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律检验水准，观察组与对照组 TLR5 rs5744174（C<T）基因型及等位基因分布频率差异无统计学意义，提示 TLR5 rs5744174 基因型可能与肺炎链球菌肺炎的发生无关。进一步研究结果显示，肺炎链球菌肺炎患者三种基因型（CC、CT、TT）间合并糖尿病比例差异有统计学意义，提示肺炎链球菌肺炎患者并发糖尿病可能与 T 等位基因的存在有一定关系。
肺炎链球菌感染后，通常可产生大量的炎症细胞因子及免疫介质，导致免疫功能发生紊乱[13]。本研究结果显示，三种基因型（CC、CT、TT）肺炎链球菌肺炎患者 BALF 中中性粒细胞百分比、CRP 水平差异有统计学意义。BALF 中含有炎症因子与免疫细胞，其中中性粒细胞是 BALF 白细胞中的一种，与感染有关[14]。CRP 是肺炎链球菌细胞壁 C 多糖蛋白，是一种典型的急性时相期蛋白，也是介导炎症反应发生的最重要的炎性分子，可作为反映肺炎链球菌肺炎患者炎症状态的标志物[15]。以上结果提示 TLR5 rs5744174 基因多态性可能与肺炎链球菌肺炎患者体内炎症程度有关。
综上所述，TLR5 rs5744174 基因多态性与肺炎链球菌肺炎的发生可能无关，但 TLR5 rs5744174 基因多态性与合并糖尿病发生、BALF 中中性粒细胞百分比、CRP 等水平有关，可能影响链球菌肺炎患者疾病转归情况。然而本研究样本数量较少，下一步准备扩大样本容量，进一步就 TLR5 相关多态性位点及其与肺炎链球菌易感性的关系进行深入研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
肺炎是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症，可由理化因素、免疫损伤、过敏及细菌、真菌、病毒、寄生虫等致病微生物等因素引起[1]。肺炎链球菌肺炎是肺炎的一种常见类型，也是最常见的感染性疾病，其发病率及病死率均较高，对儿童及老人健康的威胁极大[2]。研究表明，肺炎链球菌肺炎与肺组织炎症反应密切相关[3]。Toll 样受体（toll-like receptors，TLRs）是识别各种病原体及宿主细胞感染的一种跨膜蛋白，能够参与调控细菌及病毒的感染过程，在人体调控炎症反应中具有重要的作用。Cao 等[4]研究表明，TLR5 基因的多态性可能与乙肝病毒感染性相关的严重肝病的发展有关。然而 TLR5 基因的多态性是否与肺炎链球菌肺炎有关，目前尚鲜有报道。基于此，本研究通过分析 TLR5 rs5744174 基因多态性，以期探讨其与肺炎链球菌肺炎的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取 2014 年 1 月至 2018 年 10 月本院收治的 106 例肺炎链球菌肺炎患者为观察组研究对象，其中男 61 例，女 45 例，年龄 40～75 岁，平均年龄（64.0±15.3）岁。纳入标准：（1）符合肺炎链球菌肺炎诊断标准[5]；（2）经临床、实验室检查等确诊为肺炎链球菌肺炎；（3）患者均已签署知情同意书。排除标准：（1）伴有免疫缺陷或自身免疫性疾病；（2）伴有恶性肿瘤疾病患者；（3）伴有呼吸道结构异常患者；（4）伴有肺纤维化、哮喘疾病患者；（5）原发性纤毛运动障碍、脓毒症等其他器官严重疾病患者。
同期选取在本院参与体检的 85 例正常人作为对照组研究对象，男 47 例，女 38 例，年龄 40～69 岁，平均年龄（58.2±14.3）岁。两组受试者性别、体重指数（body mass index，BMI）、高血压、高血脂、冠心病等一般资料相比，差异无统计学意义（均P>0.05）。
1.2 方法
1.2.1 临床资料的收集
分别于肺炎链球菌肺炎患者入院当天及健康体检者体检当日收集受试者的临床资料，包括性别、年龄、BMI、吸烟、嗜酒、高血压、高血脂、糖尿病、冠心病等。
1.2.2 基因组 DNA 提取
分别抽取受试者肘静脉血 2 mL 于乙二胺四乙酸抗凝管中，采用 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA，提取过程严格按照试剂盒说明书进行，DNA 提取试剂盒购自北京纽朴生物技术有限公司。
1.2.3 DNA 分离与基因分型
通过 PCR 测序，确定 TLR5 rs5744174 的基因型，引物由 Program Primer 5 和 NCBI 数据库设计，并由上海生工生物工程有限公司合成。TLR5 rs5744174 引物序列：上游 5’-CCCCTTCAGAGAATCCCAGC-3’，下游引物 5’-ACCTGGGGATGGTCCTTGAAC-3’。反应体系 50 μL，反应条件：95 ℃ 2 min 扩增，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，共 42 个循环；最后 72 ℃ 5 min 延伸。最后根据测序结果的峰值数据确定单核苷酸多态性。
1.2.4 支气管肺泡灌洗液的采集
观察组患者分别于病变肺段快速注入灭菌后的生理盐水，每次灌洗量 20～50 mL，共灌洗 3 次，通过 25～100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）负压将第二次的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）吸引至无菌管中，BALF 立即进行检测或及时保存于冰盒中，及时待检。
1.2.5 BALF 中细胞分类计数及 C 反应蛋白水平检测
将 BALF 充分混匀后，在离心机上离心 10 min（4 ℃，1200 r/min），取上清液检测 C 反应蛋白（C reactive protein，CRP）的水平，检测试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司，检测步骤参见试剂盒说明书。取离心后的细胞沉淀成分，用不含 Ca2+、Ma2+ 的 Hank’s 液冲洗，并离心 2 次，弃去上清后，加 Hank’s 液 1 mL 制成细胞悬液。取 200 μL 细胞悬液于 1.5 mL 离心管中，加入 20 μL 台盼蓝染色 3 min，染色结束后，在 Countstar 计数板上计白细胞总数，细胞经瑞氏染色后涂片，并置于光学显微镜下进行计数，每张涂片均随机选择 3 个视野，每个视野随机选择 100 个细胞，分别统计并计算中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的百分比。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 21.0 进行数据分析。计量资料先进行正态分布检验，符合正态分布，采用均数±标准差（±s）进行描述。进行方差齐性检验，若方差齐，两组数据的组间比较采用 t 检验，多组数据比较采用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
观察组与对照组性别、BMI、高血压、高血脂、冠心病比例相比，差异无统计学意义（均 P>0.05）；观察组与对照组年龄、吸烟、嗜酒、糖尿病比例相比，差异有统计学意义（均 P<0.05）。结果见表 1。
表1
观察组与对照组一般资料（）
2.2 TLR5 rs5744174 基因型和等位基因频率比较
观察组与对照组 TLR5 rs5744174 基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律检验水准（观察组 χ2=16.89，对照组 χ2=10.76，P>0.05），观察组与对照组 TLR5 rs5744174（C<T）基因型及等位基因分布频率相比，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表 2。
表2
TLR5 rs5744174 基因型和等位基因频率比较
2.3 TLR5 rs5744174 各基因型间临床资料比较
肺炎链球菌肺炎患者三种基因型间性别、年龄、吸烟、嗜酒、高血压、高血脂、冠心病等临床资料相比较，差异无统计学意义（均P>0.05）；糖尿病比例相比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表 3。
表3
TLR5 rs5744174 各基因型间临床资料比较（）
2.4 TLR5 rs5744174 各基因型间 BALF 指标比较
肺炎链球菌肺炎患者三种基因型间 BALF 中中性粒细胞百分比、CRP 水平相比较，差异有统计学意义（均 P<0.05）；白细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、巨噬细胞百分比水平相比，差异无统计学意义（均 P>0.05）。结果见表 4。
表4
TLR5 rs5744174 各基因型间 BALF 指标比较（）
3 讨论
肺炎链球菌为革兰阳性球菌，是人类呼吸道的主要致病菌，是导致中耳炎、肺炎、脑膜炎及菌血症的主要原因。肺炎链球菌可在呼吸道自体转移，当机体抵抗力降低或机体免疫功能受损时，有毒力的肺炎链球菌可进入组织、血液，进而导致感染的发生[6]。其中肺炎链球菌肺炎在儿童及老人中发病率较高，是临床威胁人类健康的重要传染性疾病之一[7]。研究表明，不同基因背景可能影响肺炎患者炎症的反应强度[8]。然而，目前肺炎链球菌肺炎的发病机制尚未明确，与宿主遗传因素的关系仍有待探究。
TLRs 基因是是一类跨膜受体，通过对病原体相关分子模式的识别及信号级联反应，可启动激活信号转导途径，介导机体的天然免疫和获得性免疫，诱导免疫效应分子表达[9]。目前研究较多的 TLRs 是 TLR2、TLR4 与 TLR5。TLR5 作为 TLRs 中的一员，主要通过革兰阳/阴性菌的菌毛结合蛋白识别，激活免疫信号通路，在菌毛蛋白识别中具有重要作用[10]。王伟等[11]研究表明，TLR5 rs5744174 的基因型频率在卒中风痰瘀阻证患者与健康对照组之间的分布差异有统计学意义。龚爱媚等[12]研究表明广西人抗中性粒细胞胞浆抗体相关性小血管炎与健康对照组中 TLR5 rs2072493 基因型（AA、AG、GG）及等位基因频率相比，差异无统计学意义。本研究结果显示，观察组与对照组 TLR5 rs5744174 基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律检验水准，观察组与对照组 TLR5 rs5744174（C<T）基因型及等位基因分布频率差异无统计学意义，提示 TLR5 rs5744174 基因型可能与肺炎链球菌肺炎的发生无关。进一步研究结果显示，肺炎链球菌肺炎患者三种基因型（CC、CT、TT）间合并糖尿病比例差异有统计学意义，提示肺炎链球菌肺炎患者并发糖尿病可能与 T 等位基因的存在有一定关系。
肺炎链球菌感染后，通常可产生大量的炎症细胞因子及免疫介质，导致免疫功能发生紊乱[13]。本研究结果显示，三种基因型（CC、CT、TT）肺炎链球菌肺炎患者 BALF 中中性粒细胞百分比、CRP 水平差异有统计学意义。BALF 中含有炎症因子与免疫细胞，其中中性粒细胞是 BALF 白细胞中的一种，与感染有关[14]。CRP 是肺炎链球菌细胞壁 C 多糖蛋白，是一种典型的急性时相期蛋白，也是介导炎症反应发生的最重要的炎性分子，可作为反映肺炎链球菌肺炎患者炎症状态的标志物[15]。以上结果提示 TLR5 rs5744174 基因多态性可能与肺炎链球菌肺炎患者体内炎症程度有关。
综上所述，TLR5 rs5744174 基因多态性与肺炎链球菌肺炎的发生可能无关，但 TLR5 rs5744174 基因多态性与合并糖尿病发生、BALF 中中性粒细胞百分比、CRP 等水平有关，可能影响链球菌肺炎患者疾病转归情况。然而本研究样本数量较少，下一步准备扩大样本容量，进一步就 TLR5 相关多态性位点及其与肺炎链球菌易感性的关系进行深入研究。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
