引用本文： 於海洋, 李妍, 韩锋锋, 罗勇, 徐卫国. 慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织自噬相关蛋白的变化. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(5): 470-476. doi: 10.7507/1671-6205.2016110 复制
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是呼吸系统疾病常见病和多发病，不仅表现为肺部通气功能障碍，还常常合并体重减轻、营养不良、骨骼肌萎缩等肺外表现，严重影响患者的劳动力和生活质量，给社会造成巨大的经济负担[1-2]。因此预防和治疗慢阻肺已经成为一个不可忽视的公众话题。以前认为慢阻肺的发病机制包括氧化应激、气道慢性炎症、蛋白酶抗蛋白酶失衡、细胞凋亡等[3]。我们前期研究慢阻肺与骨骼肌营养代谢时发现慢阻肺大鼠趾长伸肌组织内PI3K/AKT/mTOR信号通路被激活，可能是骨骼肌萎缩的代偿机制之一[4]。进一步研究发现自噬系统作为降解途径也参与骨骼肌萎缩，并且与泛素系统之间有一定联系[5]。近年来越来越多的研究表明自噬在慢阻肺的发生发展中也具有重要的作用。自噬是真核生物处于缺氧、饥饿或感染时，在自噬相关基因的调控下，利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质，为细胞修复、更新提供原料与营养，保持能量稳态的过程，是有别于凋亡的另一种程序性死亡机制，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路是影响细胞自噬重要的信号通路[6-7]。那么慢阻肺大鼠肺组织自噬过程中上游蛋白PI3K、AKT、mTOR及自噬基因相关蛋白是如何表达的呢？因此，本研究建立慢阻肺大鼠肺模型，检测自噬上游蛋白PI3K、AKT、mTOR及自噬基因相关蛋白的表达，探讨在慢阻肺大鼠肺组织中自噬水平及自噬相关蛋白的变化。
材料与方法
一 材料
雄性大鼠24只，6周龄，体重150~200 g[上海西普尔-必凯试验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2003-0002，使用许可证号：SYXK(沪)2003-0031]。采用随机数字表方法分为两组：对照组(12只)和慢阻肺组(12只)。大前门香烟(尼古丁含量0.9 mg，焦油含量12 mg，烟草碱含量14 mg)，购自上海烟草公司。微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain-3B，LC3B)抗体、Atg5抗体购自Abcam。p-AKT抗体、AKT抗体、p-mTOR抗体、mTOR抗体、Beclin-1抗体、P62抗体购自CST。GAPDH抗体、辣根过氧化物酶山羊抗兔、辣根过氧化物酶山羊抗小鼠购自碧云天。逆转录试剂盒[TakaRa，宝生物工程(大连)有限公司]。大鼠白细胞介素6(IL-6)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(达科为，中国)，大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒(达科为，中国)。
二 方法
1．慢阻肺模型的构建：采用香烟烟熏法建立慢阻肺大鼠模型，慢阻肺组每6只SD大鼠置于熏烟箱(体积50 cm×40 cm×30 cm)，被动地接受香烟烟雾暴露。每天被动吸烟2次、每次4个循环，每个循环4支大前门香烟，每周6次，持续12周。对照组吸入正常空气。12周后，应用小动物肺功能仪(BUXCO，美国)测定两组大鼠肺功能情况。肺功能检测结束后，用戊巴比妥钠0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉。
2．慢阻肺模型的鉴定
(1)支气管肺泡灌洗液(BALF)制备：暴露气管及胸腔，在环形软骨上方行“V”型切口，用静脉留置针插管至隆突上，连接5 mL注射器，用3 mL预冷PBS液灌洗肺组织共3次，回收灌洗液。离心收集上清、置于-80 ℃保存。
(2)肺组织的提取：打开胸腔，心脏采血后留取大鼠左肺叶。小心地用镊子将大鼠左侧肺叶分离，用刀片从矢状面切取约2 mm厚度的肺组织的中外侧带，迅速转移至4%的多聚甲醛中固定48 h后行石蜡包埋切片制备，其余组织放入冻存管中，放入-80 ℃，留做后续实验。
(3)肺组织病理切片的制备：将已固定好的肺组织，标本常规脱水、石蜡包埋、二甲苯脱蜡、经各级乙醇至水洗，然后经苏木素-伊红(HE)染色、常规脱水、透明、封片，显微镜下观察。
(4)ELISA测定BALF中炎症因子IL-6、TNF-α的表达：按照ELLSA试剂盒所提供的操作指南进行操作，将不同浓度的标准品和样品加入相应的孔中，37 ℃孵育2 h，洗板。然后依次加入辣根过氧化物酶工作液、标准色液、终止液，用自动酶标仪处在30 min内读取光密度值(OD)。根据标准曲线计算待测样品的IL-6、TNF-α的含量。
3.免疫组织化学LC3B染色：将肺组织切片70 ℃烤箱中烤片60 min，组织切片依次经二甲苯与梯度酒精脱蜡与水化，使用3%过氧化氢内源性过氧化物酶阻断8 min，切片置入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液溶液中，然后放入微波炉15 min中进行抗原修复，稀释一抗浓度为LC3B(1 :800), 添加一抗，4 ℃孵育过夜，滴加二抗并置入37 ℃恒温箱中孵育30 min，然后再经过DAB显色、流水冲洗玻片、苏木素复染、盐酸中分化、碳酸锂中蓝化、梯度酒精脱水、二甲苯透明、晾干玻片、中性树胶封片等步骤后显微镜下观察结果。
4.RT-PCR检测肺组织中Atg5、Beclin1、Atg12、Atg7的mRNA表达：取相同质量50 mg的大鼠肺组织放入匀浆器中，加入1 mL Trziol提取RNA，测定RNA浓度。反向转录成cDNA，以cDNA为模板，采用SYBR Green进行实时荧光PCR反应，反应参数：95 ℃ 30s1个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s为40个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，15s1个循环，内参为GAPDH，样本中目的基因的计算方法为2-ΔΔCt。引物序列见表 1。
表1
引物序列
5.Western blot检测PI3K、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT和LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5、P62的表达：取相同质量30 mg的肺组织提取蛋白，放入匀浆器内，加入300 μL裂解液[RIPA裂解液中加入PMSF(100 :1)和罗氏磷酸酶抑制剂(100 :10)]，然后研磨使组织块消失，裂解液无沉淀，冰上裂解30 min。14 000 r/min离心20 min，取上清为细胞总蛋白。BCA法蛋白定量，于6%~12%SDS-PAGE行组织蛋白电泳，转于PVDF膜上，根据目的蛋白选择相应的条带，5%脱脂奶粉封闭2 h，洗膜后加入2 mL稀释后的一抗(一抗/一抗稀释液1 :1 000)，4 ℃过夜。第2 d一抗复温30 min后，孵HRE标记的二抗1 h，暗室中加入显影液曝光。PVDF膜用Bio-Rad全自动凝胶成像系统GellDocXR+成像，结果经Image LabTM软件分析，进行灰度分析。
三 统计学处理
应用GraphPad Prism5统计软件对实验数据进行统计学分析，数据以x±s表示，两样本计量资料采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
一 体重变化
烟熏0周和烟熏4周时慢阻肺组和正常组大鼠的平均体重差异无统计学意义，烟熏8周时慢阻肺组大鼠体重低于对照组大鼠体重(P＜0.05)。烟熏12周时慢阻肺组大鼠体重明显低于正常组大鼠体重(P＜0.01)。结果见图 1。
图1
大鼠体重的变化
与正常组比较，*
二 肺功能变化
两组肺功能各项指标慢阻肺组较正常组下降(P＜0.01)。结果见表 1。
表1
两组大鼠肺功能结果(x±s)
三 大鼠BALF上清中IL-6、TNF-α的表达
慢阻肺组与正常组相比，BALF上清中IL-6及TNF-α表达明显增高，有统计学意义。其中TNF-α的P＜0.01。结果见图 2。
图2
大鼠BALF上清中的IL-6、TNF-α的表达
与正常组比较，*
四 肺组织形态学改变
肺组织石蜡切片HE染色，正常组大鼠肺组织结构清晰，支气管黏膜上皮完整，未见炎性细胞浸润，未见腺体增生。慢阻肺组大鼠可见明显的肺组织结构破坏，肺气肿形成，肺实质有肺泡管、肺泡腔不规则扩大，气道周围炎性细胞浸润明显，有腺体增生，部分中小血管有血管壁增厚改变。结果见图 3。
图3
大鼠肺组织病理像(×200) a.正常组；b.慢阻肺组
五 肺组织石蜡切片中LC3B免疫组化
LC3B蛋白表达在肺上皮细胞胞浆中，与正常组大鼠相比，可见慢阻肺组大鼠肺上皮细胞LC3B表达增加。结果见图 4。
图4
鼠肺组织免疫组织化学病理像(×200) a.正常组；b.慢阻肺组
六 自噬相关基因Beclin1、Atg5、Atg12、Atg7的mRNA表达变化
RT-PCR结果分析显示慢阻肺组大鼠肺组织中自噬相关基因Beclin1、Atg5、Atg12的mRNA显著高于正常组大鼠(其中Atg5及Beclin1两组比较P＜0.01，Atg12两组比较P＜0.05)。Atg7表达两组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。结果见图 5。
图5
大鼠肺组织内beclin1、Atg5、Atg12、Atg7的mRNA表达
与正常组比较，*
七 PI3K、t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR蛋白及自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、P62的蛋白表达变化
Western blot分析结果显示，PI3K蛋白、p-AKT/ t-AKT及p-mTOR/ t-mTOR蛋白表达慢阻肺组显著低于正常组(P＜0.05)，自噬相关基因Beclin1、Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达慢阻肺组显著高于正常组(P＜0.05，其中Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ两组之间比较P＜0.01)，P62蛋白表达慢阻肺组显著低于正常组(P＜0.01)。结果见图 6~8。
图6
大鼠肺组织内PI3K的蛋白表达
与正常组比较，*
图7
大鼠肺组织内t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR的蛋白表达
与正常组比较，*
图8
大鼠肺组织内LC3B、Beclin1、Atg5、P62的蛋白表达
与正常组比较，*
讨论
慢阻肺是呼吸系统中的常见病和多发病，是一组气流受限为特征的肺部疾病，气流受限不完全可逆，患病率和病死率居高不下。慢阻肺的病理改变主要表现为慢性支气管炎及肺气肿的病理变化。慢性支气管炎主要表现为支气管黏膜上皮细胞变性、坏死，溃疡形成，纤毛倒伏、变短甚至部分脱落，支气管腺体肥大增生，杯状细胞增生，黏液分泌增多。肺气肿的病理改变可见肺泡壁变薄，肺泡腔扩大，细支气管壁有炎症细胞浸润[8]。慢阻肺通常表现为肺功能进行性减退，严重影响患者的劳动力和生存质量。慢阻肺已造成巨大的社会和经济负担，根据世界卫生组织发表的研究，至2020年慢阻肺将成为世界疾病经济负担的第三名[9]。目前，研究表明慢阻肺的发病机制包括慢性炎症、氧化应激、蛋白酶抗蛋白酶失衡、细胞凋亡、细胞衰老等[3]。但是，现在对于慢阻肺并没有有效的药物治疗可以阻止疾病的进展。近年来细胞自噬与疾病的关系成为研究的热点，已有研究表明自噬是许多疾病的发病机制，包括癌症、神经退行性病变、炎症性肠病等[10]。Chen等[11]首次提出自噬的增加导致的细胞死亡增加可能是慢阻肺的发病机制。其研究发现与正常人相比，慢阻肺患者自噬小体形成增加。除此之外，自噬相关基因Atg4、Atg5-12复合物、Atg7表达增加，自噬水平增加。选择性敲除小鼠中调节自噬的关键基因LC3B和Beclin，可以发现与野生型小鼠相比，基因敲除的小鼠烟熏后凋亡基因表达减少，小鼠肺气肿减轻，证明在慢阻肺的发展过程中存在自噬水平的改变。同样，我们的研究也发现，相对于正常SD大鼠，烟熏法制备的慢阻肺大鼠肺组织自噬相关基因Beclin1、Atg5、Atg12、LC3Ⅱ/Ⅰ表达量增加，自噬水平增高。以上表明在慢阻肺疾病中，自噬水平增加，提示自噬可能参与慢阻肺疾病的发生发展。
自噬是一个溶酶体依赖的降解途径，对于细胞生存、变异、发展和稳态都有重要的意义[12]。细胞在饥饿的情况下，自噬系统被激活，自噬小体形成，降解蛋白质，为延长细胞寿命提供营养物质。自噬可被内、外源性的刺激激活，在维持细胞稳态和抵御有害刺激的过程中起重要的作用[13-14]。BCL-2作用蛋白Beclin1(在酵母中为Atg6)和LC3B(Atg8)已经作为调节哺乳动物自噬的主要调控基因。其中，微管相关蛋白1轻链3(LC3)是重要的自噬体标志性蛋白，当自噬启动后，胞质型LC3(即LC3Ⅰ)转位到自噬体膜(即LC3Ⅱ)已经被认为是自噬体形成的标志物。除此之外，其他的自噬相关蛋白也被发现，如Atg5、Atg12、Atg7等在自噬的诱导和进展过程中都有自己独特的作用，已证明Atg5-Atg12参与自噬体膜的形成[15]。我们的研究发现，相对于正常组大鼠，慢阻肺大鼠P62蛋白表达减少。P62又称SQSTM1，是一种泛素结合蛋白，在自噬过程中具有重要的作用。P62可与LC3Ⅱ结合形成复合物，并将待降解的蛋白质转入自噬溶酶体中，然后被降解。当自噬发生时，自噬溶酶体中的蛋白质会被降解，P62也会逐渐减少；而自噬降解的功能缺陷时，则自噬溶酶体无法降解，P62的降解水平下降，引起P62累积。P62蛋白水平与自噬活性成反比，是检测自噬活性的一个标志蛋白[16-17]。
PI3K/AKT是一条经典的存活细胞通路，在细胞凋亡和肿瘤发生过程中发挥着重要作用[18]。PI3K可以通过其下游分子AKT磷酸化发挥作用。近年来，许多研究证明了PI3K/AKT信号通路可以通过下游分子mTOR来调节自噬。Saiki等[19]发现咖啡因可以通过抑制PI3K/AKT/p70S6K通路的表达，增加自噬水平。Heras-Sandoval等[20]证明在神经系统疾病中，PI3K/AKT/mTOR通路通过调节自噬来清除积聚的蛋白。Fan等[21]同样发现PI3K/AKT/mTOR通路参与了Aβ25-35诱导的自噬。我们的研究也发现，相对于正常SD大鼠，烟熏法制备的慢阻肺大鼠肺组织，PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达量下降，伴随着自噬水平的增高。mTOR是调节细胞生长和增殖的重要细胞因子，在与营养分子有关的信号转导、蛋白质翻译调控、细胞周期进展等过程中都占据重要地位；同时，它也是自噬启动阶段的关键调节因子，活化后可抑制自噬发生[22]。mTOR的功能主要通过调节mTOR复合物1(mTORC1)和mTORC2。mTORC1对自噬主要是负性调节而且是细胞生长发育、分化和生存的主要调节点。该自噬途径启动受营养剥夺、胰岛素和其他生长因子等刺激因素的影响，这些因素可以与酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase, RTK)结合而导致该受体激活，从而诱导其下游信号级联启动涉及磷酸化胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)，IRS1的激活则直接导致Ⅰ类PI3K的激活，继而激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB, 即Akt)，最终激活mTOR。而mTOR的激活可直接抑制自噬的启动，通过调控自噬相关基因(autophagic related genes, Atgs)，磷酸化Atg13，导致其不能与Atg1结合，从而阻断自噬[23]。
在本次研究中我们通过免疫组织化学等方法检测慢阻肺大鼠肺组织LC3B蛋白的表达，通过Western blot及RT-PCR等方法，检测PI3K/AKT/mTOR通路及自噬相关基因LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1、P62、Atg7、Atg12的表达。结果显示：烟熏12周的慢阻肺大鼠肺组织中LC3B表达高于正常组，自噬上游蛋白PI3K、AKT、mTOR表达降低，自噬相关基因表达增高，自噬水平增加。但关于自噬对于肺组织到底是一种保护机制还是损伤机制，目前仍有争议。有研究表明，在慢阻肺疾病早期患者肺上皮中可以检测出大量的自噬蛋白及自噬标记物，而在疾病的后期才能检测出与凋亡相关的酶，自噬表达减低[11]。这些表明在肺疾病的早期自噬是保护机制，但在疾病的后期，过度的自噬可以诱导凋亡，自噬与凋亡的关系密切相关。更有研究表明PI3K/AKT/mTOR通路参与自噬诱导的凋亡[24-25]。故更加深入的研究自噬对于慢阻肺疾病具有重要的意义，可为疾病的治疗提供新靶向。
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是呼吸系统疾病常见病和多发病，不仅表现为肺部通气功能障碍，还常常合并体重减轻、营养不良、骨骼肌萎缩等肺外表现，严重影响患者的劳动力和生活质量，给社会造成巨大的经济负担[1-2]。因此预防和治疗慢阻肺已经成为一个不可忽视的公众话题。以前认为慢阻肺的发病机制包括氧化应激、气道慢性炎症、蛋白酶抗蛋白酶失衡、细胞凋亡等[3]。我们前期研究慢阻肺与骨骼肌营养代谢时发现慢阻肺大鼠趾长伸肌组织内PI3K/AKT/mTOR信号通路被激活，可能是骨骼肌萎缩的代偿机制之一[4]。进一步研究发现自噬系统作为降解途径也参与骨骼肌萎缩，并且与泛素系统之间有一定联系[5]。近年来越来越多的研究表明自噬在慢阻肺的发生发展中也具有重要的作用。自噬是真核生物处于缺氧、饥饿或感染时，在自噬相关基因的调控下，利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质，为细胞修复、更新提供原料与营养，保持能量稳态的过程，是有别于凋亡的另一种程序性死亡机制，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路是影响细胞自噬重要的信号通路[6-7]。那么慢阻肺大鼠肺组织自噬过程中上游蛋白PI3K、AKT、mTOR及自噬基因相关蛋白是如何表达的呢？因此，本研究建立慢阻肺大鼠肺模型，检测自噬上游蛋白PI3K、AKT、mTOR及自噬基因相关蛋白的表达，探讨在慢阻肺大鼠肺组织中自噬水平及自噬相关蛋白的变化。
材料与方法
一 材料
雄性大鼠24只，6周龄，体重150~200 g[上海西普尔-必凯试验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2003-0002，使用许可证号：SYXK(沪)2003-0031]。采用随机数字表方法分为两组：对照组(12只)和慢阻肺组(12只)。大前门香烟(尼古丁含量0.9 mg，焦油含量12 mg，烟草碱含量14 mg)，购自上海烟草公司。微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain-3B，LC3B)抗体、Atg5抗体购自Abcam。p-AKT抗体、AKT抗体、p-mTOR抗体、mTOR抗体、Beclin-1抗体、P62抗体购自CST。GAPDH抗体、辣根过氧化物酶山羊抗兔、辣根过氧化物酶山羊抗小鼠购自碧云天。逆转录试剂盒[TakaRa，宝生物工程(大连)有限公司]。大鼠白细胞介素6(IL-6)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(达科为，中国)，大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒(达科为，中国)。
二 方法
1．慢阻肺模型的构建：采用香烟烟熏法建立慢阻肺大鼠模型，慢阻肺组每6只SD大鼠置于熏烟箱(体积50 cm×40 cm×30 cm)，被动地接受香烟烟雾暴露。每天被动吸烟2次、每次4个循环，每个循环4支大前门香烟，每周6次，持续12周。对照组吸入正常空气。12周后，应用小动物肺功能仪(BUXCO，美国)测定两组大鼠肺功能情况。肺功能检测结束后，用戊巴比妥钠0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉。
2．慢阻肺模型的鉴定
(1)支气管肺泡灌洗液(BALF)制备：暴露气管及胸腔，在环形软骨上方行“V”型切口，用静脉留置针插管至隆突上，连接5 mL注射器，用3 mL预冷PBS液灌洗肺组织共3次，回收灌洗液。离心收集上清、置于-80 ℃保存。
(2)肺组织的提取：打开胸腔，心脏采血后留取大鼠左肺叶。小心地用镊子将大鼠左侧肺叶分离，用刀片从矢状面切取约2 mm厚度的肺组织的中外侧带，迅速转移至4%的多聚甲醛中固定48 h后行石蜡包埋切片制备，其余组织放入冻存管中，放入-80 ℃，留做后续实验。
(3)肺组织病理切片的制备：将已固定好的肺组织，标本常规脱水、石蜡包埋、二甲苯脱蜡、经各级乙醇至水洗，然后经苏木素-伊红(HE)染色、常规脱水、透明、封片，显微镜下观察。
(4)ELISA测定BALF中炎症因子IL-6、TNF-α的表达：按照ELLSA试剂盒所提供的操作指南进行操作，将不同浓度的标准品和样品加入相应的孔中，37 ℃孵育2 h，洗板。然后依次加入辣根过氧化物酶工作液、标准色液、终止液，用自动酶标仪处在30 min内读取光密度值(OD)。根据标准曲线计算待测样品的IL-6、TNF-α的含量。
3.免疫组织化学LC3B染色：将肺组织切片70 ℃烤箱中烤片60 min，组织切片依次经二甲苯与梯度酒精脱蜡与水化，使用3%过氧化氢内源性过氧化物酶阻断8 min，切片置入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液溶液中，然后放入微波炉15 min中进行抗原修复，稀释一抗浓度为LC3B(1 :800), 添加一抗，4 ℃孵育过夜，滴加二抗并置入37 ℃恒温箱中孵育30 min，然后再经过DAB显色、流水冲洗玻片、苏木素复染、盐酸中分化、碳酸锂中蓝化、梯度酒精脱水、二甲苯透明、晾干玻片、中性树胶封片等步骤后显微镜下观察结果。
4.RT-PCR检测肺组织中Atg5、Beclin1、Atg12、Atg7的mRNA表达：取相同质量50 mg的大鼠肺组织放入匀浆器中，加入1 mL Trziol提取RNA，测定RNA浓度。反向转录成cDNA，以cDNA为模板，采用SYBR Green进行实时荧光PCR反应，反应参数：95 ℃ 30s1个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s为40个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，15s1个循环，内参为GAPDH，样本中目的基因的计算方法为2-ΔΔCt。引物序列见表 1。
表1
引物序列
5.Western blot检测PI3K、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT和LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5、P62的表达：取相同质量30 mg的肺组织提取蛋白，放入匀浆器内，加入300 μL裂解液[RIPA裂解液中加入PMSF(100 :1)和罗氏磷酸酶抑制剂(100 :10)]，然后研磨使组织块消失，裂解液无沉淀，冰上裂解30 min。14 000 r/min离心20 min，取上清为细胞总蛋白。BCA法蛋白定量，于6%~12%SDS-PAGE行组织蛋白电泳，转于PVDF膜上，根据目的蛋白选择相应的条带，5%脱脂奶粉封闭2 h，洗膜后加入2 mL稀释后的一抗(一抗/一抗稀释液1 :1 000)，4 ℃过夜。第2 d一抗复温30 min后，孵HRE标记的二抗1 h，暗室中加入显影液曝光。PVDF膜用Bio-Rad全自动凝胶成像系统GellDocXR+成像，结果经Image LabTM软件分析，进行灰度分析。
三 统计学处理
应用GraphPad Prism5统计软件对实验数据进行统计学分析，数据以x±s表示，两样本计量资料采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
一 体重变化
烟熏0周和烟熏4周时慢阻肺组和正常组大鼠的平均体重差异无统计学意义，烟熏8周时慢阻肺组大鼠体重低于对照组大鼠体重(P＜0.05)。烟熏12周时慢阻肺组大鼠体重明显低于正常组大鼠体重(P＜0.01)。结果见图 1。
图1
大鼠体重的变化
与正常组比较，*
二 肺功能变化
两组肺功能各项指标慢阻肺组较正常组下降(P＜0.01)。结果见表 1。
表1
两组大鼠肺功能结果(x±s)
三 大鼠BALF上清中IL-6、TNF-α的表达
慢阻肺组与正常组相比，BALF上清中IL-6及TNF-α表达明显增高，有统计学意义。其中TNF-α的P＜0.01。结果见图 2。
图2
大鼠BALF上清中的IL-6、TNF-α的表达
与正常组比较，*
四 肺组织形态学改变
肺组织石蜡切片HE染色，正常组大鼠肺组织结构清晰，支气管黏膜上皮完整，未见炎性细胞浸润，未见腺体增生。慢阻肺组大鼠可见明显的肺组织结构破坏，肺气肿形成，肺实质有肺泡管、肺泡腔不规则扩大，气道周围炎性细胞浸润明显，有腺体增生，部分中小血管有血管壁增厚改变。结果见图 3。
图3
大鼠肺组织病理像(×200) a.正常组；b.慢阻肺组
五 肺组织石蜡切片中LC3B免疫组化
LC3B蛋白表达在肺上皮细胞胞浆中，与正常组大鼠相比，可见慢阻肺组大鼠肺上皮细胞LC3B表达增加。结果见图 4。
图4
鼠肺组织免疫组织化学病理像(×200) a.正常组；b.慢阻肺组
六 自噬相关基因Beclin1、Atg5、Atg12、Atg7的mRNA表达变化
RT-PCR结果分析显示慢阻肺组大鼠肺组织中自噬相关基因Beclin1、Atg5、Atg12的mRNA显著高于正常组大鼠(其中Atg5及Beclin1两组比较P＜0.01，Atg12两组比较P＜0.05)。Atg7表达两组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。结果见图 5。
图5
大鼠肺组织内beclin1、Atg5、Atg12、Atg7的mRNA表达
与正常组比较，*
七 PI3K、t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR蛋白及自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、P62的蛋白表达变化
Western blot分析结果显示，PI3K蛋白、p-AKT/ t-AKT及p-mTOR/ t-mTOR蛋白表达慢阻肺组显著低于正常组(P＜0.05)，自噬相关基因Beclin1、Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达慢阻肺组显著高于正常组(P＜0.05，其中Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ两组之间比较P＜0.01)，P62蛋白表达慢阻肺组显著低于正常组(P＜0.01)。结果见图 6~8。
图6
大鼠肺组织内PI3K的蛋白表达
与正常组比较，*
图7
大鼠肺组织内t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR的蛋白表达
与正常组比较，*
图8
大鼠肺组织内LC3B、Beclin1、Atg5、P62的蛋白表达
与正常组比较，*
讨论
慢阻肺是呼吸系统中的常见病和多发病，是一组气流受限为特征的肺部疾病，气流受限不完全可逆，患病率和病死率居高不下。慢阻肺的病理改变主要表现为慢性支气管炎及肺气肿的病理变化。慢性支气管炎主要表现为支气管黏膜上皮细胞变性、坏死，溃疡形成，纤毛倒伏、变短甚至部分脱落，支气管腺体肥大增生，杯状细胞增生，黏液分泌增多。肺气肿的病理改变可见肺泡壁变薄，肺泡腔扩大，细支气管壁有炎症细胞浸润[8]。慢阻肺通常表现为肺功能进行性减退，严重影响患者的劳动力和生存质量。慢阻肺已造成巨大的社会和经济负担，根据世界卫生组织发表的研究，至2020年慢阻肺将成为世界疾病经济负担的第三名[9]。目前，研究表明慢阻肺的发病机制包括慢性炎症、氧化应激、蛋白酶抗蛋白酶失衡、细胞凋亡、细胞衰老等[3]。但是，现在对于慢阻肺并没有有效的药物治疗可以阻止疾病的进展。近年来细胞自噬与疾病的关系成为研究的热点，已有研究表明自噬是许多疾病的发病机制，包括癌症、神经退行性病变、炎症性肠病等[10]。Chen等[11]首次提出自噬的增加导致的细胞死亡增加可能是慢阻肺的发病机制。其研究发现与正常人相比，慢阻肺患者自噬小体形成增加。除此之外，自噬相关基因Atg4、Atg5-12复合物、Atg7表达增加，自噬水平增加。选择性敲除小鼠中调节自噬的关键基因LC3B和Beclin，可以发现与野生型小鼠相比，基因敲除的小鼠烟熏后凋亡基因表达减少，小鼠肺气肿减轻，证明在慢阻肺的发展过程中存在自噬水平的改变。同样，我们的研究也发现，相对于正常SD大鼠，烟熏法制备的慢阻肺大鼠肺组织自噬相关基因Beclin1、Atg5、Atg12、LC3Ⅱ/Ⅰ表达量增加，自噬水平增高。以上表明在慢阻肺疾病中，自噬水平增加，提示自噬可能参与慢阻肺疾病的发生发展。
自噬是一个溶酶体依赖的降解途径，对于细胞生存、变异、发展和稳态都有重要的意义[12]。细胞在饥饿的情况下，自噬系统被激活，自噬小体形成，降解蛋白质，为延长细胞寿命提供营养物质。自噬可被内、外源性的刺激激活，在维持细胞稳态和抵御有害刺激的过程中起重要的作用[13-14]。BCL-2作用蛋白Beclin1(在酵母中为Atg6)和LC3B(Atg8)已经作为调节哺乳动物自噬的主要调控基因。其中，微管相关蛋白1轻链3(LC3)是重要的自噬体标志性蛋白，当自噬启动后，胞质型LC3(即LC3Ⅰ)转位到自噬体膜(即LC3Ⅱ)已经被认为是自噬体形成的标志物。除此之外，其他的自噬相关蛋白也被发现，如Atg5、Atg12、Atg7等在自噬的诱导和进展过程中都有自己独特的作用，已证明Atg5-Atg12参与自噬体膜的形成[15]。我们的研究发现，相对于正常组大鼠，慢阻肺大鼠P62蛋白表达减少。P62又称SQSTM1，是一种泛素结合蛋白，在自噬过程中具有重要的作用。P62可与LC3Ⅱ结合形成复合物，并将待降解的蛋白质转入自噬溶酶体中，然后被降解。当自噬发生时，自噬溶酶体中的蛋白质会被降解，P62也会逐渐减少；而自噬降解的功能缺陷时，则自噬溶酶体无法降解，P62的降解水平下降，引起P62累积。P62蛋白水平与自噬活性成反比，是检测自噬活性的一个标志蛋白[16-17]。
PI3K/AKT是一条经典的存活细胞通路，在细胞凋亡和肿瘤发生过程中发挥着重要作用[18]。PI3K可以通过其下游分子AKT磷酸化发挥作用。近年来，许多研究证明了PI3K/AKT信号通路可以通过下游分子mTOR来调节自噬。Saiki等[19]发现咖啡因可以通过抑制PI3K/AKT/p70S6K通路的表达，增加自噬水平。Heras-Sandoval等[20]证明在神经系统疾病中，PI3K/AKT/mTOR通路通过调节自噬来清除积聚的蛋白。Fan等[21]同样发现PI3K/AKT/mTOR通路参与了Aβ25-35诱导的自噬。我们的研究也发现，相对于正常SD大鼠，烟熏法制备的慢阻肺大鼠肺组织，PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达量下降，伴随着自噬水平的增高。mTOR是调节细胞生长和增殖的重要细胞因子，在与营养分子有关的信号转导、蛋白质翻译调控、细胞周期进展等过程中都占据重要地位；同时，它也是自噬启动阶段的关键调节因子，活化后可抑制自噬发生[22]。mTOR的功能主要通过调节mTOR复合物1(mTORC1)和mTORC2。mTORC1对自噬主要是负性调节而且是细胞生长发育、分化和生存的主要调节点。该自噬途径启动受营养剥夺、胰岛素和其他生长因子等刺激因素的影响，这些因素可以与酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase, RTK)结合而导致该受体激活，从而诱导其下游信号级联启动涉及磷酸化胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)，IRS1的激活则直接导致Ⅰ类PI3K的激活，继而激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB, 即Akt)，最终激活mTOR。而mTOR的激活可直接抑制自噬的启动，通过调控自噬相关基因(autophagic related genes, Atgs)，磷酸化Atg13，导致其不能与Atg1结合，从而阻断自噬[23]。
在本次研究中我们通过免疫组织化学等方法检测慢阻肺大鼠肺组织LC3B蛋白的表达，通过Western blot及RT-PCR等方法，检测PI3K/AKT/mTOR通路及自噬相关基因LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1、P62、Atg7、Atg12的表达。结果显示：烟熏12周的慢阻肺大鼠肺组织中LC3B表达高于正常组，自噬上游蛋白PI3K、AKT、mTOR表达降低，自噬相关基因表达增高，自噬水平增加。但关于自噬对于肺组织到底是一种保护机制还是损伤机制，目前仍有争议。有研究表明，在慢阻肺疾病早期患者肺上皮中可以检测出大量的自噬蛋白及自噬标记物，而在疾病的后期才能检测出与凋亡相关的酶，自噬表达减低[11]。这些表明在肺疾病的早期自噬是保护机制，但在疾病的后期，过度的自噬可以诱导凋亡，自噬与凋亡的关系密切相关。更有研究表明PI3K/AKT/mTOR通路参与自噬诱导的凋亡[24-25]。故更加深入的研究自噬对于慢阻肺疾病具有重要的意义，可为疾病的治疗提供新靶向。
