引用本文： 李洁, 戴爱国, 胡瑞成, 刘晓燕, 孔春初. 慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中 ATF3 与 ATF4 对 γ-GCS 表达的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2017, 16(1): 9-14. doi: 10.7507/1671-6205.201606052 复制
慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是一种常见的以持续性气流受限为特征的疾病，气流受限进行性发展，与气道和肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关[1]。慢阻肺的发病机制尚未完全明了，目前认为吸入有害颗粒或气体引起肺内氧化应激是其主要发病机制之一[1]。谷胱甘肽（GSH）是肺内抵御内外源性氧化应激的关键抗氧化剂。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是 GSH 合成反应中的限速酶，决定 GSH 生物合成的速率和量，其全酶是由 γ-GCS 重链亚基（γ-GCS-HS）和 γ-GCS 轻链亚基（γ-GCS-LS）组成的异二聚体，在人类染色体上分别定位于 6p12和 1p21，分子量分别约为 73 kD 和 30 kD[2]。γ-GCS-HS含有所有底物和催化亚基的结合位点，具有全酶的催化功能[3]。我们的多个前期研究已表明γ-GCS可通过促进GSH合成增加，参与局部抗氧化作用[4]。近年来多个研究发现活化转录因子 3（ATF3）与活化转录因子4（ATF4）的高表达有助于减轻氧化应激反应[5-7]。我室前期已在动物实验中发现 ATF3 和 ATF4 对抗氧化基因 γ-GCS 的表达起重要作用，在慢阻肺大鼠氧化应激状态下两者具有明显相关关系[8]。本研究拟进一步从临床角度观察转录因子 ATF3、ATF4 的表达变化以及对抗氧化通路 γ-GCS-HS 表达的影响，进一步探索及明确它们在慢阻肺发病机制中的作用及意义。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
1.1.1 标本来源及选择标准 收集湖南省肿瘤医院胸外科 2008 年 12 月至 2009 年 12 月因肺癌行肺叶或肺段切除术者 40 例。所有受试者均知情同意。将符合我国 2007 年制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2007 年版）》诊断标准并除外肿瘤所致气道阻塞肺功能异常者归为慢阻肺组（20 例），其余患者归为对照组（20 例）。所有患者术前未经抗肿瘤治疗（包括分子靶向药物治疗及放化疗）并收集以下数据：患者年龄、性别、吸烟指数、肺功能、胸部 X 线片、心电图、胸部 CT、病检结果等。排除标准[9-10]：（1）合并其他慢性呼吸系统疾病，如活动性肺结核、支气管扩张、支气管哮喘、肺炎、间质性肺疾病、肺栓塞等；（2）合并睡眠呼吸障碍；（3）合并严重心脑血管系统、内分泌、肝肾和造血系统疾病；（4）有严重的免疫缺陷及免疫系统疾病，如结缔组织疾病、痛风等；（5）有精神和心理疾病者或任何影响依从性的因素；（6）合并其他过敏性疾病史及恶性肿瘤疾病。本研究获得湖南省肿瘤医院伦理委员会批准。
1.1.2 标本采集 参照文献[3]取材，取材标本均为远离肺癌原发病灶 5 cm 以上、肉眼观察无肺癌浸润的外周肺组织。取其中一块以 10% 福尔马林溶液固定 6 h，常规取材、脱水、石蜡包埋，切片厚约 3 ～ 4 μm，行 HE 染色观察组织形态学变化，行免疫组化及原位杂交检测目的蛋白的表达变化。
1.2 方法
1.2.1 原位杂交 （1）寡核苷酸探针：地高辛标记的多相寡核苷酸探针购自武汉博士德生物工程有限公司。ATF3 mRNA 探针针对靶基因序列：① 5 ′ -CAGAACAAGCACCTCTGCCACCGGATGTCCTCTGC-3′；② 5′-TACATGCTCAACCTTCATCGGCCCACGTGTATTGT-3′；③ 5′-TTTATCCAACAGATAAAAGAAGGAACATTGCAGAG-3′。ATF4 mRNA 探针针对靶基因序列：① 5′-GATTGGATGTTGGAGAAAATGGATTTGAAGGAGTT-3′；② 5′-GATGACACTTGTGATCTCTTTGCCCCCCTAGTCCA-3′；③ 5′-AGGTACCGCCAGAAGAAGAGGGCGGAGCAGGAGGC-3′。γ-GCS-HS mRNA 探针针对靶基因序列：① 5′-TGCACATCTACCACGCAGTCAAGGACCGGC-3'；② 5′-ATATTCAGTCCACAAACTGGCAGACAATGA-3'；③ 5′-AGTACACGGAGCATAGACACCATCA-3'。（2）实验步骤：取临床肺组织石蜡块连续切片（5 μm 厚）用原位杂交专用载玻片捞片，65 ℃ 烤片 3 h，常规脱蜡、入水，3% 双氧水室温处理 10 min 灭活内源性过氧化物酶，3% 柠檬酸稀释的胃蛋白酶消化，滴加预杂交液预杂交，地高辛标记核苷酸探针湿盒杂交过夜，封闭，滴加生物素化鼠抗地高辛，链酶亲和素、生物素复合体（SABC）孵育，滴加生物素化过氧化物酶，经二氨基联苯胺（DAB）显色、苏木素复染后，脱水、透明、封片、拍片。以不含探针的杂交液作阴性对照。显微显影系统（日本 Olympus 公司）采集图像，以胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，随机选择内径为 100～200 μm 的细小支气管和肺泡区各 3 个不同视野以 JD 病理图像分析系统（江苏省捷达科技发展有限公司）作图像分析，根据着色强度分为：阴性（－，无黄色），弱阳性（+，浅黄色），阳性（++，棕黄色），强阳性（+++，深黄色或棕褐色）。测量并计算阳性信号光密度（A 值）均值，取中位数，作为衡量指标。
1.2.2 免疫组化 参照文献 [11]，临床肺组织标本固定、脱水，石蜡包埋同原位杂交。按 SP 检测试剂盒进行操作，以 PBS 代替一抗作阴性对照。在显微镜下根据着色程度判定阳性强度同原位杂交。JD 病理图像分析系统采集和分析图像：每个肺组织标本随机观察 1 张切片，选择内径为 100～200 μm 的细支气管和肺泡区各 3 个视野，自动选取阳性区域，测定A值，取平均值作为衡量阳性信号强弱的指标。
1.2.3 免疫共沉淀法（CO-IP）检测 于液氮中取出临床肺组织标本，按照 RIPA 总蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白，采用 BCA 法测定蛋白浓度。冰上裂解 30 min，4 ℃ 12 000 ×g 离心 5 min，收集
1.3 统计学方法
应用 SPSS 16.0 统计学软件进行统计分析。计量资料数据采用均数 ± 标准差（ ±s）表示，两组均数间的比较采用两独立样本t 检验；计数资料用构成比表示，两样本构成比比较采用 χ2 检验；相关性分析采用直线相关法。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 基本资料比较
两组患者年龄、性别、取材部位及肿瘤类别上差异无统计学意义（P＞0.05），但慢阻肺组吸烟指数明显高于对照组，有统计学意义（P＜0.01）。慢阻肺组第 1 秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV1%pred）、第 1 秒用力呼气容积占用力肺活量百分比（FEV1/FVC）均较对照组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果见表 1。
表1
两组患者临床数据比较（n=20，
）
2.2 肺组织形态学改变
光镜下可见慢阻肺组支气管肺内出现炎细胞浸润；支气管上皮部分脱落，其内分泌物增加，支气管平滑肌增生，管腔狭窄；肺泡壁变薄，出现不同程度的断裂，部分肺泡融合成肺大疱。对照组患者支气管和肺泡结构正常。结果见图 1。
图1
肺组织形态学特征（HE ×200） a．对照组； b．慢阻肺组
2.3 肺组织中 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 的 mRNA 表达
原位杂交结果：ATF3、ATF4、γ-GCS-HS mRNA 在两组患者肺组织中的表达部位基本一致，主要见于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、平滑肌细胞及血管内皮细胞。ATF3、ATF4、γ-GCS-HS mRNA 表达在慢阻肺组均显著高于对照组（P＜0.01）。结果见表 2 和图 2。
表2
两组患者肺组织 ATF3、ATF4 和 γ-GCS-HS mRNA 的表达（n=20，A 值，
）
图2
肺组织支气管上皮细胞ATF3、ATF4和γ-GCS-HS mRNA的表达（DAB ×200） a．对照组； b．慢阻肺组
2.4 肺组织中 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白 的表达
免疫组化结果显示 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白主要表达于支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞，小血管平滑肌中亦有少许表达，且在表达部位的胞浆胞核均有免疫着色，以胞核表达为主。图像定量分析示慢阻肺组 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白表达高于对照组（P＜0.01）。结果见表 3 和图 3。
表3
肺组织 ATF3、ATF4 和 γ-GCS-HS 蛋白的表达（n=20，
）
图3
肺组织支气管上皮细胞中 ATF3、ATF4 和 γ-GCS-HS 蛋白的表达（DAB ×200） a．对照组； b．慢阻肺组
2.5 肺组织中 γ-GCS-HS 蛋白与 ATF3、ATF4 蛋白的相互作用
免疫共沉淀结果显示在 γ-GCS-HS 抗体捕获的免疫沉淀中，ATF3、ATF4 抗体均可与其杂交出明显的蛋白条带，且慢阻肺组较对照组明显增强（P＜0.01）。结果见图 4。
图4
免疫共沉淀检测 ATF3、ATF4 与 γ-GCS-HS 蛋白的相互关系
2.6 相关性分析
直线相关分析显示，ATF3、ATF4 蛋白表达与 γ-GCS-HS mRNA 及蛋白表达均呈明显正相关（P＜0.01），ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白与FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈明显正相关（P＜0.01）。结果见表 4 和表 5。
表4
肺组织 ATF3、ATF4 蛋白与 γ-GCS-HS 表达的相关分析
表5
肺组织 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白与 FEV1%pred、FEV1/FVC 的相关分析
3 讨论
本研究通过收集临床患者肺组织标本，比较各组患者的病理形态学特点及肺功能等指标，结果显示慢阻肺组患者肺功能（FEV1/FVC、FEV1%pred）显著低于对照组，吸烟指数显著高于对照组；光镜下慢阻肺组肺组织病理学改变示支气管黏膜上皮细胞变性、坏死、脱落，炎细胞浸润，气道损伤、气道重塑，肺泡壁变薄，肺泡腔扩大、破裂或融合成大疱，肺血管床破坏，肺小动脉血管壁明显增厚，管腔狭窄，符合慢阻肺形态学诊断标准。而对照组未见以上情况。以上结果提示吸烟是慢阻肺发病的主要危险因素之一，且本研究的临床肺组织标本符合试验要求，具有研究意义。
氧化应激是慢阻肺的主要发病机制之一，γ-GCS 是慢阻肺中最重要的抗氧化酶之一，是抗氧化剂 GSH 生物合成限速酶，受 GSH 反馈调节，γ-GCS 的转录活性和表达水平反映了机体细胞的抗氧化能力[12]。本研究中，γ-GCS mRNA 及蛋白在慢阻肺组患者细支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中均呈强阳性表达，且 γ-GCS mRNA 及蛋白表达水平在慢阻肺组较对照组显著升高，表明慢阻肺组患者的肺组织内存在氧化应激，氧化应激诱导抗氧化酶 γ-GCS 代偿性上调，通过促进抗氧化剂 GSH 合成增加，参与局部抗氧化作用，与我们的前期研究结果一致[13]。
ATF/CREB 家族成员 ATF3 和 ATF4 作为转录因子，其转录调控作用机制复杂，越来越多的研究表明 ATF3、ATF4 在静息细胞中弱表达于胞浆和/或胞核[14]。氧化应激状态下，它们在胞核的表达增强并依靠其 bZIP 与家族中同源蛋白或其他同样含 bZIP 区的蛋白，如 FOS、Jun、CCAAT/ 增强结合蛋白（C/EBPs）、Maf 家族、NF-κB、Nrf2 等，形成异二聚体，改变它们的 DNA 结合特异性及转录活性，对下游靶基因发挥转录调控作用[15-16]。近来研究发现，在氧化应激状况下，ATF3 与 ATF4 基因缺失可导致体内重要的抗氧化物质 GSH 合成减少，活性氧的产生增多，增加机体细胞 DNA 的损伤[17-18]。以上结果提示 ATF3 和 ATF4 作为转录活化因子可能调控抗氧化基因的表达，在氧化/抗氧化过程中具有重要作用。本研究在前期动物实验基础上，进一步从临床试验角度进行观察。结果显示在临床患者肺组织中 ATF3 与 ATF4 蛋白及 mRNA 在慢阻肺组均较对照组均显著增高，以胞核表达为主，其表达部位与 γ-GCS 蛋白及 mRNA 表达部位基本一致，其强度与 γ-GCS 蛋白表达呈正相关。此外，免疫共沉淀结果显示 ATF3、ATF4 与 γ-GCS-HS 可杂交出明显的蛋白条带，且慢阻肺组显著高于对照组，提示 ATF3、ATF4 与 γ-GCS-HS 蛋白之间存在直接相互作用关系。以上结果提示慢阻肺组患者肺内存在明显氧化损伤，在氧化应激状况下，ATF3 与 ATF4 作为应激反应早期应答因子表达明显上调，影响抗氧化酶 γ-GCS 的表达，从而调节细胞氧化还原能力，抵抗氧化应激。
综上所述，我们的研究表明，在慢阻肺患者发病过程中，转录因子 ATF3、ATF4 的表达明显上调，可能通过调控抗氧化基因 γ-GCS 的表达而发挥抗氧化保护作用，对其相关机制的深入研究可能为慢阻肺的防治提供新的对策。
慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是一种常见的以持续性气流受限为特征的疾病，气流受限进行性发展，与气道和肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关[1]。慢阻肺的发病机制尚未完全明了，目前认为吸入有害颗粒或气体引起肺内氧化应激是其主要发病机制之一[1]。谷胱甘肽（GSH）是肺内抵御内外源性氧化应激的关键抗氧化剂。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是 GSH 合成反应中的限速酶，决定 GSH 生物合成的速率和量，其全酶是由 γ-GCS 重链亚基（γ-GCS-HS）和 γ-GCS 轻链亚基（γ-GCS-LS）组成的异二聚体，在人类染色体上分别定位于 6p12和 1p21，分子量分别约为 73 kD 和 30 kD[2]。γ-GCS-HS含有所有底物和催化亚基的结合位点，具有全酶的催化功能[3]。我们的多个前期研究已表明γ-GCS可通过促进GSH合成增加，参与局部抗氧化作用[4]。近年来多个研究发现活化转录因子 3（ATF3）与活化转录因子4（ATF4）的高表达有助于减轻氧化应激反应[5-7]。我室前期已在动物实验中发现 ATF3 和 ATF4 对抗氧化基因 γ-GCS 的表达起重要作用，在慢阻肺大鼠氧化应激状态下两者具有明显相关关系[8]。本研究拟进一步从临床角度观察转录因子 ATF3、ATF4 的表达变化以及对抗氧化通路 γ-GCS-HS 表达的影响，进一步探索及明确它们在慢阻肺发病机制中的作用及意义。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
1.1.1 标本来源及选择标准 收集湖南省肿瘤医院胸外科 2008 年 12 月至 2009 年 12 月因肺癌行肺叶或肺段切除术者 40 例。所有受试者均知情同意。将符合我国 2007 年制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2007 年版）》诊断标准并除外肿瘤所致气道阻塞肺功能异常者归为慢阻肺组（20 例），其余患者归为对照组（20 例）。所有患者术前未经抗肿瘤治疗（包括分子靶向药物治疗及放化疗）并收集以下数据：患者年龄、性别、吸烟指数、肺功能、胸部 X 线片、心电图、胸部 CT、病检结果等。排除标准[9-10]：（1）合并其他慢性呼吸系统疾病，如活动性肺结核、支气管扩张、支气管哮喘、肺炎、间质性肺疾病、肺栓塞等；（2）合并睡眠呼吸障碍；（3）合并严重心脑血管系统、内分泌、肝肾和造血系统疾病；（4）有严重的免疫缺陷及免疫系统疾病，如结缔组织疾病、痛风等；（5）有精神和心理疾病者或任何影响依从性的因素；（6）合并其他过敏性疾病史及恶性肿瘤疾病。本研究获得湖南省肿瘤医院伦理委员会批准。
1.1.2 标本采集 参照文献[3]取材，取材标本均为远离肺癌原发病灶 5 cm 以上、肉眼观察无肺癌浸润的外周肺组织。取其中一块以 10% 福尔马林溶液固定 6 h，常规取材、脱水、石蜡包埋，切片厚约 3 ～ 4 μm，行 HE 染色观察组织形态学变化，行免疫组化及原位杂交检测目的蛋白的表达变化。
1.2 方法
1.2.1 原位杂交 （1）寡核苷酸探针：地高辛标记的多相寡核苷酸探针购自武汉博士德生物工程有限公司。ATF3 mRNA 探针针对靶基因序列：① 5 ′ -CAGAACAAGCACCTCTGCCACCGGATGTCCTCTGC-3′；② 5′-TACATGCTCAACCTTCATCGGCCCACGTGTATTGT-3′；③ 5′-TTTATCCAACAGATAAAAGAAGGAACATTGCAGAG-3′。ATF4 mRNA 探针针对靶基因序列：① 5′-GATTGGATGTTGGAGAAAATGGATTTGAAGGAGTT-3′；② 5′-GATGACACTTGTGATCTCTTTGCCCCCCTAGTCCA-3′；③ 5′-AGGTACCGCCAGAAGAAGAGGGCGGAGCAGGAGGC-3′。γ-GCS-HS mRNA 探针针对靶基因序列：① 5′-TGCACATCTACCACGCAGTCAAGGACCGGC-3'；② 5′-ATATTCAGTCCACAAACTGGCAGACAATGA-3'；③ 5′-AGTACACGGAGCATAGACACCATCA-3'。（2）实验步骤：取临床肺组织石蜡块连续切片（5 μm 厚）用原位杂交专用载玻片捞片，65 ℃ 烤片 3 h，常规脱蜡、入水，3% 双氧水室温处理 10 min 灭活内源性过氧化物酶，3% 柠檬酸稀释的胃蛋白酶消化，滴加预杂交液预杂交，地高辛标记核苷酸探针湿盒杂交过夜，封闭，滴加生物素化鼠抗地高辛，链酶亲和素、生物素复合体（SABC）孵育，滴加生物素化过氧化物酶，经二氨基联苯胺（DAB）显色、苏木素复染后，脱水、透明、封片、拍片。以不含探针的杂交液作阴性对照。显微显影系统（日本 Olympus 公司）采集图像，以胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，随机选择内径为 100～200 μm 的细小支气管和肺泡区各 3 个不同视野以 JD 病理图像分析系统（江苏省捷达科技发展有限公司）作图像分析，根据着色强度分为：阴性（－，无黄色），弱阳性（+，浅黄色），阳性（++，棕黄色），强阳性（+++，深黄色或棕褐色）。测量并计算阳性信号光密度（A 值）均值，取中位数，作为衡量指标。
1.2.2 免疫组化 参照文献 [11]，临床肺组织标本固定、脱水，石蜡包埋同原位杂交。按 SP 检测试剂盒进行操作，以 PBS 代替一抗作阴性对照。在显微镜下根据着色程度判定阳性强度同原位杂交。JD 病理图像分析系统采集和分析图像：每个肺组织标本随机观察 1 张切片，选择内径为 100～200 μm 的细支气管和肺泡区各 3 个视野，自动选取阳性区域，测定A值，取平均值作为衡量阳性信号强弱的指标。
1.2.3 免疫共沉淀法（CO-IP）检测 于液氮中取出临床肺组织标本，按照 RIPA 总蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白，采用 BCA 法测定蛋白浓度。冰上裂解 30 min，4 ℃ 12 000 ×g 离心 5 min，收集
1.3 统计学方法
应用 SPSS 16.0 统计学软件进行统计分析。计量资料数据采用均数 ± 标准差（ ±s）表示，两组均数间的比较采用两独立样本t 检验；计数资料用构成比表示，两样本构成比比较采用 χ2 检验；相关性分析采用直线相关法。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 基本资料比较
两组患者年龄、性别、取材部位及肿瘤类别上差异无统计学意义（P＞0.05），但慢阻肺组吸烟指数明显高于对照组，有统计学意义（P＜0.01）。慢阻肺组第 1 秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV1%pred）、第 1 秒用力呼气容积占用力肺活量百分比（FEV1/FVC）均较对照组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果见表 1。
表1
两组患者临床数据比较（n=20，
）
2.2 肺组织形态学改变
光镜下可见慢阻肺组支气管肺内出现炎细胞浸润；支气管上皮部分脱落，其内分泌物增加，支气管平滑肌增生，管腔狭窄；肺泡壁变薄，出现不同程度的断裂，部分肺泡融合成肺大疱。对照组患者支气管和肺泡结构正常。结果见图 1。
图1
肺组织形态学特征（HE ×200） a．对照组； b．慢阻肺组
2.3 肺组织中 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 的 mRNA 表达
原位杂交结果：ATF3、ATF4、γ-GCS-HS mRNA 在两组患者肺组织中的表达部位基本一致，主要见于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、平滑肌细胞及血管内皮细胞。ATF3、ATF4、γ-GCS-HS mRNA 表达在慢阻肺组均显著高于对照组（P＜0.01）。结果见表 2 和图 2。
表2
两组患者肺组织 ATF3、ATF4 和 γ-GCS-HS mRNA 的表达（n=20，A 值，
）
图2
肺组织支气管上皮细胞ATF3、ATF4和γ-GCS-HS mRNA的表达（DAB ×200） a．对照组； b．慢阻肺组
2.4 肺组织中 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白 的表达
免疫组化结果显示 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白主要表达于支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞，小血管平滑肌中亦有少许表达，且在表达部位的胞浆胞核均有免疫着色，以胞核表达为主。图像定量分析示慢阻肺组 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白表达高于对照组（P＜0.01）。结果见表 3 和图 3。
表3
肺组织 ATF3、ATF4 和 γ-GCS-HS 蛋白的表达（n=20，
）
图3
肺组织支气管上皮细胞中 ATF3、ATF4 和 γ-GCS-HS 蛋白的表达（DAB ×200） a．对照组； b．慢阻肺组
2.5 肺组织中 γ-GCS-HS 蛋白与 ATF3、ATF4 蛋白的相互作用
免疫共沉淀结果显示在 γ-GCS-HS 抗体捕获的免疫沉淀中，ATF3、ATF4 抗体均可与其杂交出明显的蛋白条带，且慢阻肺组较对照组明显增强（P＜0.01）。结果见图 4。
图4
免疫共沉淀检测 ATF3、ATF4 与 γ-GCS-HS 蛋白的相互关系
2.6 相关性分析
直线相关分析显示，ATF3、ATF4 蛋白表达与 γ-GCS-HS mRNA 及蛋白表达均呈明显正相关（P＜0.01），ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白与FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈明显正相关（P＜0.01）。结果见表 4 和表 5。
表4
肺组织 ATF3、ATF4 蛋白与 γ-GCS-HS 表达的相关分析
表5
肺组织 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白与 FEV1%pred、FEV1/FVC 的相关分析
3 讨论
本研究通过收集临床患者肺组织标本，比较各组患者的病理形态学特点及肺功能等指标，结果显示慢阻肺组患者肺功能（FEV1/FVC、FEV1%pred）显著低于对照组，吸烟指数显著高于对照组；光镜下慢阻肺组肺组织病理学改变示支气管黏膜上皮细胞变性、坏死、脱落，炎细胞浸润，气道损伤、气道重塑，肺泡壁变薄，肺泡腔扩大、破裂或融合成大疱，肺血管床破坏，肺小动脉血管壁明显增厚，管腔狭窄，符合慢阻肺形态学诊断标准。而对照组未见以上情况。以上结果提示吸烟是慢阻肺发病的主要危险因素之一，且本研究的临床肺组织标本符合试验要求，具有研究意义。
氧化应激是慢阻肺的主要发病机制之一，γ-GCS 是慢阻肺中最重要的抗氧化酶之一，是抗氧化剂 GSH 生物合成限速酶，受 GSH 反馈调节，γ-GCS 的转录活性和表达水平反映了机体细胞的抗氧化能力[12]。本研究中，γ-GCS mRNA 及蛋白在慢阻肺组患者细支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中均呈强阳性表达，且 γ-GCS mRNA 及蛋白表达水平在慢阻肺组较对照组显著升高，表明慢阻肺组患者的肺组织内存在氧化应激，氧化应激诱导抗氧化酶 γ-GCS 代偿性上调，通过促进抗氧化剂 GSH 合成增加，参与局部抗氧化作用，与我们的前期研究结果一致[13]。
ATF/CREB 家族成员 ATF3 和 ATF4 作为转录因子，其转录调控作用机制复杂，越来越多的研究表明 ATF3、ATF4 在静息细胞中弱表达于胞浆和/或胞核[14]。氧化应激状态下，它们在胞核的表达增强并依靠其 bZIP 与家族中同源蛋白或其他同样含 bZIP 区的蛋白，如 FOS、Jun、CCAAT/ 增强结合蛋白（C/EBPs）、Maf 家族、NF-κB、Nrf2 等，形成异二聚体，改变它们的 DNA 结合特异性及转录活性，对下游靶基因发挥转录调控作用[15-16]。近来研究发现，在氧化应激状况下，ATF3 与 ATF4 基因缺失可导致体内重要的抗氧化物质 GSH 合成减少，活性氧的产生增多，增加机体细胞 DNA 的损伤[17-18]。以上结果提示 ATF3 和 ATF4 作为转录活化因子可能调控抗氧化基因的表达，在氧化/抗氧化过程中具有重要作用。本研究在前期动物实验基础上，进一步从临床试验角度进行观察。结果显示在临床患者肺组织中 ATF3 与 ATF4 蛋白及 mRNA 在慢阻肺组均较对照组均显著增高，以胞核表达为主，其表达部位与 γ-GCS 蛋白及 mRNA 表达部位基本一致，其强度与 γ-GCS 蛋白表达呈正相关。此外，免疫共沉淀结果显示 ATF3、ATF4 与 γ-GCS-HS 可杂交出明显的蛋白条带，且慢阻肺组显著高于对照组，提示 ATF3、ATF4 与 γ-GCS-HS 蛋白之间存在直接相互作用关系。以上结果提示慢阻肺组患者肺内存在明显氧化损伤，在氧化应激状况下，ATF3 与 ATF4 作为应激反应早期应答因子表达明显上调，影响抗氧化酶 γ-GCS 的表达，从而调节细胞氧化还原能力，抵抗氧化应激。
综上所述，我们的研究表明，在慢阻肺患者发病过程中，转录因子 ATF3、ATF4 的表达明显上调，可能通过调控抗氧化基因 γ-GCS 的表达而发挥抗氧化保护作用，对其相关机制的深入研究可能为慢阻肺的防治提供新的对策。
