白细胞介素-25 及其受体对过敏性哮喘患者嗜酸性粒细胞的调控作用_《中国呼吸与危重监护杂志》

作者：

杜威 ^1,2 , 杜娟 ^1,2 , 周俊 ^1,2 , 时国朝 ^1,2 ,  汤葳 ^1,2

1. 上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸与危重症医学科（上海 200025）;
2. 上海交通大学医学院呼吸病研究所（上海 200025）;

关键词：

哮喘过敏原激发嗜酸性粒细胞白细胞介素-25 白细胞介素-25 受体

DOI：

10.7507/1671-6205.201805012

视频：

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摘要 全文 图表 视频 参考文献 施引文献 补充材料

目的研究白细胞介素-25（IL-25）在过敏性哮喘患者的过敏原激发过程中，对嗜酸性粒细胞（Eos）表面受体表达的影响及其潜在机制。方法 15 例过敏性哮喘患者进行过敏原激发试验，激发前后测定外周血 Eos 表面 IL-25 受体的表达情况和血浆及 Eos 胞内 IL-25 表达水平。此外，对外周血提取的 Eos 在体外以 IL-25 进行刺激，测定 Eos 细胞 IL-5 和 IL-13 的表达及脱颗粒情况，以及其在嗜酸性粒细胞趋化因子（eotaxin）环境中的迁移情况。通过重复测量方差分析方法进行数据分析，两两比较采用 Tukey 多组比较方法。结果在过敏原激发前后外周血中表达 IL-17RB 的 Eos 数量分别为（7 426±2 824）/10⁶ 白细胞和（19 446±5 593）/10⁶ 白细胞，同时表达 IL-17RA/RB 的 Eos 数量分别为（4 508±1 360）/10⁶ 白细胞和（9 025±3 166）/10⁶ 白细胞，激发前后相比差异均有统计学意义（P 均<0.001）。激发后 7 h 和 24 h，血浆 IL-25 的水平较激发前均显著上升［激发前，（650±45）pg/ml；激发后 7 h，（851±43）pg/ml；激发后 24 h，（813±56）pg/ml。三组组间比较，差异有统计学意义（P<0.001）］。激发后 24 h 外周血 Eos 胞内表达 IL-25 的数目显著增加［（10 398±1 909）/10⁶ 白细胞和（147 684±46 222）/10⁶ 白细胞，P<0.05）］。在体外实验中，Eos 细胞经 IL-25 刺激后释放过氧化物酶［（1.26±0.40）ng/ml 和（12.5±4.20）ng/ml，P<0.05）］以及胞内表达 IL-5 和 IL-13 水平均显著上升。IL-25 预处理后能够显著增强 Eos 细胞对 eotaxin 的趋化反应（趋化细胞数分别为 36±3 和 69±5，P<0.05）。结论 IL-25/IL-25 受体通路在过敏性哮喘患者中可能促进了 Eos 细胞的聚集、活化和趋化，从而促进了过敏性哮喘嗜酸性粒细胞性炎症反应。

引用本文： 杜威, 杜娟, 周俊, 时国朝, 汤葳. 白细胞介素-25 及其受体对过敏性哮喘患者嗜酸性粒细胞的调控作用. 中国呼吸与危重监护杂志, 2019, 18(3): 247-253. doi: 10.7507/1671-6205.201805012 复制

在过敏性哮喘患者中，嗜酸性粒细胞（eosinophil，Eos）是导致气道炎症的主要细胞成分之一^[1-2]，但在哮喘发生发展中该类细胞的迁移和活化机制仍存在争议。白细胞介素-25（interleukin-25，IL-25）是属于 IL-17 家族的促炎因子，具有维持 2 型免疫反应的作用^[3]，其受体 IL-17RA/RB 由 IL-17RA（信号亚单位）和 IL-17RB（与特定细胞因子结合的亚单位）2 个亚单位构成^[4]。在过敏性疾病的动物模型^[5-6]和体外试验^[7]中已经基本明确 IL-25 能够促进 Eos 的聚集和活化，我们既往的研究也已经发现无症状的过敏性哮喘患者相比健康人群其体内的成熟 Eos 细胞表面的 IL-17RA 和 IL-17RB 的表达以及血浆 IL-25 的表达均显著升高^[8]。但在哮喘患者急性发作过程中 IL-25 及其受体的作用和表达情况变化目前仍不明确。因此在本研究中，我们测定了哮喘患者在吸入过敏原激发后其外周血 Eos 细胞中 IL-25 及其受体表达的动态变化情况，还探究了 IL-25 对 Eos 细胞的细胞因子生成、脱颗粒和趋化能力的作用，从而更加深入地了解过敏性哮喘中 IL-25 如何引起气道 Eos 浸润和炎症反应。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择 2017 年至2018 年门诊收治、符合 GINA 支气管哮喘诊断标准的轻中度过敏性哮喘患者^[9]，经过知情同意后纳入该研究。患者年龄 19～52 岁，未使用过糖皮质激素，仅间断使用 β2 受体激动剂治疗，且均不吸烟，以排除吸烟和糖皮质激素治疗对疾病诊断和试验结果的影响^[8-9]。同时患者皮肤点刺试验中至少一种吸入过敏原阳性（点刺试验阳性指出现 2 mm×2 mm 的风团且组胺反应阳性而溶剂反应阴性），从而保证后续试验的进行且进一步证实患者为过敏性哮喘^[8-9]。该研究通过研究者所在单位伦理委员会审查批准。

1.2 方法

1.2.1 过敏原及溶剂吸入激发反应

过敏原激发试验按照既往研究中的描述进行^[10]。该研究是一项随机对照交叉试验，以过敏原为试验组，过敏原溶剂作为对照组。其中用于试验的吸入过敏原选择在点刺试验中导致最大风团的过敏原或在临床病史中暴露后出现哮喘症状的过敏原。受试者于激发前后采集外周血以进行后续实验。

1.2.2 细胞标本准备和免疫荧光染色

采集患者全血至乙二胺四乙酸管中，裂解液裂解红细胞，荧光激活细胞分选仪（fluorescence activated cell sorter，FACS）缓冲液［磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）中加入 0.1% 的叠氮化钠和 0.5% 的牛血清白蛋白中重悬白细胞］。为了检测 Eos 表面的 IL-25 受体表达情况，细胞通过 V450-CD45、APC-CD16、FITC-IL-17RA、PE-IL-17RB 或 FITC-IgG1，以及 PE-IgG2B 等抗体进行标记。为了检测胞内细胞因子表达水平，细胞首先通过 V450-CD45 和 APC-CD16（或 V450-CD3、Alexa Fluor 700-CD4 和 APC-CRTH2）进行预染色并在 4% 多聚甲醛中重悬 10 min，缓冲液洗涤 2 次后以皂苷缓冲液破膜（Hanks 平衡盐缓冲液中加入 1% 皂苷和 0.05% NaN₃），再通过 FITC 标记的 IL-25 或 IgG1 同型对照抗体标记染色（20 ℃ 下 30 min），然后再加入 1% 多聚甲醛并送流式细胞检测。所用抗体均购自美国 R&D Systems 公司。

1.2.3 检测血浆 IL-25 水平

血浆 IL-25 的表达水平通过购买的酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（美国 Peprotech 公司）进行检测，方法参考文献[8, 11]。

1.2.4 Eos 脱颗粒分析

即 Eos 过氧化物酶检测。过敏性哮喘患者外周血（100 ml）经过 AccuPrep 分层后采集粒细胞层并通过磁珠分选出 Eos（美国 Miltenyi Biotech 公司）。分选出的细胞纯度>95%，存活率>90%。这些细胞在 24 孔板（1×10⁶/ml）中进行培养（RPMI 培养基）并分为加入和不加入 IL-25（1 ng/ml；R&D Systems）处理细胞，在分析结束前 2 h 进行处理。细胞处理后再在 1% 多聚甲醛中重悬，取上清液通过 ELISA 法检测 Eos 过氧化物酶含量（美国 Cloud Clone 公司）。

1.2.5 IL-25 刺激 Th2 型细胞因子表达

Eos 进行富集后培养于 24 孔板中（1×10⁶/ml），并加入 IL-25 或空白对照试剂 18 h。细胞培养结束前 6 h 加入高尔基体拮抗剂莫能霉素（美国 BioLegend 公司）。细胞活性通过台盼蓝染色进行检测。细胞培养结束后采集细胞样本并通过前述免疫染色及流式细胞方法检测胞内细胞因子表达情况。在该过程中，Eos 纯度应>95%，活性>90%。

1.2.6 成熟 Eos 的趋化能力

行跨膜移行试验。Eos 纯化后在 RPMI 培养液中培养 2 h，并在其中加入 1 pg/ml 的 IL-25 或溶剂。细胞趋化能力通过 48 孔 Boyden 小室进行评估，方法参考文献[12]。嗜酸性粒细胞趋化因子（eotaxin，1 nmol/L，美国 R&D Systems 公司）加至下方小室，而 Eos（3×10⁶/ml）加入上方小室。通过随机选取 10 个 40 倍光镜下视野进行计数，从而得出 Eos 数目。

1.2.7 流式细胞术

细胞以 LSR II 流式细胞仪（美国 Becton Dickinson 仪器系统）进行检测，并以 FACSDiva 软件程序（美国 Becton Dickinson 生物公司）获取数据。设门策略参考文献[8]。数据分析采用 FlowJo 9.3.2（美国 Tree Star 公司）软件，从而获得 IL-25 受体及细胞内 IL-25 的表达水平。

1.3 统计学方法

数据分析使用 Graphpad Prism 5 软件（Graphpad Software Inc.，美国）。正态分布数据采用均数±标准误（±SEM）表示。使第 1 秒用力呼气容积（forced expiratory volume in onesecond，FEV₁）下降 20% 所需乙酰胆碱浓度（PC₂₀）采用几何均数和几何标准误进行表示。对于 IL-25 受体在 Eos 表面的表达差异以及其他所有体外试验数据，主要通过重复测量方差分析（analysis of variance，ANOVA）方法进行数据分析。两两比较采用 Tukey 多组比较方法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 气道生理和气道炎症

共纳入 15 例患者。患者皮肤点刺试验均阳性，FEV₁ 占预计值百分比（FEV₁%pred）≥70%。在吸入过敏原后患者都出现了双相气道反应，即在吸入后 3 h 内 FEV₁ 下降≥20%（速发相哮喘反应），而在吸入后 3～7 h FEV₁ 再次下降≥15%（迟发相哮喘反应）。受试者的基线指标见表 1。相比于吸入溶剂，吸入过敏原的患者无论在哮喘的速发相反应和迟发相反应中均存在 FEV₁ 的显著下降（表 2）。而患者在使用过敏原激发后 24 h 会出现 PC₂₀ 的显著降低和痰 Eos 的显著增高（表 2）。此外，激发后 24 h 患者外周血成熟 Eos 绝对数目显著上升［（38±6）×10³/ml 和（64±9）×10³/ml，基线水平和激发后，P<0.05，表 2］。

表1 15 例轻度过敏性哮喘患者基线资料

表选项

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性别	年龄（岁）	FEV₁%pred （%）	乙酰胆碱激发前 PC₂₀（g/L）	吸入过敏原	FEV₁ 下降比例（%）	乙酰胆碱激发后 PC₂₀（g/L）
男	19	81	0.31	猫	35	31	0.16
男	25	114	10.31	屋尘螨	22	31	0.92
女	19	117	20.80	猫	22	18	5.97
女	49	97	1.07	屋尘螨	31	37	1.24
男	44	73	16.00	草	41	22	3.31
女	41	94	0.83	豚草	42	16	0.38
女	47	90	0.60	猫	47	20	0.43
女	20	92	3.19	树	24	36	3.26
男	52	100	6.99	屋尘螨	36	18	5.74
男	27	97	2.71	豚草	42	16	2.7
女	21	98	16.00	马	40	28	1.33
女	19	80	5.82	豚草	29	23	2.81
男	49	90	16.00	屋尘螨	33	25	0.11
女	24	116	0.38	屋尘螨	23	25	0.36
女	25	108	15.48	屋尘螨	38	21	4.26

表2 受试者的肺功能和痰液细胞情况

表选项

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项目	过敏原激发	溶剂对照激发
速发相哮喘反应中 FEV₁ 百分比改变（%，±SEM）	–33.67±2.12^a	–3.40±1.51
迟发相哮喘反应中 FEV₁ 百分比改变（%，±SEM）	–24.47±1.77^a	–3.40±3.26
乙酰胆碱 PC₂₀[mg/ml，几何均数（标准误）]
激发前	7.77（1.88）	6.36（2.39）
激发后 24 h	2.20（0.51）^b	6.30（2.40）
总痰细胞数（×10⁶/ml，±SEM）
激发前	3.62±0.64	5.02±1.16
激发后 24 h	6.59±1.27^b	4.48±1.07
痰 Eos 百分比（%，±SEM）
激发前	4.68±1.63	1.50±0.49
激发后 24 h	12.26±2.68^a，b	2.79±1.06
血 Eos 数（×10³/ml，±SEM）
激发前	38±6	88±27
激发后 24 h	64±9^b	94±31
^a相比溶剂对照 P<0.05，^b相比于基线 P<0.05

2.2 过敏原诱导 IL-25 受体表达水平改变

在过敏原激发后 24 h，外周血中表达 IL-17RB［（7 426±2 824）/10⁶ 白细胞和（19 446±5 593）/10⁶ 白细胞，激发前和激发后，P<0.01］和 IL-17RA/RB［（4 508±1 360）/10⁶ 白细胞和（9 025±3 166）/10⁶ 白细胞，P<0.001］的成熟 Eos 数目显著增多（图 1），而 IL-17RA 的表达无此变化。

图1 轻度过敏性哮喘患者体内成熟 Eos 过敏原激发后表面 IL-25 受体成分表达的变化情况　

a、b、c 分别代表 IL-17RA 阳性、IL-17RB 和 IL-17RA/RB 阳性 Eos 数目。过敏原激发后 IL-17RB 阳性和 IL-17RA/RB 阳性外周血 Eos 数目显著增加。水平线表示均数。^*过敏原组激发前后对比，P<0.05；^#过敏原组和对照组相比，P<0.05

图选项

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