引用本文： 孙青峰, 李理, 张安兵, 黄文杰. 应用基因芯片筛选转染FOXO1后A549细胞差异表达基因. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(4): 368-373. doi: 10.7507/1671-6205.2016087 复制
急性肺损伤(ALI)及其更严重阶段急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是临床危重症发生急性呼吸衰竭的主要原因，病死率高达50%[1]。ALI发病机制错综复杂，迄今为止尚未阐明清楚，其实质是过度放大的炎症反应及氧化应激反应共同作用的结果。叉头蛋白O1(FOXO1)是叉头蛋白(Forkhead box protein，FOX)蛋白家族在哺乳动物中的一个亚型，可直接参与基因转录的调节以及协同其他转录因子进行转录调节[2]，在哺乳动物细胞的凋亡、氧化应激、细胞周期阻滞、DNA损伤/修复、肿瘤发生及糖代谢调节中起重要作用。关于FOXO1基因在ALI氧化应激过程中作用的研究不多。研究发现FOXO1高表达时，细胞的生长受到抑制，当FOXO1从细胞浆转位至细胞核时，将促进细胞的凋亡[3-5]。因此，本研究以肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞，模拟ALI时的细胞炎症损伤过程；同时，运用基因芯片技术筛选转染FOXO1基因后A549细胞差异表达基因并进行分析，深入探讨FOXO1在ALI肺泡上皮细胞凋亡中的作用。
材料与方法
一 材料
A549细胞由广州军区总医院医学实验科细胞库提供，胎牛血清购于美国Gibco公司，RPMI-1640培养液购于美国Theomo公司，胰蛋白酶购于美国Life公司，重组人TNF-α购于美国Pepro Tech公司，GV230-FOXO1真核表达载体和GV230空载体由吉凯基因公司提供，转染试剂脂质体lipofectamine®LTX&Plus Reagent购于美国Invitrogen公司，总RNA提取试剂Trizol购于美国Invitrogen公司。基因芯片为A10502-1-2 RiboArrayTM Human Apoptosis Array 1×2K购自广州锐博公司。
二 方法
1．实验分组：细胞分为对照组、TNF-α组、FOXO1质粒+TNF-α组、阴性对照组质粒+TNF-α组。FOXO1质粒+TNF-α组、阴性对照组质粒+TNF-α组分别转染相应质粒(转染方法详见下文)，转染10 h后，这两组和TNF-α组均采用不含血清10 ng/mL TNF-α培养基刺激24 h，收集细胞。
2．真核表达载体与细胞转染：设计并合成FOXO1基因编码区特异性对寡聚核苷酸引物(上游5′-TCCGCTCGAGATGGCCGAGGCGCCTCAGGT-3′，下游5′-ATGGGGTACCGTGCCTGACACCCAGCTATG TG-3′)。本实验所用载体为GV230(吉凯基因公司提供)，其元件顺序：CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin，克隆位点为XhoⅠ和 KpnⅠ，真核抗性为Kanamycin，见图 1。以A549细胞cDNA作为模板，放入PCR扩增仪中进行扩增。0.9%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。扩增FOXO1编码基因到真核表达载体GV230-FOXO1，见图 2。用Lipofectamine®LTX&Plus Reagent转染试剂将2 μg GV230-FOXO1及GV230空载体分别转染35 mm平皿A549细胞，转染24 h后荧光显微镜下观察细胞转染效率，见图 3。48 h后收获细胞。
图1
GV230载体
图2
GV230-FOXO1
图3
转染质粒及空载体24 h后荧光显微镜照片(×10)
3．总RNA提取及mRNA纯化：Trizol试剂一步法提取正常A549细胞、TNF-α诱导细胞以及转染GV230-FOXO1及GV230空载体的TNF-α诱导A549细胞的总RNA，分别标记为对照组、TNF-α组、FOXO1质粒+TNF-α组、阴性对照质粒+TNF-α组。FOXO1质粒+TNF-α组和阴性对照质粒+TNF-α组样品经分光光度计检测吸光度A值，并行热稳定实验，于-20 ℃和170 ℃保存1 h后，经琼脂糖凝胶电泳检测28S、18S条带变化。纯化mRNA并行电泳检测。RNA质检合格后进行分装-80 ℃保存。
4．芯片杂交及洗涤：取0.5~2 μg的Total RNA使用ULS标记法标记上Cy3，通过紫外分光光度计测得A260、A550，根据实验报告所列公式计算标记率DOL(DOL最佳范围是1.0~3.6)；进行预杂交，芯片在无菌去离子水中65 ℃孵育10 min，换预杂交液37 ℃孵育1 h；将Cy3标记的RNA全部用于配置杂交液，杂交液95 ℃变性3 min，冰上孵育20 s；将芯片预杂交液吸出，换杂交液，37 ℃杂交16 h；芯片取出依次用6×SSPET，3×SSPET，0.5×SSPET，0.5×SSPET洗1遍，去除非特异性杂交背景；加显影液及盖玻片于杂交区域，进行扫描；扫描后所得图片提取数据，进行生物信息学分析。
5．检测与分析：应用广州市锐博生物科技有限公司的GenePix4000B激光扫描仪扫描芯片。用预先选定的内参照基因对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正。采用50% scaling的校正方法，分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度，计算Cy5/Cy3比值。阳性结果判断：Cy5/Cy3＞2.0，红色荧光，显示表达增强；Cy5/Cy3＜0.5，为绿色荧光，显示表达减弱。
结果
一 FOXO1表达载体的构建
真核表达质粒GV230-FOXO1经过限制性内切酶作图分析核苷酸序列的测定，证实含有完整的开放读码框，序列准确无误。
二 总RNA及mRNA的定性、定量分析
实验组和对照组总RNA的吸光度比值A260/A280分别为2.030和2.015，热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃ 1 h电泳条带比较，显示28S条带无明显降解，电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA。mRNA主要集中于0.9~4.0 kb的连续条带。
三 芯片杂交体系验证及结果分析
RNA质量控制(RNA QC)验证结果通过，见图 4和表 1。
图4
RNA质量控制结果2
表1
RNA质量控制结果1
对于某一点的两种叠加荧光信号，如果Cy3信号强，该点多显绿色(下调趋势)；如果Cy5信号强，该点多显红色(上调趋势)；如果强度相似，即显黄色。结果见图 5。
图5
双色荧光标记叠加图
经基因芯片筛选转染FOXO1基因后A549细胞差异表达基因554个，其中上调基因317个，下调基因237个。对芯片结果进行功能分类，发现差异基因涉及细胞增殖、分化、凋亡和信号转导、蛋白酶活性等方面。部分差异表达基因见表 2和表 3。
表2
部分表达显著增强的基因
表3
部分表达显著减弱的基因
讨论
以TNF-α为代表的细胞因子大量释放为特征的全身过度炎症反应是ALI的主要发病基础。临床研究及动物实验研究发现ALI患者肺泡灌洗液和小鼠血清中TNF-α明显升高，ALI的严重程度与TNF-α的浓度呈正相关[6-7]。本实验室袁伟锋等[8]通过脂多糖(LPS)小鼠气管内雾化模拟建立ALI动物模型，并预先在小鼠腹腔内注射依那西普以中和过量的TNF-α，结果发现小鼠肺组织细胞损伤减轻，氧化应激水平及细胞炎症因子显著降低，提示TNF-α是ALI发病过程中的关键因子。本实验室黄建华等[9]通过研究肺泡Ⅱ型上皮细胞A549对TNF-α和LPS刺激的反应效果来探讨ALI体外细胞模型最佳造模方法，实验结果证明TNF-α可以有效刺激A549产生过度炎症反应，而LPS不能刺激A549细胞产生炎症损伤。因此，本实验使用TNF-α代替LPS刺激建立ALI体外细胞模型。
直接参与基因转录调节以及协同其他转录因子进行转录调节的转录因子，在哺乳动物细胞的凋亡、氧化应激、细胞周期阻滞、DNA损伤/修复、肿瘤发生及糖代谢调节中起着重要作用。有研究证实予以TNF-α刺激血管外膜细胞，FOXO1的表达明显增加，同时细胞凋亡增加[10]，提示FOXO1可能参与了TNF-α诱导的细胞凋亡过程。本实验室李理等[11]通过转染FOXO1真核表达载体入ALI细胞炎症模型，研究发现细胞凋亡水平上调，细胞内促凋亡蛋白Bim表达增多，说明FOXO1在ALI的炎症细胞中可能起到促进细胞凋亡的作用。这与在研究原发性纵隔B淋巴细胞瘤某些细胞表型，增强FOXO1的表达可引起细胞生长停滞及凋亡[12]相一致。但其具体的作用机制尚不清楚，有待进一步探讨。
基因芯片技术是在分子生物学、人类基因组计划的基础上产生和发展起来的，拥有高度并行性、高通量、微型化等显著特点。目前，基因芯片技术可用于检测炎症氧化、应激相关基因表达等，是ALI分子水平研究的重要工具。该研究建立于FOXO1基因在炎症状态下A549细胞高表达的基础上，应用人类表达谱芯片成功筛选出FOXO1转染TNF-α诱导A549细胞后差异表达的基因，RNA QC验证芯片结果可靠。基因芯片筛选出表达差异基因共554个，其中上调基因317个，下调基因237个。这些差异表达基因在细胞增殖、分化、凋亡以及细胞粘附和细胞周期等细胞生理过程中发挥重要调控作用，参与细胞的信号转导、侵袭和转移等过程。
表达上调的基因中，CDK1、PLK5、CASP1、FAS、BAD等与细胞周期调控、增殖、凋亡等有密切关系。周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK1是细胞周期调控中的重要因子，Jacquot等[13]通过上调CDK1的表达发现可导致非小细胞肺癌细胞株增殖抑制。PLK5是PLK激酶家族成员，可抑制神经细胞的分化与胶质母细胞瘤的形成[14]。CASP1也可称为白细胞介素1β(IL-1β)转换酶，通过促进炎症因子的加工和释放而调控细胞的炎症反应，同时还能介导程序性细胞凋亡[15]。死亡受体FAS是肿瘤坏死因子受体家族重要成员，经FAS/FASL通路转导死亡信号诱导细胞凋亡[16]。BAD是Bcl-2家族中与Bcl-2和Bcl-xL相关的促凋亡基因，主要通过线粒体途径促进细胞凋亡[17]。
表达下调的基因中，BCL2、CAT、SOD1、APC、CDK5等与细胞凋亡、抗氧化、信号转导、增殖等密切相关。BCL2作为BCL2家族的主要代表，主要存在于线粒体外膜和胞质中，在外源性凋亡途径和内源性凋亡途径中均有重要作用。CAT基因编码的蛋白是过氧化氢酶，是人体内很重要的一种抗氧化酶，可通过催化超氧阴离子自由基的自身氧化还原反应，清除氧自由基，避免损伤机体组织细胞。SOD1是超氧化物歧化酶SOD家族的成员之一，是SOD的主要形式，是生物体内重要的抗氧化酶。肿瘤抑制基因APC是WNT信号转导组分，可调节细胞增殖、迁移等[18]。细胞周期素依赖蛋白激酶CDK5作为一种多功能激酶，其主要功能是参与神经细胞生长发育和信号传导调控[19]。
与其他研究方法相比，应用基因芯片技术可以快速准确地获取增强FOXO1表达后TNF-α诱导的A549细胞中的差异表达基因的信息，从而预测这些基因间的相互关系及功能，以及与FOXO1基因的调控关系。然而基因芯片的结果局限在基因的转录水平变化，不具有广泛性。
综上所述，本研究通过体外模拟建立ALI细胞炎症性损伤模型，并增强FOXO1基因的表达，利用基因芯片技术获取了差异表达基因，并分析了许多FOXO1可能作用的候选基因作为预测FOXO1在ALI细胞炎症反应中发生作用的靶点，为深入探讨FOXO1在ALI中的作用机制提供了线索。
急性肺损伤(ALI)及其更严重阶段急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是临床危重症发生急性呼吸衰竭的主要原因，病死率高达50%[1]。ALI发病机制错综复杂，迄今为止尚未阐明清楚，其实质是过度放大的炎症反应及氧化应激反应共同作用的结果。叉头蛋白O1(FOXO1)是叉头蛋白(Forkhead box protein，FOX)蛋白家族在哺乳动物中的一个亚型，可直接参与基因转录的调节以及协同其他转录因子进行转录调节[2]，在哺乳动物细胞的凋亡、氧化应激、细胞周期阻滞、DNA损伤/修复、肿瘤发生及糖代谢调节中起重要作用。关于FOXO1基因在ALI氧化应激过程中作用的研究不多。研究发现FOXO1高表达时，细胞的生长受到抑制，当FOXO1从细胞浆转位至细胞核时，将促进细胞的凋亡[3-5]。因此，本研究以肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞，模拟ALI时的细胞炎症损伤过程；同时，运用基因芯片技术筛选转染FOXO1基因后A549细胞差异表达基因并进行分析，深入探讨FOXO1在ALI肺泡上皮细胞凋亡中的作用。
材料与方法
一 材料
A549细胞由广州军区总医院医学实验科细胞库提供，胎牛血清购于美国Gibco公司，RPMI-1640培养液购于美国Theomo公司，胰蛋白酶购于美国Life公司，重组人TNF-α购于美国Pepro Tech公司，GV230-FOXO1真核表达载体和GV230空载体由吉凯基因公司提供，转染试剂脂质体lipofectamine®LTX&Plus Reagent购于美国Invitrogen公司，总RNA提取试剂Trizol购于美国Invitrogen公司。基因芯片为A10502-1-2 RiboArrayTM Human Apoptosis Array 1×2K购自广州锐博公司。
二 方法
1．实验分组：细胞分为对照组、TNF-α组、FOXO1质粒+TNF-α组、阴性对照组质粒+TNF-α组。FOXO1质粒+TNF-α组、阴性对照组质粒+TNF-α组分别转染相应质粒(转染方法详见下文)，转染10 h后，这两组和TNF-α组均采用不含血清10 ng/mL TNF-α培养基刺激24 h，收集细胞。
2．真核表达载体与细胞转染：设计并合成FOXO1基因编码区特异性对寡聚核苷酸引物(上游5′-TCCGCTCGAGATGGCCGAGGCGCCTCAGGT-3′，下游5′-ATGGGGTACCGTGCCTGACACCCAGCTATG TG-3′)。本实验所用载体为GV230(吉凯基因公司提供)，其元件顺序：CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin，克隆位点为XhoⅠ和 KpnⅠ，真核抗性为Kanamycin，见图 1。以A549细胞cDNA作为模板，放入PCR扩增仪中进行扩增。0.9%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。扩增FOXO1编码基因到真核表达载体GV230-FOXO1，见图 2。用Lipofectamine®LTX&Plus Reagent转染试剂将2 μg GV230-FOXO1及GV230空载体分别转染35 mm平皿A549细胞，转染24 h后荧光显微镜下观察细胞转染效率，见图 3。48 h后收获细胞。
图1
GV230载体
图2
GV230-FOXO1
图3
转染质粒及空载体24 h后荧光显微镜照片(×10)
3．总RNA提取及mRNA纯化：Trizol试剂一步法提取正常A549细胞、TNF-α诱导细胞以及转染GV230-FOXO1及GV230空载体的TNF-α诱导A549细胞的总RNA，分别标记为对照组、TNF-α组、FOXO1质粒+TNF-α组、阴性对照质粒+TNF-α组。FOXO1质粒+TNF-α组和阴性对照质粒+TNF-α组样品经分光光度计检测吸光度A值，并行热稳定实验，于-20 ℃和170 ℃保存1 h后，经琼脂糖凝胶电泳检测28S、18S条带变化。纯化mRNA并行电泳检测。RNA质检合格后进行分装-80 ℃保存。
4．芯片杂交及洗涤：取0.5~2 μg的Total RNA使用ULS标记法标记上Cy3，通过紫外分光光度计测得A260、A550，根据实验报告所列公式计算标记率DOL(DOL最佳范围是1.0~3.6)；进行预杂交，芯片在无菌去离子水中65 ℃孵育10 min，换预杂交液37 ℃孵育1 h；将Cy3标记的RNA全部用于配置杂交液，杂交液95 ℃变性3 min，冰上孵育20 s；将芯片预杂交液吸出，换杂交液，37 ℃杂交16 h；芯片取出依次用6×SSPET，3×SSPET，0.5×SSPET，0.5×SSPET洗1遍，去除非特异性杂交背景；加显影液及盖玻片于杂交区域，进行扫描；扫描后所得图片提取数据，进行生物信息学分析。
5．检测与分析：应用广州市锐博生物科技有限公司的GenePix4000B激光扫描仪扫描芯片。用预先选定的内参照基因对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正。采用50% scaling的校正方法，分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度，计算Cy5/Cy3比值。阳性结果判断：Cy5/Cy3＞2.0，红色荧光，显示表达增强；Cy5/Cy3＜0.5，为绿色荧光，显示表达减弱。
结果
一 FOXO1表达载体的构建
真核表达质粒GV230-FOXO1经过限制性内切酶作图分析核苷酸序列的测定，证实含有完整的开放读码框，序列准确无误。
二 总RNA及mRNA的定性、定量分析
实验组和对照组总RNA的吸光度比值A260/A280分别为2.030和2.015，热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃ 1 h电泳条带比较，显示28S条带无明显降解，电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA。mRNA主要集中于0.9~4.0 kb的连续条带。
三 芯片杂交体系验证及结果分析
RNA质量控制(RNA QC)验证结果通过，见图 4和表 1。
图4
RNA质量控制结果2
表1
RNA质量控制结果1
对于某一点的两种叠加荧光信号，如果Cy3信号强，该点多显绿色(下调趋势)；如果Cy5信号强，该点多显红色(上调趋势)；如果强度相似，即显黄色。结果见图 5。
图5
双色荧光标记叠加图
经基因芯片筛选转染FOXO1基因后A549细胞差异表达基因554个，其中上调基因317个，下调基因237个。对芯片结果进行功能分类，发现差异基因涉及细胞增殖、分化、凋亡和信号转导、蛋白酶活性等方面。部分差异表达基因见表 2和表 3。
表2
部分表达显著增强的基因
表3
部分表达显著减弱的基因
讨论
以TNF-α为代表的细胞因子大量释放为特征的全身过度炎症反应是ALI的主要发病基础。临床研究及动物实验研究发现ALI患者肺泡灌洗液和小鼠血清中TNF-α明显升高，ALI的严重程度与TNF-α的浓度呈正相关[6-7]。本实验室袁伟锋等[8]通过脂多糖(LPS)小鼠气管内雾化模拟建立ALI动物模型，并预先在小鼠腹腔内注射依那西普以中和过量的TNF-α，结果发现小鼠肺组织细胞损伤减轻，氧化应激水平及细胞炎症因子显著降低，提示TNF-α是ALI发病过程中的关键因子。本实验室黄建华等[9]通过研究肺泡Ⅱ型上皮细胞A549对TNF-α和LPS刺激的反应效果来探讨ALI体外细胞模型最佳造模方法，实验结果证明TNF-α可以有效刺激A549产生过度炎症反应，而LPS不能刺激A549细胞产生炎症损伤。因此，本实验使用TNF-α代替LPS刺激建立ALI体外细胞模型。
直接参与基因转录调节以及协同其他转录因子进行转录调节的转录因子，在哺乳动物细胞的凋亡、氧化应激、细胞周期阻滞、DNA损伤/修复、肿瘤发生及糖代谢调节中起着重要作用。有研究证实予以TNF-α刺激血管外膜细胞，FOXO1的表达明显增加，同时细胞凋亡增加[10]，提示FOXO1可能参与了TNF-α诱导的细胞凋亡过程。本实验室李理等[11]通过转染FOXO1真核表达载体入ALI细胞炎症模型，研究发现细胞凋亡水平上调，细胞内促凋亡蛋白Bim表达增多，说明FOXO1在ALI的炎症细胞中可能起到促进细胞凋亡的作用。这与在研究原发性纵隔B淋巴细胞瘤某些细胞表型，增强FOXO1的表达可引起细胞生长停滞及凋亡[12]相一致。但其具体的作用机制尚不清楚，有待进一步探讨。
基因芯片技术是在分子生物学、人类基因组计划的基础上产生和发展起来的，拥有高度并行性、高通量、微型化等显著特点。目前，基因芯片技术可用于检测炎症氧化、应激相关基因表达等，是ALI分子水平研究的重要工具。该研究建立于FOXO1基因在炎症状态下A549细胞高表达的基础上，应用人类表达谱芯片成功筛选出FOXO1转染TNF-α诱导A549细胞后差异表达的基因，RNA QC验证芯片结果可靠。基因芯片筛选出表达差异基因共554个，其中上调基因317个，下调基因237个。这些差异表达基因在细胞增殖、分化、凋亡以及细胞粘附和细胞周期等细胞生理过程中发挥重要调控作用，参与细胞的信号转导、侵袭和转移等过程。
表达上调的基因中，CDK1、PLK5、CASP1、FAS、BAD等与细胞周期调控、增殖、凋亡等有密切关系。周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK1是细胞周期调控中的重要因子，Jacquot等[13]通过上调CDK1的表达发现可导致非小细胞肺癌细胞株增殖抑制。PLK5是PLK激酶家族成员，可抑制神经细胞的分化与胶质母细胞瘤的形成[14]。CASP1也可称为白细胞介素1β(IL-1β)转换酶，通过促进炎症因子的加工和释放而调控细胞的炎症反应，同时还能介导程序性细胞凋亡[15]。死亡受体FAS是肿瘤坏死因子受体家族重要成员，经FAS/FASL通路转导死亡信号诱导细胞凋亡[16]。BAD是Bcl-2家族中与Bcl-2和Bcl-xL相关的促凋亡基因，主要通过线粒体途径促进细胞凋亡[17]。
表达下调的基因中，BCL2、CAT、SOD1、APC、CDK5等与细胞凋亡、抗氧化、信号转导、增殖等密切相关。BCL2作为BCL2家族的主要代表，主要存在于线粒体外膜和胞质中，在外源性凋亡途径和内源性凋亡途径中均有重要作用。CAT基因编码的蛋白是过氧化氢酶，是人体内很重要的一种抗氧化酶，可通过催化超氧阴离子自由基的自身氧化还原反应，清除氧自由基，避免损伤机体组织细胞。SOD1是超氧化物歧化酶SOD家族的成员之一，是SOD的主要形式，是生物体内重要的抗氧化酶。肿瘤抑制基因APC是WNT信号转导组分，可调节细胞增殖、迁移等[18]。细胞周期素依赖蛋白激酶CDK5作为一种多功能激酶，其主要功能是参与神经细胞生长发育和信号传导调控[19]。
与其他研究方法相比，应用基因芯片技术可以快速准确地获取增强FOXO1表达后TNF-α诱导的A549细胞中的差异表达基因的信息，从而预测这些基因间的相互关系及功能，以及与FOXO1基因的调控关系。然而基因芯片的结果局限在基因的转录水平变化，不具有广泛性。
综上所述，本研究通过体外模拟建立ALI细胞炎症性损伤模型，并增强FOXO1基因的表达，利用基因芯片技术获取了差异表达基因，并分析了许多FOXO1可能作用的候选基因作为预测FOXO1在ALI细胞炎症反应中发生作用的靶点，为深入探讨FOXO1在ALI中的作用机制提供了线索。
