引用本文： 杨海华, 龙丰, 李圣青, 张霞, 金先桥. 1,25-(OH)2D3 对激素抵抗型哮喘患者 T 淋巴细胞 JNK/AP-1 和糖皮质激素受体的影响 . 中国呼吸与危重监护杂志, 2017, 16(2): 155-159. doi: 10.7507/1671-6205.201610033 复制
哮喘是一种常见的呼吸道疾病，严重危害人们的身心健康，糖皮质激素是治疗哮喘急性发作的重要药物。在临床工作中，激素抵抗型支气管哮喘（简称 SR 哮喘，约占哮喘患者的5%～10%）因反复急性发作，应用较大剂量的糖皮质激素治疗效果差，耗费了哮喘患者中超过 50% 的医疗资源[1-2]。T淋巴细胞是哮喘发病机制中的主要炎症细胞，糖皮质激素能抑制 T 淋巴细胞等炎症细胞的致炎作用；T 淋巴细胞对糖皮质激素的抗炎作用反应性低下是临床糖皮质激素抵抗机制的基础[1, 3]。糖皮质激素通过与糖皮质激素受体结合而产生生物效应，糖皮质激素受体磷酸化异常以及糖皮质激素受体与激素的亲和力降低在糖皮质激素抵抗的机制中起重要作用[4-6]。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和核转录因子活化蛋白 1（activator protein 1，AP-1）可与糖皮质激素受体结合，从而影响糖皮质激素功能的发挥，进而参与糖皮质激素的抵抗机制[4, 7]。维生素 D 可改善糖皮质激素抵抗，可作为 SR 哮喘的辅助治疗，但在改善 SR 哮喘糖皮质激素抵抗中的作用机制有待进一步研究[4, 8-12]。本研究拟就维生素 D 对 SR 哮喘患者 T 淋巴细胞 JNK/AP-1 信号通路和糖皮质激素受体的影响及机制进行探讨。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
收集 2014 年至 2015 年期间至复旦大学附属华山医院北院门诊和住院部急性发作的哮喘患者。所有哮喘患者诊断符合 2013 GINA 指南诊断标准。入组者均进行肺功能检查，SR 哮喘和激素敏感型支气管哮喘（简称 SS 哮喘）的分诊断根据文献标准，口服泼尼松 20 mg/d，连续 7 d，第 1 秒用力呼气容积（FEV1）改善不足 15% 者为 SR 哮喘，FEV1 改善超过 25% 者为 SS 哮喘[13-14]。SR 哮喘和 SS 哮喘的诊断均在此次入组前已诊断明确。SS 哮喘急性发作患者 26 例，男 10 例，女 16 例；平均年龄为（52.3±15.4）岁；中度急性发作 20 例，重度急性发作 6 例。SR 哮喘急性发作患者 36 例，男 16 例，女 20 例；平均年龄为（53.4±14.8）岁；中度急性发作 28 例，重度急性发作 8 例。健康对照者来自复旦大学附属华山医院北院体检中心，共 25 例，男 10 例，女 15 例，平均年龄为（51.9±16.9 ）岁。哮喘入组患者此次急性发作入组前的半年内均进行了基础肺功能检查，SS 哮喘患者的 FEV1 值为（2.16±0.91）L，SR 哮喘患者的 FEV1 值为（2.03±0.87）L。入组者排除条件如下：（1）吸烟、服用影响糖皮质激素代谢的药物如抗惊厥药和利福平等；（2）患有除哮喘以外其他肺部疾病史；（3）近 4 周内有呼吸道感染；（4）患有肝脏、肾脏疾病等严重内科疾病；（5）近 4 周内有应用维生素 D 和全身使用糖皮质激素史。本试验伦理由复旦大学附属华山医院伦理委员会审批通过。所有入组者均知情同意并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 T 淋巴细胞分离、纯化、培养及分组 SS 哮喘和 SR 哮喘患者均在入院第 1 d 取外周静脉血，SS 哮喘患者和健康对照者抽取外周静脉血 15 ml，SR 哮喘患者抽取外周静脉血 30 ml。以上入组者外周静脉血均留取 5 ml 用于检测 25-(OH)D 水平，余外周静脉血经肝素抗凝后采用 Ficoll 密度梯度离心法进行细胞分离，将分离的外周血单个核细胞加入 RPMI-1640 培养基中培养 4 h（贴壁）后取出悬浮的 T 淋巴细胞，用锥虫蓝染色计数活细胞比例，当活细胞比例大于 96% 后再进入下一步试验验。用含 10% 胎牛血清培养液调整细胞浓度 2×106个/ml。试验分组如下：（1）A 组：健康对照组；（2）B 组：SS 哮喘对照组；（3）C 组：SR 哮喘对照组；（4）D 组：SR 哮喘 JNK 抑制剂+1,25-(OH)2D3 组，先加 5 μmol/L JNK抑制剂 SP600125 预处理 30 min，再加入 100 nmol/L 的 1,25-(OH)2D3；（5）E 组：SR 哮喘 JNK 抑制剂组，加入 5 μmol/L 的 SP600125；（6）F 组：SR 哮喘 1,25-(OH)2D3 组，加入 100 nmol/L 的 1,25-(OH)2D3。除干预因素不同外，每组细胞培养条件均一致。以上各组 T 淋巴细胞共培养 48 h，培养结束后离心收集沉淀的 T 淋巴细胞用于下一步实验。
1.2.2 Western blot 方法检测 T 淋巴细胞中 p-JNK 和 p-GR 的表达 取出 T 淋巴细胞，加入细胞裂解液，放置冰上裂解 30 min，12 000 r/min 离心 10 min，吸取上清，根据 BCA 法进行蛋白定量。总蛋白经 SDS-PAGE 分离后，转移到 PVDF 膜上。用 5% 脱脂奶粉封闭 1.5 h，随后加入磷酸化 JNK（p-JNK）抗体和磷酸化糖皮质激素受体（ p-GR） 抗体（ Cell Signaling Technology 公司），4 ℃ 过夜，用 TBST 洗 3 次，每次 10 min。将 PVDF 膜用发光试剂 ECL 显色，凝胶成像系统扫描分析结果。
1.2.3 RT-PCR 法检测 T 淋巴细胞中 c-Jun mRNA 的表达 取出 T 淋巴细胞，按照总 RNA 提取试剂盒（GI GEN 公司）说明书方法进行提取总 RNA，计算样品总 RNA 进行 RT-PCR 检测。c-Jun 引物（由上海生工合成），引物序列如下：上游 5’-ATGACTGCAAAGATGGAAACGACC-3’，下游 5’-GATGTGCCCGTTGCTGGACTGGAT-3’（264 bp）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物，上游 5’-GAAGTGAAGGTCGGAGTCA-3’，下游 5’-TTCACACCCATGACGAACAT-3’（402 bp）。c-Jun 的退火温度为 53℃，30 s，35 个循环；GAPDH 退火温度为 55℃，1 min，30 个循环。PCR 产物以 1% 琼脂糖凝胶电泳。Fluorochem5500 成像系统采集图像，以 c-Jun mRNA 吸光度和 Tbp 吸光度的比值表示 c-Jun mRNA 相对表达量。
1.2.4 ELISA 法检测血清中 25-(OH)D 水平 ELISA 法按照试剂盒（R&D 公司）说明书进行操作。
1.3 统计学方法
应用 SPSS 16.0 统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ ）表示，在方差齐性基础上，两组间比较采用 t 检验。计数资料之间的比较采用 χ2 检验。用 Pearson 相关分析检测两因素之间相关关系。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 入组者一般情况和 25-(OH)D 水平情况
A 组、B 组和 C 组研究对象在性别构成、年龄、体重指数方面差异无统计学意义（P>0.05）。B 组和 C 组的基础肺功能 FEV1 差异无统计学意义（P>0.05）。B 组和 C 组 25-（OH）D 水平均低于 A 组[（40.77±9.29）nmol/L 和（31.89±7.10）nmol/L 比（55.74±11.54） nmol/L，P<0.05]，C 组 25-(OH)D 水平低于 B 组[（31.89±7.10）nmol/L 比（40.77±9.29）nmol/L，P<0.05]。结果见图 1。
图1
各组间血清 25-(OH)D 水平的比较
2.2 T 淋巴细胞 p-JNK 和 p-GR 的表达情况
B 组和 C 组 p-JNK 蛋白表达水平高于 A 组（0.22±0.02 和 0.51±0.04 比 0.13±0.01， P<0.05），而 C 组高于 B 组（0.51±0.04 比 0.22±0.02，P<0.05），E 组和 F 组均低于 C 组（0.35±0.04 和 0.39±0.02 比 0.51±0.04，P<0.05），D 组低于 F 组（0.27±0.03 比 0.39±0.02，P<0.05）。结果见图 2 和 3。
图2
Western blot 法检测T淋巴细胞中 p-JNK 的表达水平
图3
各组间 p-JNK 水平的比较
A 组和 B 组的 p-GR 蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。C 组的 p-GR 蛋白表达水平低于 A 组和 B 组（0.46±0.06 比 1.19±0.06 和 1.23±0.07，P<0.05），E 组和 F 组均高于 C 组（0.76±0.07 和 0.83±0.08 比 0.46±0.06，P<0.05），D 组高于 F 组（0.95±0.08 比0.83±0.08， P<0.05）。结果见图 4 和 5。
图4
Western blot 法检测 T 淋巴细胞中 p-GR 的表达水平
图5
各组间 p-GR 水平的比较
2.3 T 淋巴细胞 c-Jun mRNA 的表达情况
B 组和 C 组 c-Jun mRNA 的表达水平显著高于 A 组 （1.32±0.06 和 1.57±0.09 比 0.62±0.05，P<0.05），且 C 组高于 B 组 （1.57±0.09 比 1.32±0.06，P<0.05），E 组和 F 组均低于 C 组（1.04±0.08 和 1.16±0.07 比 1.57±0.09，P<0.05），D 组低于 F 组（0.87±0.06 比 1.16±0.07，P<0.05）。结果见图 6。
图6
各组间 c-Jun mRNA 水平的比较
2.4 相关性分析
C 组患者血清中 25-(OH)D 水平与 T 淋巴细胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 水平呈负相关（r=–0.69，r=–0.65，P<0.05），与 p-GR 平呈正相关（r=0.72，P<0.05）。
3 讨论
25-(OH)D 是维生素 D 在人体血液中的主要形式，其性质最稳定且含量又最多，因此血清的 25-(OH)D水平可作为维生素 D 营养状况检测的客观指标。外周血清 25-(OH)D<50 nmol/L 定义为维生素 D 缺乏，25-(OH)D 50～70 nmol/L 定义为维生素 D 不足[15]。1,25-(OH)2D3 是维生素 D 在体内的主要活性形式，维生素 D 的大部分功能是通过 1,25-(OH)2D3 发挥作用[16]。哮喘患者由于容易过敏、户外运动减少从而导致有效日光照射不足，以及反复急性发作缺氧、食欲减退等造成维生素 D 合成和吸收减少；此外，哮喘患者长期治疗需使用糖皮质激素而使维生素 D 的代谢增加。因此，哮喘患者维生素 D 缺乏情况较普遍[11, 17-19]。而以上影响维生素 D 吸收、合成和代谢的因素在 SR 哮喘患者的病程中更为明显。本研究结果也显示，维生素 D 不足或缺乏在 SS 哮喘和 SR 哮喘患者中患病率高，而 SR 哮喘较 SS 哮喘患者更为严重。
JNK 是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族信号系统的成员之一。AP-1 是位于 JNK 下游的关键信号蛋白分子。AP-1 主要由 c-Jun 和 c-Fos 家族构成，JNK 接受上游炎症因子等刺激信号后被磷酸化激活，可进一步使核内转录因子 c-Jun 的氨基末端磷酸化，进而激活 c-Jun 继而启动并增强炎症转录。有研究发现，JNK 可通过使糖皮质激素受体的丝氨酸 226 磷酸化（正常情况下糖皮质激素受体的丝氨酸 211 被磷酸化而活化）而抑制糖皮质激素反应元件的转录活性；哮喘患者存在 AP-1 异常活化，AP-1 与糖皮质激素受体结合形成复合物，导致糖皮质激素受体有效数目减少。此外，c-Jun 还可抑制 80% 的糖皮质激素受体启动子活性[4, 20]。因此，JNK/AP-1 信号通路可影响糖皮质激素受体而参与糖皮质激素的抵抗。糖皮质激素是治疗哮喘急性发作的重要药物，而 T 淋巴细胞在哮喘急性发作的炎症反应中起重要作用，同时也参与了糖皮质激素抵抗的发病机制，因此我们对急性发作期 SR 哮喘患者的 T 淋巴细胞在糖皮质激素抵抗中的机制进行研究。本研究发现，SR 哮喘患者的 T 淋巴细胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 的表达水平较 SS 哮喘和健康对照组高，而 p-GR 的表达降低。为进一步探讨 JNK/AP-1 信号通路对 SR 哮喘患者 T 淋巴细胞糖皮质激素受体的影响，我们在实验中加入 JNK 抑制剂 SP600125，结果显示 SR 哮喘患者 T 淋巴细胞的 p-JNK 和 c-Jun mRNA 水平均降低，而 p-GR 的表达增加。因此，我们推测 SR 哮喘患者 T 淋巴细胞的 p-JNK 和 c-Jun 过度表达，继而抑制了 p-GR 的表达，从而导致糖皮质激素抵抗。
有研究报道，哮喘患者的维生素 D 水平与糖皮质激素抵抗有关，而适当补充维生素 D 可改善糖皮质激素抵抗[4, 8-9, 21]。本实验发现，SR 哮喘患者中维生素 D 缺乏患病率高；而 1,25-(OH)2D3 可降低 SR 哮喘的 T 淋巴细胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 的表达，增加 p-GR 的表达；相关分析显示，SR 哮喘患者血清中 25-(OH)D 水平与 T 淋巴细胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 水平呈负相关，与 p-GR 水平呈正相关。以上结果提示 1,25-(OH)2D3 可通过抑制 SR 哮喘 T 淋巴细胞 JNK/AP-1 信号通路而促进 p-GR 的表达，这可能是维生素 D 可改善 SR 哮喘糖皮质激素抵抗机制之一。随着研究的深入，相信维生素 D 将会为 SR 哮喘的治疗提供新的思路。
哮喘是一种常见的呼吸道疾病，严重危害人们的身心健康，糖皮质激素是治疗哮喘急性发作的重要药物。在临床工作中，激素抵抗型支气管哮喘（简称 SR 哮喘，约占哮喘患者的5%～10%）因反复急性发作，应用较大剂量的糖皮质激素治疗效果差，耗费了哮喘患者中超过 50% 的医疗资源[1-2]。T淋巴细胞是哮喘发病机制中的主要炎症细胞，糖皮质激素能抑制 T 淋巴细胞等炎症细胞的致炎作用；T 淋巴细胞对糖皮质激素的抗炎作用反应性低下是临床糖皮质激素抵抗机制的基础[1, 3]。糖皮质激素通过与糖皮质激素受体结合而产生生物效应，糖皮质激素受体磷酸化异常以及糖皮质激素受体与激素的亲和力降低在糖皮质激素抵抗的机制中起重要作用[4-6]。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和核转录因子活化蛋白 1（activator protein 1，AP-1）可与糖皮质激素受体结合，从而影响糖皮质激素功能的发挥，进而参与糖皮质激素的抵抗机制[4, 7]。维生素 D 可改善糖皮质激素抵抗，可作为 SR 哮喘的辅助治疗，但在改善 SR 哮喘糖皮质激素抵抗中的作用机制有待进一步研究[4, 8-12]。本研究拟就维生素 D 对 SR 哮喘患者 T 淋巴细胞 JNK/AP-1 信号通路和糖皮质激素受体的影响及机制进行探讨。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
收集 2014 年至 2015 年期间至复旦大学附属华山医院北院门诊和住院部急性发作的哮喘患者。所有哮喘患者诊断符合 2013 GINA 指南诊断标准。入组者均进行肺功能检查，SR 哮喘和激素敏感型支气管哮喘（简称 SS 哮喘）的分诊断根据文献标准，口服泼尼松 20 mg/d，连续 7 d，第 1 秒用力呼气容积（FEV1）改善不足 15% 者为 SR 哮喘，FEV1 改善超过 25% 者为 SS 哮喘[13-14]。SR 哮喘和 SS 哮喘的诊断均在此次入组前已诊断明确。SS 哮喘急性发作患者 26 例，男 10 例，女 16 例；平均年龄为（52.3±15.4）岁；中度急性发作 20 例，重度急性发作 6 例。SR 哮喘急性发作患者 36 例，男 16 例，女 20 例；平均年龄为（53.4±14.8）岁；中度急性发作 28 例，重度急性发作 8 例。健康对照者来自复旦大学附属华山医院北院体检中心，共 25 例，男 10 例，女 15 例，平均年龄为（51.9±16.9 ）岁。哮喘入组患者此次急性发作入组前的半年内均进行了基础肺功能检查，SS 哮喘患者的 FEV1 值为（2.16±0.91）L，SR 哮喘患者的 FEV1 值为（2.03±0.87）L。入组者排除条件如下：（1）吸烟、服用影响糖皮质激素代谢的药物如抗惊厥药和利福平等；（2）患有除哮喘以外其他肺部疾病史；（3）近 4 周内有呼吸道感染；（4）患有肝脏、肾脏疾病等严重内科疾病；（5）近 4 周内有应用维生素 D 和全身使用糖皮质激素史。本试验伦理由复旦大学附属华山医院伦理委员会审批通过。所有入组者均知情同意并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 T 淋巴细胞分离、纯化、培养及分组 SS 哮喘和 SR 哮喘患者均在入院第 1 d 取外周静脉血，SS 哮喘患者和健康对照者抽取外周静脉血 15 ml，SR 哮喘患者抽取外周静脉血 30 ml。以上入组者外周静脉血均留取 5 ml 用于检测 25-(OH)D 水平，余外周静脉血经肝素抗凝后采用 Ficoll 密度梯度离心法进行细胞分离，将分离的外周血单个核细胞加入 RPMI-1640 培养基中培养 4 h（贴壁）后取出悬浮的 T 淋巴细胞，用锥虫蓝染色计数活细胞比例，当活细胞比例大于 96% 后再进入下一步试验验。用含 10% 胎牛血清培养液调整细胞浓度 2×106个/ml。试验分组如下：（1）A 组：健康对照组；（2）B 组：SS 哮喘对照组；（3）C 组：SR 哮喘对照组；（4）D 组：SR 哮喘 JNK 抑制剂+1,25-(OH)2D3 组，先加 5 μmol/L JNK抑制剂 SP600125 预处理 30 min，再加入 100 nmol/L 的 1,25-(OH)2D3；（5）E 组：SR 哮喘 JNK 抑制剂组，加入 5 μmol/L 的 SP600125；（6）F 组：SR 哮喘 1,25-(OH)2D3 组，加入 100 nmol/L 的 1,25-(OH)2D3。除干预因素不同外，每组细胞培养条件均一致。以上各组 T 淋巴细胞共培养 48 h，培养结束后离心收集沉淀的 T 淋巴细胞用于下一步实验。
1.2.2 Western blot 方法检测 T 淋巴细胞中 p-JNK 和 p-GR 的表达 取出 T 淋巴细胞，加入细胞裂解液，放置冰上裂解 30 min，12 000 r/min 离心 10 min，吸取上清，根据 BCA 法进行蛋白定量。总蛋白经 SDS-PAGE 分离后，转移到 PVDF 膜上。用 5% 脱脂奶粉封闭 1.5 h，随后加入磷酸化 JNK（p-JNK）抗体和磷酸化糖皮质激素受体（ p-GR） 抗体（ Cell Signaling Technology 公司），4 ℃ 过夜，用 TBST 洗 3 次，每次 10 min。将 PVDF 膜用发光试剂 ECL 显色，凝胶成像系统扫描分析结果。
1.2.3 RT-PCR 法检测 T 淋巴细胞中 c-Jun mRNA 的表达 取出 T 淋巴细胞，按照总 RNA 提取试剂盒（GI GEN 公司）说明书方法进行提取总 RNA，计算样品总 RNA 进行 RT-PCR 检测。c-Jun 引物（由上海生工合成），引物序列如下：上游 5’-ATGACTGCAAAGATGGAAACGACC-3’，下游 5’-GATGTGCCCGTTGCTGGACTGGAT-3’（264 bp）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物，上游 5’-GAAGTGAAGGTCGGAGTCA-3’，下游 5’-TTCACACCCATGACGAACAT-3’（402 bp）。c-Jun 的退火温度为 53℃，30 s，35 个循环；GAPDH 退火温度为 55℃，1 min，30 个循环。PCR 产物以 1% 琼脂糖凝胶电泳。Fluorochem5500 成像系统采集图像，以 c-Jun mRNA 吸光度和 Tbp 吸光度的比值表示 c-Jun mRNA 相对表达量。
1.2.4 ELISA 法检测血清中 25-(OH)D 水平 ELISA 法按照试剂盒（R&D 公司）说明书进行操作。
1.3 统计学方法
应用 SPSS 16.0 统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ ）表示，在方差齐性基础上，两组间比较采用 t 检验。计数资料之间的比较采用 χ2 检验。用 Pearson 相关分析检测两因素之间相关关系。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 入组者一般情况和 25-(OH)D 水平情况
A 组、B 组和 C 组研究对象在性别构成、年龄、体重指数方面差异无统计学意义（P>0.05）。B 组和 C 组的基础肺功能 FEV1 差异无统计学意义（P>0.05）。B 组和 C 组 25-（OH）D 水平均低于 A 组[（40.77±9.29）nmol/L 和（31.89±7.10）nmol/L 比（55.74±11.54） nmol/L，P<0.05]，C 组 25-(OH)D 水平低于 B 组[（31.89±7.10）nmol/L 比（40.77±9.29）nmol/L，P<0.05]。结果见图 1。
图1
各组间血清 25-(OH)D 水平的比较
2.2 T 淋巴细胞 p-JNK 和 p-GR 的表达情况
B 组和 C 组 p-JNK 蛋白表达水平高于 A 组（0.22±0.02 和 0.51±0.04 比 0.13±0.01， P<0.05），而 C 组高于 B 组（0.51±0.04 比 0.22±0.02，P<0.05），E 组和 F 组均低于 C 组（0.35±0.04 和 0.39±0.02 比 0.51±0.04，P<0.05），D 组低于 F 组（0.27±0.03 比 0.39±0.02，P<0.05）。结果见图 2 和 3。
图2
Western blot 法检测T淋巴细胞中 p-JNK 的表达水平
图3
各组间 p-JNK 水平的比较
A 组和 B 组的 p-GR 蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。C 组的 p-GR 蛋白表达水平低于 A 组和 B 组（0.46±0.06 比 1.19±0.06 和 1.23±0.07，P<0.05），E 组和 F 组均高于 C 组（0.76±0.07 和 0.83±0.08 比 0.46±0.06，P<0.05），D 组高于 F 组（0.95±0.08 比0.83±0.08， P<0.05）。结果见图 4 和 5。
图4
Western blot 法检测 T 淋巴细胞中 p-GR 的表达水平
图5
各组间 p-GR 水平的比较
2.3 T 淋巴细胞 c-Jun mRNA 的表达情况
B 组和 C 组 c-Jun mRNA 的表达水平显著高于 A 组 （1.32±0.06 和 1.57±0.09 比 0.62±0.05，P<0.05），且 C 组高于 B 组 （1.57±0.09 比 1.32±0.06，P<0.05），E 组和 F 组均低于 C 组（1.04±0.08 和 1.16±0.07 比 1.57±0.09，P<0.05），D 组低于 F 组（0.87±0.06 比 1.16±0.07，P<0.05）。结果见图 6。
图6
各组间 c-Jun mRNA 水平的比较
2.4 相关性分析
C 组患者血清中 25-(OH)D 水平与 T 淋巴细胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 水平呈负相关（r=–0.69，r=–0.65，P<0.05），与 p-GR 平呈正相关（r=0.72，P<0.05）。
3 讨论
25-(OH)D 是维生素 D 在人体血液中的主要形式，其性质最稳定且含量又最多，因此血清的 25-(OH)D水平可作为维生素 D 营养状况检测的客观指标。外周血清 25-(OH)D<50 nmol/L 定义为维生素 D 缺乏，25-(OH)D 50～70 nmol/L 定义为维生素 D 不足[15]。1,25-(OH)2D3 是维生素 D 在体内的主要活性形式，维生素 D 的大部分功能是通过 1,25-(OH)2D3 发挥作用[16]。哮喘患者由于容易过敏、户外运动减少从而导致有效日光照射不足，以及反复急性发作缺氧、食欲减退等造成维生素 D 合成和吸收减少；此外，哮喘患者长期治疗需使用糖皮质激素而使维生素 D 的代谢增加。因此，哮喘患者维生素 D 缺乏情况较普遍[11, 17-19]。而以上影响维生素 D 吸收、合成和代谢的因素在 SR 哮喘患者的病程中更为明显。本研究结果也显示，维生素 D 不足或缺乏在 SS 哮喘和 SR 哮喘患者中患病率高，而 SR 哮喘较 SS 哮喘患者更为严重。
JNK 是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族信号系统的成员之一。AP-1 是位于 JNK 下游的关键信号蛋白分子。AP-1 主要由 c-Jun 和 c-Fos 家族构成，JNK 接受上游炎症因子等刺激信号后被磷酸化激活，可进一步使核内转录因子 c-Jun 的氨基末端磷酸化，进而激活 c-Jun 继而启动并增强炎症转录。有研究发现，JNK 可通过使糖皮质激素受体的丝氨酸 226 磷酸化（正常情况下糖皮质激素受体的丝氨酸 211 被磷酸化而活化）而抑制糖皮质激素反应元件的转录活性；哮喘患者存在 AP-1 异常活化，AP-1 与糖皮质激素受体结合形成复合物，导致糖皮质激素受体有效数目减少。此外，c-Jun 还可抑制 80% 的糖皮质激素受体启动子活性[4, 20]。因此，JNK/AP-1 信号通路可影响糖皮质激素受体而参与糖皮质激素的抵抗。糖皮质激素是治疗哮喘急性发作的重要药物，而 T 淋巴细胞在哮喘急性发作的炎症反应中起重要作用，同时也参与了糖皮质激素抵抗的发病机制，因此我们对急性发作期 SR 哮喘患者的 T 淋巴细胞在糖皮质激素抵抗中的机制进行研究。本研究发现，SR 哮喘患者的 T 淋巴细胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 的表达水平较 SS 哮喘和健康对照组高，而 p-GR 的表达降低。为进一步探讨 JNK/AP-1 信号通路对 SR 哮喘患者 T 淋巴细胞糖皮质激素受体的影响，我们在实验中加入 JNK 抑制剂 SP600125，结果显示 SR 哮喘患者 T 淋巴细胞的 p-JNK 和 c-Jun mRNA 水平均降低，而 p-GR 的表达增加。因此，我们推测 SR 哮喘患者 T 淋巴细胞的 p-JNK 和 c-Jun 过度表达，继而抑制了 p-GR 的表达，从而导致糖皮质激素抵抗。
有研究报道，哮喘患者的维生素 D 水平与糖皮质激素抵抗有关，而适当补充维生素 D 可改善糖皮质激素抵抗[4, 8-9, 21]。本实验发现，SR 哮喘患者中维生素 D 缺乏患病率高；而 1,25-(OH)2D3 可降低 SR 哮喘的 T 淋巴细胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 的表达，增加 p-GR 的表达；相关分析显示，SR 哮喘患者血清中 25-(OH)D 水平与 T 淋巴细胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 水平呈负相关，与 p-GR 水平呈正相关。以上结果提示 1,25-(OH)2D3 可通过抑制 SR 哮喘 T 淋巴细胞 JNK/AP-1 信号通路而促进 p-GR 的表达，这可能是维生素 D 可改善 SR 哮喘糖皮质激素抵抗机制之一。随着研究的深入，相信维生素 D 将会为 SR 哮喘的治疗提供新的思路。
