引用本文： 杨伟源, 李理, 郑林鑫, 李伟峰. EGFR/Foxo3a/Snail1 通路在博来霉素肺纤维化小鼠中的作用机制探讨. 中国呼吸与危重监护杂志, 2020, 19(4): 371-378. doi: 10.7507/1671-6205.201904028 复制
特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）属于间质性肺疾病中的一种常见疾病类型，具有极高的病死率，其发病机制尚未明确，其中肺泡上皮细胞在反复的微小损伤后的异常修复被认为是其重要机制之一[1]。研究发现，在纤维化患者及博来霉素引起的小鼠肺纤维化模型中均发现上皮细胞损伤后的修复过程中伴有上皮–间质转分化（epithelial mesenchymal transition，EMT）[2-3]。以表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）为代表的 EGF 生长因子家族及其受体 EGFR 均在肺纤维化的病程中起着重要作用[4]。叉头盒蛋白（forkhead box protein，FOX）家族是一类转录因子，其 DNA 结合区具有翼状螺旋结构，与机体发育、细胞免疫、物质代谢与癌症等生理病理过程密切相关。有研究表明，在细胞 EMT 过程中 FOX 家族起到重要的调控作用[5]，FoxO3a 是 FOX 家族中的一员，其失活能够促进 IPF 患者成纤维细胞增殖与胶原聚合物的增加[4]。Ishii 等[6]的研究发现 EGFR 对磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路起激活作用[7-8]，同时亦有研究发现 Foxo3a 是胰岛素/磷酸肌醇-3 激酶（insulin-PI3K-Akt）通路中的重要信号分子[9]，此通路可负性调控 Foxo3a 的表达。本实验室前期研究证实了 EGFR-TKI 明显抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，下调 EGFR/Akt 信号通路活性，减少 EMT 间质标志物 α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表达，使 Foxo3a 活化增加[10-12]，提示 Foxo3a 对小鼠肺纤维化起保护作用，但其具体的作用机制目前尚不明确。Snail1 亦参与了肺纤维化 EMT 过程的调控。Snail1 蛋白是 Snail 超家族的一员，能促使细胞上皮标志物如上皮钙黏素（E-cadherin）等下调，间质标志物如纤连蛋白等上调，导致间充质样细胞的产生[13]。因此，本研究建立博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，并予以 EGFR-TKI 代表药物吉非替尼干预，探讨 Foxo3a 下游信号通路及 Foxo3a 在肺纤维化 EMT 中可能的作用机制，以寻求肺纤维化潜在的关键靶点，为其治疗策略的制定提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF 级 C57BL/6 小鼠 30 只，雌雄各半，6 周龄，平均体重为 18.65 g。小鼠从广东省医学实验动物中心（SCXK（粤）2013-0002）购买，寄养于中国人民解放军南部战区总医院实验动物中心（原广州军区广州总医院实验动物中心，资质批准号：SYXK（粤）2014-0100）。严格遵守《实验动物管理条例》实施所有实验操作与实验流程。
1.2 主要材料
博来霉素（15 mg/支，浙江海正药业）；吉非替尼（250 mg/片，英国阿斯利康公司）；RIPA 强裂解液（江苏碧云天公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天公司）；蛋白酶抑制剂（江苏碧云天公司）；磷酸酶抑制剂 A（江苏碧云天公司）；α-SMA 抗体（武汉博士德公司）；E-cadherin 抗体（美国 CST 公司）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体（美国 CST 公司）；FoxO3a 抗体（美国 CST 公司）；磷酸化叉头盒蛋白 O3a（Phospho-Foxo3a，p-FoxO3a）抗体（美国 CST 公司）；叉头盒蛋白 M1（Forkhead box M1，FoxM1）抗体（英国 biorbyt 公司）；Snail1 抗体（美国 CST 公司）；HMGB1 抗体（美国 CST 公司）；极超敏 ECL 化学发光试剂盒（江苏碧云天公司）；Masson 三色染色试剂盒（武汉塞维尔公司）；苏木素–伊红（hematoxylin eosin，HE）染色试剂盒（武汉塞维尔公司）；光学显微镜（日本奥林巴斯，BX-51）；Multiskan Go 全波长酶标仪（美国 Thermo Fisher 公司）；Minichemi 化学发光仪（北京赛智创业科技有限公司）；迷你型凝胶成像仪（北京赛智创业科技有限公司）；PrimeScript RT Master Mix（宝生物工程有限公司），2×Taq Master Mix（宝生物工程有限公司）；所用引物由苏州泓迅生物科技有限公司根据设计合成。
1.3 方法
1.3.1 小鼠肺纤维化模型的建立
30 只 C57BL/6 小鼠随机平均分成 3 组，每组 10 只，雌雄各半，分别是对照组、博来霉素组、吉非替尼组。所采用的造模与干预试验方法参考吉非替尼抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的实验研究[10]。以腹腔注射 10% 水合氯醛对三组小鼠进行麻醉，麻醉成功后固定于小鼠手术操作台，纵行切开颈前皮肤，暴露并钝性分离气管，朝博来霉素组与吉非替尼组小鼠向心端气管内注入 100 μL 博来霉素溶液（3 mg/kg 溶于 100 μL 的 0.9% 氯化钠注射液），对照组注入等体积的 0.9% 氯化钠注射液。注射后快速地将动物头朝上直立旋转使药液在肺内分布均匀；次日起即在每日同一时间段对各组小鼠进行连续 14 d 的灌胃处理，吉非替尼组小鼠每日予 100 μL 吉非替尼溶液（20 mg/kg 溶于 100 μL 的 5% 葡萄糖溶液）灌胃，对照组与博来霉素组小鼠则每日予 100 μL 的 5% 葡萄糖溶液灌胃，14 d 后解剖小鼠以收集肺组织标本。取其左肺组织石蜡切片行 HE 染色及 Masson 染色，右肺组织检测各目的基因的 mRNA 及蛋白表达水平。
1.3.2 小鼠肺组织病理检查
肺组织以 4% 多聚甲醛固定 48 h，经常规脱水、石蜡包埋、2 μm 厚度切片后，行 HE 染色和 Masson 染色。肺损伤程度评分参照 Mikawa 等[14]的方法进行，纤维化程度评分参照 Ashcroft 等[15]的方法进行。
1.3.3 逆转录–聚合酶链反应法检测小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 表达
取各组小鼠肺组织 0.1 g，放入无 RNA 酶的预冷玻璃匀浆器中，各加入 1 mL Trizol，冰上进行匀浆处理，匀浆后按照说明书提取总 RNA，超微量分光光度计测定各组小鼠肺组织所提取的 RNA 总浓度，并调整各组质量浓度为 500 ng/ μL，进行逆转录–聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）。逆转录反应体系（10 μL）：5×RT 含酶预混液 2 μL，RNA 0.5 μg，无 RNA 酶水补足至总体系 10 μL。逆转录条件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。PCR 反应体系（25 μL）：2×PCR 含酶预混液 12.5 μL，α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 及 β-actin 上下游引物各 0.25 μL，逆转录产物模板 2 μL，灭菌超纯水 10 μL。PCR 反应条件：预变性 95 ℃ 10 min，变性 95 ℃ 30 s，相应退火温度 30 s，延伸 72 ℃ 30 s（相应循环数见表 1），末次延伸 72 ℃ 10 min。取 10 μL 相应产物进行 1.0% 琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶成像系统拍照。采用 Quantity One 软件分析电泳条带灰度值，以 β-actin 为基准进行半定量分析。相关引物序列、退火温度及循环次数见表 1。
表1
引物序列、退火温度及循环次数
1.3.4 免疫印迹法检测小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白表达
取各组小鼠肺组织各 0.1 g，匀浆后分别对应加入含有适量蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂的 RIPA 强裂解液，冰上裂解 50 min 后以 4 ℃、13 000 r/min 的条件离心 15 min，上清液即为总蛋白，使用 BCA 法测定各组总蛋白浓度后，50 μg/孔上样，进行 SDS-PAGE 后将蛋白转移至 PVDF 膜上，以 5% 脱脂奶粉 20 mL 室温封闭 1 h。使用 1×TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。分别加入 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 及 β-actin 一抗，4 ℃ 孵育过夜。使用 1×TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。加入 HRP 标记的二抗 37 ℃ 孵育 1 h，再使用 1×TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。化学发光试剂检测蛋白印迹条带，采用 Quantity One 软件分析电泳条带灰度值，以 β-actin 为基准进行半定量分析。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 20.0 统计软件。所有数据均进行正态性检验和方差齐性检验，符合正态性检验后以均数±标准差（
±s）表示。若计量资料符合正态分布、方差齐，则多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用 Bonferroni 检验法；若计量资料符合正态分布、但方差不齐，则多组间比较采用 Welch 检验法，两两比较采用 Games-Howell 检验法。显著性水准 α=0.05，双侧检验。
2 结果
2.1 小鼠肺组织病理学改变
2.1.1 肺组织 HE 染色及炎症损伤评分
HE 染色结果见图 1。三组小鼠肺组织炎症损伤评分依次为（1.8±0.8）分、（8.6±0.9）分、（2.6±0.9）分，差异具有统计学意义（F=90.087，P=0.000）。博来霉素组肺组织炎症损伤评分较对照组升高（P<0.01），吉非替尼组肺组织炎症损伤评分较博来霉素组下降（P<0.01），与对照组无显著性差异（P=0.522）。
图1
小鼠肺组织病理检查像（HE×200）
a. 对照组：肺组织的结构完整而清晰，肺泡壁较连续且薄，肺泡无明显的炎症细胞浸润；b. 博来霉素组：肺组织出现弥漫性实变，肺泡壁增厚明显，肺泡间隔破坏，肺泡中可见大量炎症细胞浸润，较多成纤维细胞出现在肺间质；c. 吉非替尼组：肺组织结构轻度紊乱，可见少量炎症细胞浸润
2.1.2 肺组织 Masson 染色及纤维化程度评分
Masson 染色结果见图 2。三组小鼠肺组织纤维化病理评分依次为（1.4±0.5）分、（5.6±1.1）分、（2.8±0.4）分，差异具有统计学意义（F=38.111，P=0.000）。博来霉素组纤维化程度评分较对照组升高（P<0.01），吉非替尼组纤维化程度评分较博来霉素组下降（P<0.01），较对照组升高（P<0.05）。
图2
小鼠肺组织病理检查像（Masson×200）
a. 对照组：肺组织结构完整而清晰，未出现明显炎症细胞浸润及蓝色的胶原沉积；b. 博来霉素组：肺组织结构紊乱，肺间质可见炎症细胞浸润，上皮下的蓝色胶原沉积明显增加；c. 吉非替尼组：肺组织的肺泡壁稍增厚，有少量炎症细胞浸润，但结构基本完整，伴有少量蓝色胶原沉积
2.2 小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 的表达
肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 表达的 RT-PCR 结果见图 3a，半定量分析结果见图 3b及表 2。
图3
小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 表达
a. RT-PCR 结果电泳条带图；b. 相对表达水平。与博来霉素组比较，*
表2
小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 相对表达水平（
）
2.3 小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白的表达
肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白表达的免疫印迹检测结果见图 4a 及图 5a，半定量分析结果见图 4b、5b 及表 3。
图4
肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白的表达
a. 免疫印迹检测电泳条带图；b. 相对表达水平。与博来霉素组比较，*
图5
小鼠肺组织 p-Foxo3a 与 Foxo3a 蛋白的表达
a. 免疫印迹检测电泳条带图；b. Foxo3a 蛋白磷酸化水平。与博来霉素组比较，*
表3
小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白相对表达水平及 Foxo3a 蛋白磷酸化水平（
）
3 讨论
肺纤维化的病理生理过程错综复杂，合理运用动物模型尽可能重现其病理生理过程，是更准确有效地探究肺纤维化治疗方法的重要前提。博来霉素致肺纤维化模型是公认的较成熟的模型，能够反映人类肺纤维化的病理特点[16]。科研人员多采用单次气管内滴入博来霉素这一经典方法来复制肺纤维化模型[17]，该方法具有给药次数少、剂量小、造模时间短、经济成本较低等优点[18]。在保证实验研究科学性的基础上，出于对经济成本、操作简便性以及保持与本实验室前期研究的连贯性等方面的考虑，本次研究依然采用气管内滴入博来霉素的经典方法来建立小鼠肺纤维化模型。本实验所采用的造模与干预试验方法参考吉非替尼抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的实验研究[10]。而鉴定肺纤维化体外模型成功的金标准目前尚未明确，常用的方法有观察细胞形态、检测胶原含量与对 TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、α-SMA、E-cadherin 等指标的检测，而 α-SMA 是间充质细胞表型的标志物之一，其表达对于肌成纤维细胞代谢和形态学特性维持起重要作用，其表达增加是 EMT 的标志[19]。E-cadherin 是上皮细胞黏附和表型的标志物之一，其减少和丢失是 EMT 的标志，从而形成纤维化[20]。EMT 可以由多种转录因子所调控，如 Snail、Slug 等，可以抑制 E-cadherin 的表达，这些分子开关都可以被 FoxM1 所调控[21]。亦有研究发现，FoxM1 是 Foxo3a 的直接转录靶点，PI3K-AKT-FOXO 信号通路的重要下游效应物[22]。另有研究显示，FoxM1 是吉非替尼作用的一个下游分子靶点，在乳腺癌细胞中吉非替尼可以通过激活 Foxo3a 抑制 FoxM1 表达[23]。Snail1 主要表达于上皮细胞，被激活后进入胞核与 E-cadherin 启动子中特异性 DNA 序列 E-box 元件结合后，可抑制 E-cadherin 的基因转录与蛋白表达，最终导致 EMT 的发生[24]。研究表明，HMGB1 参与炎症反应，且能诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞发生间质细胞转分化，从上皮细胞向肌成纤维细胞转化并且表达 α-SMA，与组织纤维化密切相关[25]。我们推测，Foxo3a 通过负调控 FoxM1 与 Snail1 来抑制肺纤维化 EMT。因此，本研究先复制博来霉素致小鼠肺纤维化模型，并予吉非替尼干预，借助 HE 染色与 Masson 染色等组织病理学方法评估各组小鼠肺组织炎症程度与纤维化程度、RT-PCR 与免疫印迹法检测 α-SMA、E-cadherin 表达情况以评估肺纤维化 EMT 形成与否，以 HMGB1 表达水平辅助评估肺组织炎症程度；在成功复制模型后，再检测 Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 的表达水平，初步探究肺纤维化中 Foxo3a 的下游通路。
由于目前还没有一种公认的方法可以使肺纤维化在已形成后逆转，此次研究仍然沿用传统的干预方案，将吉非替尼的干预持续于 14 d 的整个造模过程中，即本研究所观察到的 TKI 的数据是作用于肺泡急性损伤阶段和肺纤维化两个阶段的[26]。在本研究中，HE 染色及 Masson 染色结果显示，与对照组相比，博来霉素组小鼠的肺部炎症损伤程度评分及纤维化程度评分上调。RT-PCR 与免疫印迹检测结果则显示，一方面，HMGB1 基因与蛋白水平上调，此从分子学水平上反映了小鼠肺部炎症程度；另一方面，α-SMA 基因与蛋白表达水平上调，E-cadherin 基因与蛋白表达水平下调，提示 EMT 形成，本研究成功复制了博来霉素致肺纤维化小鼠模型。这与相关的既往研究结果相符[10-11]。本研究还发现在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中 HMGB1、α-SMA 基因与蛋白表达均上调，在吉非替尼干预后 HMGB1、α-SMA 基因与蛋白表达均下调，两者的表达变化相一致。蔡琳等[25]的研究结果显示 HMGB1 表达增加可以活化间质标志物 α-SMA 的表达，本研究及文献结果均提示 α-SMA 可能受上游的 HMGB1 调控。此外，还有研究显示 HMGB1 可以作为坏死细胞的死亡标志物，还是炎症反应的关键分子[27]。因此，我们推测 HMGB1 可能通过其在 EMT 与炎症反应两个方面的变化影响着肺纤维化。
Foxo3a 可以被 PI3K/Akt 通路中活化的 Akt 磷酸化而失活，参与调控 EMT 的效应蛋白的基因如 Snails、Twist 等的表达[28]，表现为成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原的沉积[29]。在本研究中，与博来霉素组相比，吉非替尼组小鼠 p-Foxo3a 蛋白表达水平呈下降趋势，Foxo3a 基因与蛋白表达水平皆有上升趋势，但 Foxo3a 蛋白磷酸化水平下调，即活性增加；吉非替尼组肺组织炎症损伤程度及纤维化程度减轻，α-SMA 基因与蛋白水平下调，此变化趋势与 Foxo3a 活性变化相反；吉非替尼组 E-cadherin 基因与蛋白水平上调，此与 Foxo3a 活性变化相同。另有研究发现，敲低 Foxo3a 后，人肾小管上皮细胞 EMT 的关键指标 E-cadherin 蛋白含量明显减少，而 α-SMA 蛋白含量与阴性对照组相比显著增加[30]。这提示 Foxo3a 对 EMT 过程有负性调控作用。因此，我们推测吉非替尼可通过抑制 Foxo3a 磷酸化，使 Foxo3a 水平升高，活性增加，来抑制肺纤维化，这与彭婷等[12]的研究结果一致。但 Foxo3a 在肺纤维化 EMT 中的下游通路尚不清楚，且目前国内外亦鲜有对 Foxo3a 在肺纤维化中的作用机制的研究报道。
前文已提及 Snail1 与 FoxM1 可能是 Foxo3a 的下游分子。本研究发现，博来霉素组小鼠 Foxo3a 蛋白磷酸化水平上调（活性减少），Snail1 基因与蛋白水平上调，伴随着 E-cadherin 基因与蛋白水平的下调与 α-SMA 基因与蛋白水平的上调；予以 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼后，Foxo3a 蛋白磷酸化水平下调（活性增加），Snail1 基因与蛋白水平下调，E-cadherin 基因与蛋白水平上调，α-SMA 基因与蛋白水平下调。即 Snail1 基因与蛋白水平变化与 Foxo3a 蛋白磷酸化水平、α-SMA 表达水平变化互相平行，却与 Foxo3a 活性变化、E-cadherin 表达变化相反。研究表明，Snail1 是一种含锌指蛋白的转录因子，它能与 E-cadherin 或其他基因启动子上的特异性 DNA 序列 E-box 结合，抑制基因转录从而诱导 EMT，是所有激活 EMT 过程的中心媒介[31]。而本研究及本实验室前期研究[12]亦均证实了 Foxo3a 活性增加可上调 E-cadherin 表达，下调 α-SMA 表达，从而抑制肺纤维化。故我们推测，Foxo3a 通过负调控 Snail1 表达来缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。
FoxM1 属于 Fox 家族中的一员，可以调控细胞的增殖、成熟、死亡等生理病理过程[32]。有研究提示 FoxM1 可能通过上调 Snail 来抑制 E-cadherin，从而促进非小细胞肺癌 EMT 的发生[5]。金成等[33]发现在人结肠癌组织中 FoxM1 高表达而 E-cadherin 低表达。于水等[34]发现 FoxM1 可调控 Snail1 以促进肝癌 EMT。以上研究均提示 FoxM1 与 Snail1 之间可能呈正调控关系。为了进一步探索 Foxo3a 与 Snail1 的关系，本研究检测了各组小鼠肺组织中 FoxM1 基因与蛋白表达水平。结果显示博来霉素组小鼠肺组织中 FoxM1 基因与蛋白表达水平呈上升趋势，Snail1 基因与蛋白表达水平上调；予以吉非替尼干预后，吉非替尼组小鼠肺组织 FoxM1 基因与蛋白表达水平却较博来霉素组小鼠的轻微升高，而 Snail1 基因与蛋白表达水平下调，此时 FoxM1 与 Snail1 的表达水平并非如预期一样地呈正相关关系。同时，吉非替尼组小鼠 FoxM1 表达水平与 Foxo3a 活性变化趋势相同，这亦与 McGovern 等[23]发现吉非替尼能通过激活 Foxo3a 抑制 FoxM1 表达的研究结果并不相符。为了解决这一疑惑，我们查阅相关文献发现人类 FoxM1 的蛋白表达存在着 A、B、C 三种剪接异构体。FoxM1A 不具有转录活性，在细胞中表达很低；FoxM1B 和 FoxM1C 具有转录活性，在肿瘤组织中有高表达，但在某些方面具有不同的生物学功能[35-36]。谭拥军等[37]在转录因子 FoxM1 剪接异构体在乳腺癌 EMT 过程中的研究中发现 FoxM1B 促进 EMT 的发生，FoxM1C 却能抑制 EMT 的发生，FoxM1B 与 FoxM1C 作为 FoxM1 的剪接异构体具有完全相反的功能。本研究中吉非替尼组小鼠肺组织 FoxM1 基因与蛋白表达水平仅较对照组与博来霉素组小鼠的轻微上升，差异并无统计学意义，但其 Foxo3a 蛋白磷酸化水平却显著下调，即 Foxo3a 活性增加。这提示在此研究中 Foxo3a 活性的增加可能并未明显影响 FoxM1 的基因转录与蛋白表达水平。因此，我们推测小鼠肺组织中 FoxM1 可能也存在剪接异构体，Foxo3a 可能通过调节 FoxM1 不同剪接异构体之间的比例来调控其下游通路，但具体的调控机制仍待进一步研究去阐明。另外，FoxM1 基因与蛋白表达水平的趋势不明显是否由各组实验小鼠数目不够多所致，有待深入研究。
本研究通过采用气管内滴入博来霉素的经典方法来建立小鼠肺纤维化模型，首次探讨了在肺纤维化中与 Foxo3a 相关的下游信号通路。本研究表明，Foxo3a 蛋白磷酸化水平以及 Snail1 基因与蛋白水平在博来霉素致肺纤维化小鼠肺组织中的表达变化与肺纤维化程度变化趋势一致，而在 EGFR-TKI 代表药物吉非替尼减轻博来霉素诱导的肺纤维化过程的同时，伴随着 Foxo3a 蛋白磷酸化水平、Snail1 基因与蛋白水平的下调。因此，我们推测 Foxo3a 活性增加可下调 Snail1，使得 α-SMA 表达降低、E-cadherin 表达升高，从而减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，其机制可能与 Foxo3a 通过调节 FoxM1 不同剪接异构体之间的比例来调控其下游通路有关。本研究或可拨开肺纤维化发病机制上的重重迷雾，找到肺纤维化的关键靶点，为该病的防治贡献一点绵薄之力。但本研究仅为初步研究，Foxo3a 是否通过调控 FoxM1 不同剪接异构体之间比例来抑制 Snail1，后续或需通过检测 FoxM1 不同剪接异构体的 mRNA 与蛋白表达水平等进一步研究加以求证。同时应增加各组实验小鼠样本量，使得目的基因的表达趋势变化更加明显。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）属于间质性肺疾病中的一种常见疾病类型，具有极高的病死率，其发病机制尚未明确，其中肺泡上皮细胞在反复的微小损伤后的异常修复被认为是其重要机制之一[1]。研究发现，在纤维化患者及博来霉素引起的小鼠肺纤维化模型中均发现上皮细胞损伤后的修复过程中伴有上皮–间质转分化（epithelial mesenchymal transition，EMT）[2-3]。以表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）为代表的 EGF 生长因子家族及其受体 EGFR 均在肺纤维化的病程中起着重要作用[4]。叉头盒蛋白（forkhead box protein，FOX）家族是一类转录因子，其 DNA 结合区具有翼状螺旋结构，与机体发育、细胞免疫、物质代谢与癌症等生理病理过程密切相关。有研究表明，在细胞 EMT 过程中 FOX 家族起到重要的调控作用[5]，FoxO3a 是 FOX 家族中的一员，其失活能够促进 IPF 患者成纤维细胞增殖与胶原聚合物的增加[4]。Ishii 等[6]的研究发现 EGFR 对磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路起激活作用[7-8]，同时亦有研究发现 Foxo3a 是胰岛素/磷酸肌醇-3 激酶（insulin-PI3K-Akt）通路中的重要信号分子[9]，此通路可负性调控 Foxo3a 的表达。本实验室前期研究证实了 EGFR-TKI 明显抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，下调 EGFR/Akt 信号通路活性，减少 EMT 间质标志物 α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表达，使 Foxo3a 活化增加[10-12]，提示 Foxo3a 对小鼠肺纤维化起保护作用，但其具体的作用机制目前尚不明确。Snail1 亦参与了肺纤维化 EMT 过程的调控。Snail1 蛋白是 Snail 超家族的一员，能促使细胞上皮标志物如上皮钙黏素（E-cadherin）等下调，间质标志物如纤连蛋白等上调，导致间充质样细胞的产生[13]。因此，本研究建立博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，并予以 EGFR-TKI 代表药物吉非替尼干预，探讨 Foxo3a 下游信号通路及 Foxo3a 在肺纤维化 EMT 中可能的作用机制，以寻求肺纤维化潜在的关键靶点，为其治疗策略的制定提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF 级 C57BL/6 小鼠 30 只，雌雄各半，6 周龄，平均体重为 18.65 g。小鼠从广东省医学实验动物中心（SCXK（粤）2013-0002）购买，寄养于中国人民解放军南部战区总医院实验动物中心（原广州军区广州总医院实验动物中心，资质批准号：SYXK（粤）2014-0100）。严格遵守《实验动物管理条例》实施所有实验操作与实验流程。
1.2 主要材料
博来霉素（15 mg/支，浙江海正药业）；吉非替尼（250 mg/片，英国阿斯利康公司）；RIPA 强裂解液（江苏碧云天公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天公司）；蛋白酶抑制剂（江苏碧云天公司）；磷酸酶抑制剂 A（江苏碧云天公司）；α-SMA 抗体（武汉博士德公司）；E-cadherin 抗体（美国 CST 公司）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体（美国 CST 公司）；FoxO3a 抗体（美国 CST 公司）；磷酸化叉头盒蛋白 O3a（Phospho-Foxo3a，p-FoxO3a）抗体（美国 CST 公司）；叉头盒蛋白 M1（Forkhead box M1，FoxM1）抗体（英国 biorbyt 公司）；Snail1 抗体（美国 CST 公司）；HMGB1 抗体（美国 CST 公司）；极超敏 ECL 化学发光试剂盒（江苏碧云天公司）；Masson 三色染色试剂盒（武汉塞维尔公司）；苏木素–伊红（hematoxylin eosin，HE）染色试剂盒（武汉塞维尔公司）；光学显微镜（日本奥林巴斯，BX-51）；Multiskan Go 全波长酶标仪（美国 Thermo Fisher 公司）；Minichemi 化学发光仪（北京赛智创业科技有限公司）；迷你型凝胶成像仪（北京赛智创业科技有限公司）；PrimeScript RT Master Mix（宝生物工程有限公司），2×Taq Master Mix（宝生物工程有限公司）；所用引物由苏州泓迅生物科技有限公司根据设计合成。
1.3 方法
1.3.1 小鼠肺纤维化模型的建立
30 只 C57BL/6 小鼠随机平均分成 3 组，每组 10 只，雌雄各半，分别是对照组、博来霉素组、吉非替尼组。所采用的造模与干预试验方法参考吉非替尼抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的实验研究[10]。以腹腔注射 10% 水合氯醛对三组小鼠进行麻醉，麻醉成功后固定于小鼠手术操作台，纵行切开颈前皮肤，暴露并钝性分离气管，朝博来霉素组与吉非替尼组小鼠向心端气管内注入 100 μL 博来霉素溶液（3 mg/kg 溶于 100 μL 的 0.9% 氯化钠注射液），对照组注入等体积的 0.9% 氯化钠注射液。注射后快速地将动物头朝上直立旋转使药液在肺内分布均匀；次日起即在每日同一时间段对各组小鼠进行连续 14 d 的灌胃处理，吉非替尼组小鼠每日予 100 μL 吉非替尼溶液（20 mg/kg 溶于 100 μL 的 5% 葡萄糖溶液）灌胃，对照组与博来霉素组小鼠则每日予 100 μL 的 5% 葡萄糖溶液灌胃，14 d 后解剖小鼠以收集肺组织标本。取其左肺组织石蜡切片行 HE 染色及 Masson 染色，右肺组织检测各目的基因的 mRNA 及蛋白表达水平。
1.3.2 小鼠肺组织病理检查
肺组织以 4% 多聚甲醛固定 48 h，经常规脱水、石蜡包埋、2 μm 厚度切片后，行 HE 染色和 Masson 染色。肺损伤程度评分参照 Mikawa 等[14]的方法进行，纤维化程度评分参照 Ashcroft 等[15]的方法进行。
1.3.3 逆转录–聚合酶链反应法检测小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 表达
取各组小鼠肺组织 0.1 g，放入无 RNA 酶的预冷玻璃匀浆器中，各加入 1 mL Trizol，冰上进行匀浆处理，匀浆后按照说明书提取总 RNA，超微量分光光度计测定各组小鼠肺组织所提取的 RNA 总浓度，并调整各组质量浓度为 500 ng/ μL，进行逆转录–聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）。逆转录反应体系（10 μL）：5×RT 含酶预混液 2 μL，RNA 0.5 μg，无 RNA 酶水补足至总体系 10 μL。逆转录条件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。PCR 反应体系（25 μL）：2×PCR 含酶预混液 12.5 μL，α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 及 β-actin 上下游引物各 0.25 μL，逆转录产物模板 2 μL，灭菌超纯水 10 μL。PCR 反应条件：预变性 95 ℃ 10 min，变性 95 ℃ 30 s，相应退火温度 30 s，延伸 72 ℃ 30 s（相应循环数见表 1），末次延伸 72 ℃ 10 min。取 10 μL 相应产物进行 1.0% 琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶成像系统拍照。采用 Quantity One 软件分析电泳条带灰度值，以 β-actin 为基准进行半定量分析。相关引物序列、退火温度及循环次数见表 1。
表1
引物序列、退火温度及循环次数
1.3.4 免疫印迹法检测小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白表达
取各组小鼠肺组织各 0.1 g，匀浆后分别对应加入含有适量蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂的 RIPA 强裂解液，冰上裂解 50 min 后以 4 ℃、13 000 r/min 的条件离心 15 min，上清液即为总蛋白，使用 BCA 法测定各组总蛋白浓度后，50 μg/孔上样，进行 SDS-PAGE 后将蛋白转移至 PVDF 膜上，以 5% 脱脂奶粉 20 mL 室温封闭 1 h。使用 1×TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。分别加入 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 及 β-actin 一抗，4 ℃ 孵育过夜。使用 1×TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。加入 HRP 标记的二抗 37 ℃ 孵育 1 h，再使用 1×TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。化学发光试剂检测蛋白印迹条带，采用 Quantity One 软件分析电泳条带灰度值，以 β-actin 为基准进行半定量分析。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 20.0 统计软件。所有数据均进行正态性检验和方差齐性检验，符合正态性检验后以均数±标准差（±s）表示。若计量资料符合正态分布、方差齐，则多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用 Bonferroni 检验法；若计量资料符合正态分布、但方差不齐，则多组间比较采用 Welch 检验法，两两比较采用 Games-Howell 检验法。显著性水准 α=0.05，双侧检验。
2 结果
2.1 小鼠肺组织病理学改变
2.1.1 肺组织 HE 染色及炎症损伤评分
HE 染色结果见图 1。三组小鼠肺组织炎症损伤评分依次为（1.8±0.8）分、（8.6±0.9）分、（2.6±0.9）分，差异具有统计学意义（F=90.087，P=0.000）。博来霉素组肺组织炎症损伤评分较对照组升高（P<0.01），吉非替尼组肺组织炎症损伤评分较博来霉素组下降（P<0.01），与对照组无显著性差异（P=0.522）。
图1
小鼠肺组织病理检查像（HE×200）
a. 对照组：肺组织的结构完整而清晰，肺泡壁较连续且薄，肺泡无明显的炎症细胞浸润；b. 博来霉素组：肺组织出现弥漫性实变，肺泡壁增厚明显，肺泡间隔破坏，肺泡中可见大量炎症细胞浸润，较多成纤维细胞出现在肺间质；c. 吉非替尼组：肺组织结构轻度紊乱，可见少量炎症细胞浸润
2.1.2 肺组织 Masson 染色及纤维化程度评分
Masson 染色结果见图 2。三组小鼠肺组织纤维化病理评分依次为（1.4±0.5）分、（5.6±1.1）分、（2.8±0.4）分，差异具有统计学意义（F=38.111，P=0.000）。博来霉素组纤维化程度评分较对照组升高（P<0.01），吉非替尼组纤维化程度评分较博来霉素组下降（P<0.01），较对照组升高（P<0.05）。
图2
小鼠肺组织病理检查像（Masson×200）
a. 对照组：肺组织结构完整而清晰，未出现明显炎症细胞浸润及蓝色的胶原沉积；b. 博来霉素组：肺组织结构紊乱，肺间质可见炎症细胞浸润，上皮下的蓝色胶原沉积明显增加；c. 吉非替尼组：肺组织的肺泡壁稍增厚，有少量炎症细胞浸润，但结构基本完整，伴有少量蓝色胶原沉积
2.2 小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 的表达
肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 表达的 RT-PCR 结果见图 3a，半定量分析结果见图 3b及表 2。
图3
小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 表达
a. RT-PCR 结果电泳条带图；b. 相对表达水平。与博来霉素组比较，*
表2
小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 相对表达水平（）
2.3 小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白的表达
肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白表达的免疫印迹检测结果见图 4a 及图 5a，半定量分析结果见图 4b、5b 及表 3。
图4
肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白的表达
a. 免疫印迹检测电泳条带图；b. 相对表达水平。与博来霉素组比较，*
图5
小鼠肺组织 p-Foxo3a 与 Foxo3a 蛋白的表达
a. 免疫印迹检测电泳条带图；b. Foxo3a 蛋白磷酸化水平。与博来霉素组比较，*
表3
小鼠肺组织 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白相对表达水平及 Foxo3a 蛋白磷酸化水平（）
3 讨论
肺纤维化的病理生理过程错综复杂，合理运用动物模型尽可能重现其病理生理过程，是更准确有效地探究肺纤维化治疗方法的重要前提。博来霉素致肺纤维化模型是公认的较成熟的模型，能够反映人类肺纤维化的病理特点[16]。科研人员多采用单次气管内滴入博来霉素这一经典方法来复制肺纤维化模型[17]，该方法具有给药次数少、剂量小、造模时间短、经济成本较低等优点[18]。在保证实验研究科学性的基础上，出于对经济成本、操作简便性以及保持与本实验室前期研究的连贯性等方面的考虑，本次研究依然采用气管内滴入博来霉素的经典方法来建立小鼠肺纤维化模型。本实验所采用的造模与干预试验方法参考吉非替尼抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的实验研究[10]。而鉴定肺纤维化体外模型成功的金标准目前尚未明确，常用的方法有观察细胞形态、检测胶原含量与对 TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、α-SMA、E-cadherin 等指标的检测，而 α-SMA 是间充质细胞表型的标志物之一，其表达对于肌成纤维细胞代谢和形态学特性维持起重要作用，其表达增加是 EMT 的标志[19]。E-cadherin 是上皮细胞黏附和表型的标志物之一，其减少和丢失是 EMT 的标志，从而形成纤维化[20]。EMT 可以由多种转录因子所调控，如 Snail、Slug 等，可以抑制 E-cadherin 的表达，这些分子开关都可以被 FoxM1 所调控[21]。亦有研究发现，FoxM1 是 Foxo3a 的直接转录靶点，PI3K-AKT-FOXO 信号通路的重要下游效应物[22]。另有研究显示，FoxM1 是吉非替尼作用的一个下游分子靶点，在乳腺癌细胞中吉非替尼可以通过激活 Foxo3a 抑制 FoxM1 表达[23]。Snail1 主要表达于上皮细胞，被激活后进入胞核与 E-cadherin 启动子中特异性 DNA 序列 E-box 元件结合后，可抑制 E-cadherin 的基因转录与蛋白表达，最终导致 EMT 的发生[24]。研究表明，HMGB1 参与炎症反应，且能诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞发生间质细胞转分化，从上皮细胞向肌成纤维细胞转化并且表达 α-SMA，与组织纤维化密切相关[25]。我们推测，Foxo3a 通过负调控 FoxM1 与 Snail1 来抑制肺纤维化 EMT。因此，本研究先复制博来霉素致小鼠肺纤维化模型，并予吉非替尼干预，借助 HE 染色与 Masson 染色等组织病理学方法评估各组小鼠肺组织炎症程度与纤维化程度、RT-PCR 与免疫印迹法检测 α-SMA、E-cadherin 表达情况以评估肺纤维化 EMT 形成与否，以 HMGB1 表达水平辅助评估肺组织炎症程度；在成功复制模型后，再检测 Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 的表达水平，初步探究肺纤维化中 Foxo3a 的下游通路。
由于目前还没有一种公认的方法可以使肺纤维化在已形成后逆转，此次研究仍然沿用传统的干预方案，将吉非替尼的干预持续于 14 d 的整个造模过程中，即本研究所观察到的 TKI 的数据是作用于肺泡急性损伤阶段和肺纤维化两个阶段的[26]。在本研究中，HE 染色及 Masson 染色结果显示，与对照组相比，博来霉素组小鼠的肺部炎症损伤程度评分及纤维化程度评分上调。RT-PCR 与免疫印迹检测结果则显示，一方面，HMGB1 基因与蛋白水平上调，此从分子学水平上反映了小鼠肺部炎症程度；另一方面，α-SMA 基因与蛋白表达水平上调，E-cadherin 基因与蛋白表达水平下调，提示 EMT 形成，本研究成功复制了博来霉素致肺纤维化小鼠模型。这与相关的既往研究结果相符[10-11]。本研究还发现在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中 HMGB1、α-SMA 基因与蛋白表达均上调，在吉非替尼干预后 HMGB1、α-SMA 基因与蛋白表达均下调，两者的表达变化相一致。蔡琳等[25]的研究结果显示 HMGB1 表达增加可以活化间质标志物 α-SMA 的表达，本研究及文献结果均提示 α-SMA 可能受上游的 HMGB1 调控。此外，还有研究显示 HMGB1 可以作为坏死细胞的死亡标志物，还是炎症反应的关键分子[27]。因此，我们推测 HMGB1 可能通过其在 EMT 与炎症反应两个方面的变化影响着肺纤维化。
Foxo3a 可以被 PI3K/Akt 通路中活化的 Akt 磷酸化而失活，参与调控 EMT 的效应蛋白的基因如 Snails、Twist 等的表达[28]，表现为成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原的沉积[29]。在本研究中，与博来霉素组相比，吉非替尼组小鼠 p-Foxo3a 蛋白表达水平呈下降趋势，Foxo3a 基因与蛋白表达水平皆有上升趋势，但 Foxo3a 蛋白磷酸化水平下调，即活性增加；吉非替尼组肺组织炎症损伤程度及纤维化程度减轻，α-SMA 基因与蛋白水平下调，此变化趋势与 Foxo3a 活性变化相反；吉非替尼组 E-cadherin 基因与蛋白水平上调，此与 Foxo3a 活性变化相同。另有研究发现，敲低 Foxo3a 后，人肾小管上皮细胞 EMT 的关键指标 E-cadherin 蛋白含量明显减少，而 α-SMA 蛋白含量与阴性对照组相比显著增加[30]。这提示 Foxo3a 对 EMT 过程有负性调控作用。因此，我们推测吉非替尼可通过抑制 Foxo3a 磷酸化，使 Foxo3a 水平升高，活性增加，来抑制肺纤维化，这与彭婷等[12]的研究结果一致。但 Foxo3a 在肺纤维化 EMT 中的下游通路尚不清楚，且目前国内外亦鲜有对 Foxo3a 在肺纤维化中的作用机制的研究报道。
前文已提及 Snail1 与 FoxM1 可能是 Foxo3a 的下游分子。本研究发现，博来霉素组小鼠 Foxo3a 蛋白磷酸化水平上调（活性减少），Snail1 基因与蛋白水平上调，伴随着 E-cadherin 基因与蛋白水平的下调与 α-SMA 基因与蛋白水平的上调；予以 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼后，Foxo3a 蛋白磷酸化水平下调（活性增加），Snail1 基因与蛋白水平下调，E-cadherin 基因与蛋白水平上调，α-SMA 基因与蛋白水平下调。即 Snail1 基因与蛋白水平变化与 Foxo3a 蛋白磷酸化水平、α-SMA 表达水平变化互相平行，却与 Foxo3a 活性变化、E-cadherin 表达变化相反。研究表明，Snail1 是一种含锌指蛋白的转录因子，它能与 E-cadherin 或其他基因启动子上的特异性 DNA 序列 E-box 结合，抑制基因转录从而诱导 EMT，是所有激活 EMT 过程的中心媒介[31]。而本研究及本实验室前期研究[12]亦均证实了 Foxo3a 活性增加可上调 E-cadherin 表达，下调 α-SMA 表达，从而抑制肺纤维化。故我们推测，Foxo3a 通过负调控 Snail1 表达来缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。
FoxM1 属于 Fox 家族中的一员，可以调控细胞的增殖、成熟、死亡等生理病理过程[32]。有研究提示 FoxM1 可能通过上调 Snail 来抑制 E-cadherin，从而促进非小细胞肺癌 EMT 的发生[5]。金成等[33]发现在人结肠癌组织中 FoxM1 高表达而 E-cadherin 低表达。于水等[34]发现 FoxM1 可调控 Snail1 以促进肝癌 EMT。以上研究均提示 FoxM1 与 Snail1 之间可能呈正调控关系。为了进一步探索 Foxo3a 与 Snail1 的关系，本研究检测了各组小鼠肺组织中 FoxM1 基因与蛋白表达水平。结果显示博来霉素组小鼠肺组织中 FoxM1 基因与蛋白表达水平呈上升趋势，Snail1 基因与蛋白表达水平上调；予以吉非替尼干预后，吉非替尼组小鼠肺组织 FoxM1 基因与蛋白表达水平却较博来霉素组小鼠的轻微升高，而 Snail1 基因与蛋白表达水平下调，此时 FoxM1 与 Snail1 的表达水平并非如预期一样地呈正相关关系。同时，吉非替尼组小鼠 FoxM1 表达水平与 Foxo3a 活性变化趋势相同，这亦与 McGovern 等[23]发现吉非替尼能通过激活 Foxo3a 抑制 FoxM1 表达的研究结果并不相符。为了解决这一疑惑，我们查阅相关文献发现人类 FoxM1 的蛋白表达存在着 A、B、C 三种剪接异构体。FoxM1A 不具有转录活性，在细胞中表达很低；FoxM1B 和 FoxM1C 具有转录活性，在肿瘤组织中有高表达，但在某些方面具有不同的生物学功能[35-36]。谭拥军等[37]在转录因子 FoxM1 剪接异构体在乳腺癌 EMT 过程中的研究中发现 FoxM1B 促进 EMT 的发生，FoxM1C 却能抑制 EMT 的发生，FoxM1B 与 FoxM1C 作为 FoxM1 的剪接异构体具有完全相反的功能。本研究中吉非替尼组小鼠肺组织 FoxM1 基因与蛋白表达水平仅较对照组与博来霉素组小鼠的轻微上升，差异并无统计学意义，但其 Foxo3a 蛋白磷酸化水平却显著下调，即 Foxo3a 活性增加。这提示在此研究中 Foxo3a 活性的增加可能并未明显影响 FoxM1 的基因转录与蛋白表达水平。因此，我们推测小鼠肺组织中 FoxM1 可能也存在剪接异构体，Foxo3a 可能通过调节 FoxM1 不同剪接异构体之间的比例来调控其下游通路，但具体的调控机制仍待进一步研究去阐明。另外，FoxM1 基因与蛋白表达水平的趋势不明显是否由各组实验小鼠数目不够多所致，有待深入研究。
本研究通过采用气管内滴入博来霉素的经典方法来建立小鼠肺纤维化模型，首次探讨了在肺纤维化中与 Foxo3a 相关的下游信号通路。本研究表明，Foxo3a 蛋白磷酸化水平以及 Snail1 基因与蛋白水平在博来霉素致肺纤维化小鼠肺组织中的表达变化与肺纤维化程度变化趋势一致，而在 EGFR-TKI 代表药物吉非替尼减轻博来霉素诱导的肺纤维化过程的同时，伴随着 Foxo3a 蛋白磷酸化水平、Snail1 基因与蛋白水平的下调。因此，我们推测 Foxo3a 活性增加可下调 Snail1，使得 α-SMA 表达降低、E-cadherin 表达升高，从而减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，其机制可能与 Foxo3a 通过调节 FoxM1 不同剪接异构体之间的比例来调控其下游通路有关。本研究或可拨开肺纤维化发病机制上的重重迷雾，找到肺纤维化的关键靶点，为该病的防治贡献一点绵薄之力。但本研究仅为初步研究，Foxo3a 是否通过调控 FoxM1 不同剪接异构体之间比例来抑制 Snail1，后续或需通过检测 FoxM1 不同剪接异构体的 mRNA 与蛋白表达水平等进一步研究加以求证。同时应增加各组实验小鼠样本量，使得目的基因的表达趋势变化更加明显。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
