引用本文： 王微, 余勤, 凌继祖. 间歇性低氧对大鼠骨骼发育的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2019, 18(3): 271-275. doi: 10.7507/1671-6205.201805004 复制
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是全球性公共卫生问题，其特征为睡眠状态下反复发生的上气道部分或完全阻塞，引起呼吸暂停和（或）低通气，扰乱机体正常的通气功能和睡眠结构[1-2]。OSAHS 是儿童常见的呼吸系统疾病，在儿童中的发病率约为 1.2%～5.7%[3-4]。多数研究显示 OSAHS 可导致儿童生长发育迟缓，主要表现在身长、体重、神经系统等，并随着间歇性低氧的严重程度而加重[5-6]。但是目前关于 OSAHS 对骨骼生长发育的影响尚未明确。本实验通过模拟 OSAHS 发病过程中形成间歇性低氧这一主要特征，建立大鼠 OSAHS 模型，并对实验动物的生长发育指标、血清骨钙素（osteocalcin，OC）含量及骨细胞凋亡情况进行检测，以探讨间歇性低氧对大鼠骨骼生长发育的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
40 只 3～4 周龄无特定病原体级健康雄性 SD 大鼠，平均体重为（114.763±17.156）g。实验动物及饲料、垫料由兰州大学实验动物中心提供，实验前于安静环境、自然光照、温度 20～26 ℃、日温差≤4 ℃、湿度 40%～60% 条件下适应性饲养 1 周。然后按随机数字表法分为 2 组，每组 20 只。分别为常氧对照组）和间歇低氧组。本实验设计符合兰州大学第一医院实验伦理学标准。
1.2 试剂与仪器
大鼠骨钙蛋白（OT/骨钙素 BGP）酶联免疫吸附试剂盒（武汉华美生物工程有限公司），细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。医用氧气、高纯度氮气由甘肃省兰州方圆建化有限责任公司提供，CY-12C 测氧仪由浙江省建德市梅城电化学分析仪器厂提供，TKY-BMB 型石蜡包埋机由湖北泰康医疗设备有限公司提供，TKY-TK 摊片烤片机由湖北泰康医疗设备有限公司提供，免疫荧光显微镜、光学显微镜由日本 Olympus 公司提供，骨密度（bone mineral density，BMD）由美国 GE Lunar Prodigy Advance 直接数字化全自动双能 X 线骨密度仪检测。
1.3 方法
1.3.1 模型建立
参照文献[7-9]的方法设计间歇性低氧模拟舱，舱内循环冲入纯氮气、纯氧气及压缩空气。设定程序为 120 s 一个循环周期，包括低氧期（纯氮气 30 s+静息状态 10 s）、复氧期（纯氧气 20 s+压缩空气 60 s），应用测氧仪实时监测舱内氧浓度，维持低氧期舱内氧浓度在 6%～7%，并在复氧期迅速升高至 21%。相当于睡眠呼吸暂停低通气指数 30 次/h，监测舱内大鼠最低血氧饱和度可降至 65%～70%，基本可模拟中重度 OSAHS 患者夜间睡眠过程中血氧饱和度的波动情况。常氧对照组置于普通饲养舱内间歇输入压缩空气，输入时间及流量同间歇低氧组，氧浓度为 21%。每日造模 8 h（09:00–17:00），连续 28 d。造模期间温度、湿度适宜，饮水自由。
1.3.2 体格发育指标测定
实验开始当日由 3 名非本课题组成员用卷尺盲法测量大鼠颅顶到尾根的长度，取其平均值即为初始身长，同法用卷尺测量大鼠尾根部到尾尖部的长度，取其平均值即为初始尾长，同时测量每只大鼠的初始体重。两组间初始值差异无统计学意义（P>0.05）。造模结束处死动物当天测量终末体重、身长、尾长，并计算两组大鼠体重增长率、身长增长率、尾长增长率。增长率=（终末值－初始值）/初始值×100%。
1.3.3 血清骨钙素测定
实验 4 周末将空腹 12 h 的大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛麻醉后，经腹主动脉留取血液标本。采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清骨钙素浓度，严格按照试剂盒说明书操作。使用标准骨钙素的稀释液（0.312～20 pg/ml）绘制标准曲线。
1.3.4 股骨长度测定
处死大鼠后，分离每只大鼠的右侧股骨，去除附着在骨上的肌肉和结缔组织，由 3 名非本课题组成员用游标卡尺盲法测得股骨大转子和股骨颈汇合处最低点到股骨髁间窝的距离，取其平均值为股骨长度。
1.3.5 BMD 测定
取大鼠右侧股骨置于含有 10% 甲醛溶液的广口瓶中浸泡防腐，由兰州大学第一医院骨质疏松科专业测量人员采用美国 GE Lunar Prodigy Advance 直接数字化全自动双能 X 线骨密度仪检测大鼠右侧股骨 BMD 值。
1.3.6 骨细胞凋亡指数检测
取大鼠左侧股骨，去除附着在骨上的肌肉和结缔组织，4% 中性多聚甲醛固定，15% EDTA-2Na 脱钙，常规石蜡包埋切片，严格按照细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，行异硫氰酸荧光素荧光显色，凋亡的细胞其细胞核呈绿色。用已知阳性片作为阳性对照，荧光显微镜下（×400）随机选取 5 个视野采集图像，经 ImagePro Plus6.0 图像分析系统计数各类细胞数，取其平均值。凋亡指数（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.4 统计学方法
应用 SPSS 23.0 统计软件。计数资料采用均数±标准差（
±s）表示，样本均数间比较采用独立样本 t 检验，各检测指标间相关性采用 Pearson 相关分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 体格发育指标比较
两组大鼠间初始体重、身长、尾长值差异无统计学意义（P>0.05），造模 4 周后常氧对照组大鼠体重增长率、身长增长率、尾长的增长率均高于间歇低氧组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果见表 1。
表1
两组大鼠各指标结果（n=20，
）
2.2 股骨长度比较
常氧对照组大鼠右股骨长度大于间歇低氧组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果见表 1。
2.3 血清骨钙素含量比较
常氧对照组大鼠血清骨钙素浓度高于间歇低氧组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果见表 1。
2.4 BMD 水平比较
常氧对照组大鼠右股骨 BMD 高于间歇低氧组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果见表 1。
2.5 骨细胞凋亡指数比较
常氧对照组大鼠骨细胞凋亡细胞明显少于间歇低氧组，结果见图 1。且骨细胞凋亡指数显著低于间歇低氧组，差异具有统计学意义（P<0.05），结果见表 1。
图1
两组大鼠骨细胞凋亡检测结果（异硫氰酸荧光素荧光染色）
a：常氧对照组；b：间歇低氧组。常氧对照组大鼠骨细胞凋亡细胞明显少于间歇低氧组
2.6 间歇低氧组大鼠血清骨钙素与各参数的相关性分析
行 Pearson 相关分析后发现，间歇低氧组大鼠血清骨钙素含量与身长增长率、股骨长、BMD 呈显著正相关（P<0.01）。结果见表 2。
表2
血清骨钙素与各参数的相关性分析
3 讨论
OSAHS 是以间歇性低氧为主要病理过程，以多系统损害为特点的一种常见呼吸睡眠障碍性疾病。研究已证实缺氧不仅可直接影响骨细胞的功能[10-11]，而且与缺氧有关的疾病，如贫血、肾功能衰竭和慢性呼吸道疾病，常与骨质减少有关[12-13]。但 OSAHS 所致间歇性低氧与上述慢性持续性缺氧不同，其缺氧是短暂高频间歇性的，存在循环复氧/再氧化，过程类似于缺血再灌注损伤，可导致活性氧自由基氧化应激产物增多，增加交感神经活动，并伴有内皮功能障碍，与慢性持续性缺氧相较可致更严重的影响[14]。但目前对于间歇性低氧对骨代谢的调节及机制尚未清楚。有临床报告称 OSAHS 可能损害骨代谢[15-16]，亦有研究发现 OSAHS 与骨代谢之间没有任何独立的联系[17-18]，而 Sforza 等[19]的研究则表明 OSAHS 所致间歇性低氧血症可刺激骨重塑。这些临床结果相互矛盾，为排除年龄、性别、体重、健康情况等混杂因素对结果造成的偏倚，本实验模拟 OSAHS 所致的间歇性低氧条件，探讨间歇性低氧对同龄同性别健康大鼠骨骼生长发育的影响。结果显示两组大鼠于造模开始时测量的发育指标均无明显差异（P>0.05），经造模 4 周后，间歇低氧组大鼠的体重增长率、身长增长率、尾长增长率及股骨长、BMD 均低于常氧对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。由此说明该间歇性低氧条件可致大鼠生长发育迟缓，表现为体重、身长、尾长的降低，同时所致股骨长及 BMD 度的改变，说明间歇性低氧不仅影响股骨生长长度，同时影响股骨矿物质钙化。
在骨骼的生长过程中，各种内分泌因子的调节使骨组织不断进行骨形成和骨吸收，且二者处于动态变化中。我们推测间歇性低氧不仅抑制骨形成，同时促进骨吸收。而在骨形成生化因子的测试中，Peichl 等[20]证实血清骨钙素较其他五项血清和尿标记物具有显著相关性（P<0.000 1）。骨钙素又称为维生素 K 依赖骨蛋白（bone vitamin K dependent protein，BGP），是骨细胞外基质中最丰富的非胶原蛋白[21]，是反映成骨细胞活性和骨形成的特异性较强的标志物[22]。骨钙素由成骨细胞在骨基质矿化的时候合成分泌，不断促进骨形成，增强骨骼的力学性能[23]，且含量比较稳定，不受骨吸收因素的影响。故本实验用酶联免疫吸附法检测两组大鼠血清骨钙素含量来了解两组大鼠骨形成水平的差异。结果示间歇低氧组血清骨钙素水平低于常氧对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），由此说明间歇性低氧可导致血清骨钙素含量降低，在骨形成的层面上抑制骨骼生长发育。行 Pearson 相关分析后发现，间歇性低氧组大鼠血清骨钙素含量与身长增长率呈中度正相关（r=0.762，P<0.01），与股骨长、BMD 呈显著正相关（r=0.932、r=0.886，均 P<0.01）。因此认为，间歇性低氧不仅通过减少血清骨钙素的分泌抑制骨骼的形成，同时抑制骨骼矿物质的钙化、降低 BMD。
Tomiyama 等[15]研究发现 OSAHS 可导致骨吸收增强，考虑可能与缺氧、氧化应激增加和炎症这三种机制有关。而缺氧作为一种细胞应激可诱导细胞凋亡[24-25]。细胞凋亡是缺氧所致多系统损伤的重要病理生理机制[26]。我们推测间歇性低氧可诱导骨细胞凋亡，从而促进骨吸收。而本实验结果中免疫荧光显色+TUNEL 法检测两组大鼠骨细胞凋亡情况，结果显示常氧对照组阳性细胞数明显少于间歇低氧组，骨细胞凋亡指数明显低于间歇低氧组，其差异具有统计学意义（P<0.05）。该结果证实了我们的推测，说明间歇性低氧可诱导骨细胞凋亡从而导致骨吸收增加，可能是骨骼生长发育迟缓及骨质减少的重要病理生理机制。
综上所述，本实验设计中的间歇性低氧条件（120 s 循环一次、最低氧浓度 6%～7%，每天 8 h、造模 28 d）可通过减少血清骨钙素分泌及诱导骨细胞凋亡的途径，不仅抑制骨形成，同时促进骨吸收、降低 BMD，从而延缓大鼠骨骼的生长发育，包括骨骼的生长和硬化。此外，血清骨钙素可以作为检测生长发育，尤其骨骼发育（骨长度、BMD）的敏感指标，为临床预防、诊断甚至治疗 OSAHS 所致生长发育迟缓提供新的思路。
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是全球性公共卫生问题，其特征为睡眠状态下反复发生的上气道部分或完全阻塞，引起呼吸暂停和（或）低通气，扰乱机体正常的通气功能和睡眠结构[1-2]。OSAHS 是儿童常见的呼吸系统疾病，在儿童中的发病率约为 1.2%～5.7%[3-4]。多数研究显示 OSAHS 可导致儿童生长发育迟缓，主要表现在身长、体重、神经系统等，并随着间歇性低氧的严重程度而加重[5-6]。但是目前关于 OSAHS 对骨骼生长发育的影响尚未明确。本实验通过模拟 OSAHS 发病过程中形成间歇性低氧这一主要特征，建立大鼠 OSAHS 模型，并对实验动物的生长发育指标、血清骨钙素（osteocalcin，OC）含量及骨细胞凋亡情况进行检测，以探讨间歇性低氧对大鼠骨骼生长发育的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
40 只 3～4 周龄无特定病原体级健康雄性 SD 大鼠，平均体重为（114.763±17.156）g。实验动物及饲料、垫料由兰州大学实验动物中心提供，实验前于安静环境、自然光照、温度 20～26 ℃、日温差≤4 ℃、湿度 40%～60% 条件下适应性饲养 1 周。然后按随机数字表法分为 2 组，每组 20 只。分别为常氧对照组）和间歇低氧组。本实验设计符合兰州大学第一医院实验伦理学标准。
1.2 试剂与仪器
大鼠骨钙蛋白（OT/骨钙素 BGP）酶联免疫吸附试剂盒（武汉华美生物工程有限公司），细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。医用氧气、高纯度氮气由甘肃省兰州方圆建化有限责任公司提供，CY-12C 测氧仪由浙江省建德市梅城电化学分析仪器厂提供，TKY-BMB 型石蜡包埋机由湖北泰康医疗设备有限公司提供，TKY-TK 摊片烤片机由湖北泰康医疗设备有限公司提供，免疫荧光显微镜、光学显微镜由日本 Olympus 公司提供，骨密度（bone mineral density，BMD）由美国 GE Lunar Prodigy Advance 直接数字化全自动双能 X 线骨密度仪检测。
1.3 方法
1.3.1 模型建立
参照文献[7-9]的方法设计间歇性低氧模拟舱，舱内循环冲入纯氮气、纯氧气及压缩空气。设定程序为 120 s 一个循环周期，包括低氧期（纯氮气 30 s+静息状态 10 s）、复氧期（纯氧气 20 s+压缩空气 60 s），应用测氧仪实时监测舱内氧浓度，维持低氧期舱内氧浓度在 6%～7%，并在复氧期迅速升高至 21%。相当于睡眠呼吸暂停低通气指数 30 次/h，监测舱内大鼠最低血氧饱和度可降至 65%～70%，基本可模拟中重度 OSAHS 患者夜间睡眠过程中血氧饱和度的波动情况。常氧对照组置于普通饲养舱内间歇输入压缩空气，输入时间及流量同间歇低氧组，氧浓度为 21%。每日造模 8 h（09:00–17:00），连续 28 d。造模期间温度、湿度适宜，饮水自由。
1.3.2 体格发育指标测定
实验开始当日由 3 名非本课题组成员用卷尺盲法测量大鼠颅顶到尾根的长度，取其平均值即为初始身长，同法用卷尺测量大鼠尾根部到尾尖部的长度，取其平均值即为初始尾长，同时测量每只大鼠的初始体重。两组间初始值差异无统计学意义（P>0.05）。造模结束处死动物当天测量终末体重、身长、尾长，并计算两组大鼠体重增长率、身长增长率、尾长增长率。增长率=（终末值－初始值）/初始值×100%。
1.3.3 血清骨钙素测定
实验 4 周末将空腹 12 h 的大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛麻醉后，经腹主动脉留取血液标本。采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清骨钙素浓度，严格按照试剂盒说明书操作。使用标准骨钙素的稀释液（0.312～20 pg/ml）绘制标准曲线。
1.3.4 股骨长度测定
处死大鼠后，分离每只大鼠的右侧股骨，去除附着在骨上的肌肉和结缔组织，由 3 名非本课题组成员用游标卡尺盲法测得股骨大转子和股骨颈汇合处最低点到股骨髁间窝的距离，取其平均值为股骨长度。
1.3.5 BMD 测定
取大鼠右侧股骨置于含有 10% 甲醛溶液的广口瓶中浸泡防腐，由兰州大学第一医院骨质疏松科专业测量人员采用美国 GE Lunar Prodigy Advance 直接数字化全自动双能 X 线骨密度仪检测大鼠右侧股骨 BMD 值。
1.3.6 骨细胞凋亡指数检测
取大鼠左侧股骨，去除附着在骨上的肌肉和结缔组织，4% 中性多聚甲醛固定，15% EDTA-2Na 脱钙，常规石蜡包埋切片，严格按照细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，行异硫氰酸荧光素荧光显色，凋亡的细胞其细胞核呈绿色。用已知阳性片作为阳性对照，荧光显微镜下（×400）随机选取 5 个视野采集图像，经 ImagePro Plus6.0 图像分析系统计数各类细胞数，取其平均值。凋亡指数（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.4 统计学方法
应用 SPSS 23.0 统计软件。计数资料采用均数±标准差（±s）表示，样本均数间比较采用独立样本 t 检验，各检测指标间相关性采用 Pearson 相关分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 体格发育指标比较
两组大鼠间初始体重、身长、尾长值差异无统计学意义（P>0.05），造模 4 周后常氧对照组大鼠体重增长率、身长增长率、尾长的增长率均高于间歇低氧组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果见表 1。
表1
两组大鼠各指标结果（n=20，）
2.2 股骨长度比较
常氧对照组大鼠右股骨长度大于间歇低氧组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果见表 1。
2.3 血清骨钙素含量比较
常氧对照组大鼠血清骨钙素浓度高于间歇低氧组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果见表 1。
2.4 BMD 水平比较
常氧对照组大鼠右股骨 BMD 高于间歇低氧组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果见表 1。
2.5 骨细胞凋亡指数比较
常氧对照组大鼠骨细胞凋亡细胞明显少于间歇低氧组，结果见图 1。且骨细胞凋亡指数显著低于间歇低氧组，差异具有统计学意义（P<0.05），结果见表 1。
图1
两组大鼠骨细胞凋亡检测结果（异硫氰酸荧光素荧光染色）
a：常氧对照组；b：间歇低氧组。常氧对照组大鼠骨细胞凋亡细胞明显少于间歇低氧组
2.6 间歇低氧组大鼠血清骨钙素与各参数的相关性分析
行 Pearson 相关分析后发现，间歇低氧组大鼠血清骨钙素含量与身长增长率、股骨长、BMD 呈显著正相关（P<0.01）。结果见表 2。
表2
血清骨钙素与各参数的相关性分析
3 讨论
OSAHS 是以间歇性低氧为主要病理过程，以多系统损害为特点的一种常见呼吸睡眠障碍性疾病。研究已证实缺氧不仅可直接影响骨细胞的功能[10-11]，而且与缺氧有关的疾病，如贫血、肾功能衰竭和慢性呼吸道疾病，常与骨质减少有关[12-13]。但 OSAHS 所致间歇性低氧与上述慢性持续性缺氧不同，其缺氧是短暂高频间歇性的，存在循环复氧/再氧化，过程类似于缺血再灌注损伤，可导致活性氧自由基氧化应激产物增多，增加交感神经活动，并伴有内皮功能障碍，与慢性持续性缺氧相较可致更严重的影响[14]。但目前对于间歇性低氧对骨代谢的调节及机制尚未清楚。有临床报告称 OSAHS 可能损害骨代谢[15-16]，亦有研究发现 OSAHS 与骨代谢之间没有任何独立的联系[17-18]，而 Sforza 等[19]的研究则表明 OSAHS 所致间歇性低氧血症可刺激骨重塑。这些临床结果相互矛盾，为排除年龄、性别、体重、健康情况等混杂因素对结果造成的偏倚，本实验模拟 OSAHS 所致的间歇性低氧条件，探讨间歇性低氧对同龄同性别健康大鼠骨骼生长发育的影响。结果显示两组大鼠于造模开始时测量的发育指标均无明显差异（P>0.05），经造模 4 周后，间歇低氧组大鼠的体重增长率、身长增长率、尾长增长率及股骨长、BMD 均低于常氧对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。由此说明该间歇性低氧条件可致大鼠生长发育迟缓，表现为体重、身长、尾长的降低，同时所致股骨长及 BMD 度的改变，说明间歇性低氧不仅影响股骨生长长度，同时影响股骨矿物质钙化。
在骨骼的生长过程中，各种内分泌因子的调节使骨组织不断进行骨形成和骨吸收，且二者处于动态变化中。我们推测间歇性低氧不仅抑制骨形成，同时促进骨吸收。而在骨形成生化因子的测试中，Peichl 等[20]证实血清骨钙素较其他五项血清和尿标记物具有显著相关性（P<0.000 1）。骨钙素又称为维生素 K 依赖骨蛋白（bone vitamin K dependent protein，BGP），是骨细胞外基质中最丰富的非胶原蛋白[21]，是反映成骨细胞活性和骨形成的特异性较强的标志物[22]。骨钙素由成骨细胞在骨基质矿化的时候合成分泌，不断促进骨形成，增强骨骼的力学性能[23]，且含量比较稳定，不受骨吸收因素的影响。故本实验用酶联免疫吸附法检测两组大鼠血清骨钙素含量来了解两组大鼠骨形成水平的差异。结果示间歇低氧组血清骨钙素水平低于常氧对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），由此说明间歇性低氧可导致血清骨钙素含量降低，在骨形成的层面上抑制骨骼生长发育。行 Pearson 相关分析后发现，间歇性低氧组大鼠血清骨钙素含量与身长增长率呈中度正相关（r=0.762，P<0.01），与股骨长、BMD 呈显著正相关（r=0.932、r=0.886，均 P<0.01）。因此认为，间歇性低氧不仅通过减少血清骨钙素的分泌抑制骨骼的形成，同时抑制骨骼矿物质的钙化、降低 BMD。
Tomiyama 等[15]研究发现 OSAHS 可导致骨吸收增强，考虑可能与缺氧、氧化应激增加和炎症这三种机制有关。而缺氧作为一种细胞应激可诱导细胞凋亡[24-25]。细胞凋亡是缺氧所致多系统损伤的重要病理生理机制[26]。我们推测间歇性低氧可诱导骨细胞凋亡，从而促进骨吸收。而本实验结果中免疫荧光显色+TUNEL 法检测两组大鼠骨细胞凋亡情况，结果显示常氧对照组阳性细胞数明显少于间歇低氧组，骨细胞凋亡指数明显低于间歇低氧组，其差异具有统计学意义（P<0.05）。该结果证实了我们的推测，说明间歇性低氧可诱导骨细胞凋亡从而导致骨吸收增加，可能是骨骼生长发育迟缓及骨质减少的重要病理生理机制。
综上所述，本实验设计中的间歇性低氧条件（120 s 循环一次、最低氧浓度 6%～7%，每天 8 h、造模 28 d）可通过减少血清骨钙素分泌及诱导骨细胞凋亡的途径，不仅抑制骨形成，同时促进骨吸收、降低 BMD，从而延缓大鼠骨骼的生长发育，包括骨骼的生长和硬化。此外，血清骨钙素可以作为检测生长发育，尤其骨骼发育（骨长度、BMD）的敏感指标，为临床预防、诊断甚至治疗 OSAHS 所致生长发育迟缓提供新的思路。
