引用本文： 鲍文华, 王瑾, 李树民, 杨晓东, 马雪梅. Th9细胞相关因子在肺纤维化大鼠中的作用. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(3): 227-231. doi: 10.7507/1671-6205.2016054 复制
肺纤维化是一种病因不明的弥漫性肺间质性疾病，以肺泡炎症、成纤维细胞增殖、细胞外基质沉积为特点的疾病。研究表明，纯化的T细胞可以刺激成纤维细胞增殖，进一步导致细胞外基质沉积[1]。Th9细胞是一种炎症细胞，目前认为Th9细胞功能具有双向性，既可以促进炎症，亦可以抑制炎症发生。PU.1和干扰素调节因子4(IRF4)是目前公认的Th9细胞相对特异性的转录因子[2]，白细胞介素4(IL-4)是Th9细胞的诱导因子之一。Th9细胞作为辅助性T细胞的一个新亚群，已有实验表明细胞在支气管哮喘和溃疡性结肠炎等炎症和免疫性疾病中起作用，但在肺纤维化疾病中鲜少研究。本实验观察肺纤维化大鼠PU.1、IRF4的表达量，探讨IRF4和IL-4的关系，旨在阐明Th9细胞相关因子在肺纤维化中的作用。
材料与方法
一 材料
博来霉素购自Sigma公司，大鼠IL-4 ELISA试剂盒由上海劲马公司提供，Trizol试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒由哈尔滨海基生物公司提供。光学显微镜为奥林巴斯公司产品，酶标仪为Bio-Rad公司产品，PCR仪为Bio-Rad Min-Opticon2。
二 方法
1.模型建立：90只SPF级SD大鼠(佳木斯大学动物实验中心)，6~8周龄，体重200~230 g，适应性饲养10 d，按随机数字表法分为3组：健康对照组、肺纤维化组和地塞米松干预组，各组30只大鼠。肺纤维化组处理方案参照文献[3]的方法并在此方案上改进，将5 mg/kg博来霉素气管内注入制作肺纤维化模型，地塞米松干预组在肺纤维化模型基础上第8 d开始每天腹腔注入3 mg/kg地塞米松，健康对照组用生理盐水替代博来霉素，三组分别在第7 d、第14 d、第28 d各处死10只大鼠。
2.支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集：切开胸部，暴露气管和主支气管，结扎右主支气管，用14号针头插入气管中，结扎，经气管注入生理盐水2 mL，抽吸混匀，反复灌洗3次，共收集BALF 4 mL，1 500 r/min，离心15 min，上清液置于－80 ℃保存。
3.肺组织标本的留取：暴露气管与双肺，分离肺组织，用止血钳夹闭右肺门并结扎，立即取下右肺，PBS冲洗肺脏表面，用滤纸拭干，将肺组织给予4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片，用于苏木精-伊红(HE)染色。
4.PU.1和IRF4 mRNA测定：离心处理BALF，留取沉淀，采用Trizol法抽提RNA，逆转录为cDNA，实时荧光PCR检测PU.1 mRNA、IRF4 mRNA表达水平，引物由Primer 5.0软件自行设计，引物由南京Genscript公司合成，引物序列分别为PU.1：5′-TGC TTCCCTTATCCACCCTTG-3′(上游)，5′-TCTTCTTGC TGCCTGTCTCC-3′(下游)；IRF4：5′-AGAATGCCAGG ACCACAGAG-3′(上游)，5′-CTTAGTCAGTCACCAA TCTCAGC-3′(下游)；内参照GAPDH：5′-AACTCC CATTCTTCCACCTTT-3′(上游)，5′-CTCTTGCTCTC AGTATCCTTG-3′(下游)。通过检测模板梯度稀释时的CT值的变化来评价目的基因和内参基因的扩增效率，采用相对定量法，以2-△△Ct表示样本中目的基因相对表达含量。
5.IL-4测定：采用ELISA法检测外周血IL-4含量，严格按照试剂盒说明书操作，采用全自动酶标仪依序测量450 nm处各孔的吸光度，通过标准曲线计算IL-4含量。
三 统计学处理
采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，计量资料以x±s描述，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，若数据符合方差齐性，采用LSD-t检验进行多重比较；若数据方差不齐，采用非参数秩和检验。相关性分析采用Pearson法。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
一 肺组织病理学变化
健康对照组在各时间点肺组织结构完整，肺泡间隔无增厚，无明显炎症反应和纤维化改变。肺纤维化组大鼠肺组织早期为肺泡炎表现，肺间质和肺泡腔内可见大量巨噬细胞等炎症细胞浸润，此后肺泡炎随时间推移逐渐减轻，第14 d部分肺泡结构消失，炎症细胞浸润稍减少，肺泡间隔增宽，成纤维细胞增生；第28 d肺泡结构破坏，肺泡结构紊乱，部分肺泡壁塌陷，肺泡间隔明显增宽，细胞外基质增生，纤维沉积明显，肺组织呈广泛纤维化改变。地塞米松干预组肺泡结构存在，炎症细胞浸润减少，肺泡间隔增厚明显减轻，肺纤维化程度明显轻于肺纤维化组。结果见图 1。
图1
各组大鼠肺组织病理像(HE×100)
a.健康对照组：肺组织结构完整，肺泡间隔无增厚，无明显炎症反应和纤维化改变；b.地塞米松干预组第14 d，c.地塞米松干预组第28 d：肺泡结构存在，炎症细胞浸润减少，肺泡间隔轻微增厚；d.肺纤维化组第7 d，e.肺纤维化组第14 d，f.肺纤维化组第28 d：早期表现为肺间质和肺泡腔内大量巨噬细胞等炎症细胞浸润，第14 d时部分肺泡结构消失，炎症细胞浸润稍减少，肺泡间隔增宽，成纤维细胞增生，第28 d时肺组织呈广泛纤维化改变
二 大鼠BALF中PU.1、IRF4 mRNA含量比较
肺纤维化组各时间点BALF中PU.1 mRNA含量明显高于健康对照组，与肺纤维化组比较，地塞米松干预组PU.1 mRNA含量第14 d和第28 d明显减低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。肺纤维化组PU.1 mRNA在第7 d表达增加，第14 d达到高峰，第28 d有所下降。
肺纤维化组各时间点BALF中IRF4 mRNA含量明显高于健康对照组，与肺纤维化组比较，地塞米松干预组第28dIRF4 mRNA含量明显减低，差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见表 1。
表1
大鼠BALF中PU.1、IRF4 mRNA含量比较(n=10, x±s)
三 大鼠外周血IL-4含量比较
肺纤维化组IL-4含量在第7 d和第14 d明显高于健康对照组，与肺纤维化组比较，地塞米松干预组第14 d含量明显减低，差异有统计学意义(P＜0.05)，外周血IL-4含量第28 d三组差异未见明显统计学意义。肺纤维化组IL-4在第7 d表达为增加趋势，第14 d达到高峰，第28 d有所下降。结果见表 2。
表2
大鼠外周血IL-4含量比较(n=10, x±s, pg/mL)
四 相关性分析
肺纤维化组第14 d的IRF4 mRNA含量与IL-4含量呈正相关(r=0.044，P＜0.05)。
3 讨论
Th9细胞是新近发现的一种CD4+辅助性T细胞，于2008年由Kuchroo实验室和Stockinger实验室最先报道，体外实验研究表明Th9细胞在IL-4和转化生长因子β(TGF-β)联合诱导条件下由初始CD4+T细胞分化而来[4]，或TGF-β单独存在下由Th2细胞转化而来[5]。PU.1和IRF4是Th9细胞相对特应性的转录因子，PU.1是ETS转录因子家族成员，由Sfpi1基因编码，PU.1促进幼稚淋巴细胞发育和增殖分化，参与未成熟淋巴细胞向T细胞方向分化；IRF4是干扰素调节因子家族成员，是分子量为52 kD的一种转录因子，它参与免疫细胞的分化成熟及免疫球蛋白的类型转换[6-7]。
Th9细胞参与机体炎症反应及多种免疫性疾病[8]。在呼吸系统疾病中Th9细胞在过敏性鼻炎、支气管哮喘等疾病中均有表达。Hoppenot等[9]纳入过敏性哮喘患者、过敏性鼻炎患者和正常人对照，分别测定血清Th9细胞、凋亡嗜酸粒细胞、IL-9和IL-5，发现过敏性哮喘患者Th9细胞表达量明显高于其他两组，而凋亡嗜酸粒细胞含量明显减少，Th9细胞及其因子IL-9与气道炎症有关。Jones等[10]研究发现Th9细胞可以通过向肺部募集并激活肥大细胞导致肺部过敏性损伤。肺纤维化虽然病因未明，但损伤的肺泡上皮细胞、单核-巨噬细胞和淋巴细胞浸润及其分泌的炎症介质促进肺纤维化的发生发展。本研究旨在探讨Th9细胞相关因子在肺纤维化中的炎症作用。
本研究发现，大鼠BALF中PU.1 mRNA、IRF4 mRNA及IL-4在肺纤维化过程中尤其是早期肺泡炎阶段表达量明显升高，推测主要是因为Th9细胞及其相关因子作为炎症细胞因子在肺纤维化过程中发挥炎症损伤作用。有观点认为肺纤维化是经过单一的炎症反应阶段之后快速出现异常的损伤修复[11]，肺纤维化主要包括肺泡炎症阶段和肺纤维化两个阶段，其中肺泡炎症阶段是肺纤维化发病的中心环节，它的持续存在与肺组织结构和功能不可逆损伤密切相关。活化巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、损伤的肺泡上皮细胞及其释放的多种蛋白酶、趋化因子、IL-1、IL-2、IL-8、胶原酶等均参与肺组织损伤及其修复的过程。PU.1绑定在IL-9基因位点上，通过促进IL-9基因组蛋白乙酰化促进Th9细胞的表达[12]。IRF4同样与其他转录因子形成复合物共同调节Th9细胞基因的活性[13]。IL-4作为一种炎症介质，参与多种疾病过程的炎症反应。Th9细胞本身及通过分泌效应因子IL-9、IL-10[5]，主要在肺泡炎阶段起作用，继而促进肺纤维化发生发展。与肺纤维化组比较，地塞米松干预组PU.1、IRF、IL-4的含量不同程度的减低，表明地塞米松干预下肺组织的炎症反应减轻。地塞米松作为糖皮质激素，通常认为其抗纤维化作用与抑制中性粒细胞、淋巴细胞浸润，抑制巨噬细胞增殖和分泌等有关[14-15]。
本研究结果还表明，大鼠肺纤维化早期IRF4 mRNA与IL-4的表达量呈明显正相关。Goswami等[16]认为IL-4可能通过STAT途径激活IRF4转录因子，促进Th9细胞的表达。IL-4通过STAT6途径激活B细胞激活转录因子(B cell activating transcription factor，BATF)，BATF可以作为IRF4的上游因子调节IRF4，并且与IRF4协同作用促进Th9细胞的表达[17]。
肺纤维化的发病机制目前尚未完全阐明，本研究结果初步显示Th9细胞在致大鼠肺纤维化中起作用，这可能与转录因子PU.1和IRF4有关，并且IL-4可能通过激活转录因子IRF4起作用，具体机制仍需进一步研究。
肺纤维化是一种病因不明的弥漫性肺间质性疾病，以肺泡炎症、成纤维细胞增殖、细胞外基质沉积为特点的疾病。研究表明，纯化的T细胞可以刺激成纤维细胞增殖，进一步导致细胞外基质沉积[1]。Th9细胞是一种炎症细胞，目前认为Th9细胞功能具有双向性，既可以促进炎症，亦可以抑制炎症发生。PU.1和干扰素调节因子4(IRF4)是目前公认的Th9细胞相对特异性的转录因子[2]，白细胞介素4(IL-4)是Th9细胞的诱导因子之一。Th9细胞作为辅助性T细胞的一个新亚群，已有实验表明细胞在支气管哮喘和溃疡性结肠炎等炎症和免疫性疾病中起作用，但在肺纤维化疾病中鲜少研究。本实验观察肺纤维化大鼠PU.1、IRF4的表达量，探讨IRF4和IL-4的关系，旨在阐明Th9细胞相关因子在肺纤维化中的作用。
材料与方法
一 材料
博来霉素购自Sigma公司，大鼠IL-4 ELISA试剂盒由上海劲马公司提供，Trizol试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒由哈尔滨海基生物公司提供。光学显微镜为奥林巴斯公司产品，酶标仪为Bio-Rad公司产品，PCR仪为Bio-Rad Min-Opticon2。
二 方法
1.模型建立：90只SPF级SD大鼠(佳木斯大学动物实验中心)，6~8周龄，体重200~230 g，适应性饲养10 d，按随机数字表法分为3组：健康对照组、肺纤维化组和地塞米松干预组，各组30只大鼠。肺纤维化组处理方案参照文献[3]的方法并在此方案上改进，将5 mg/kg博来霉素气管内注入制作肺纤维化模型，地塞米松干预组在肺纤维化模型基础上第8 d开始每天腹腔注入3 mg/kg地塞米松，健康对照组用生理盐水替代博来霉素，三组分别在第7 d、第14 d、第28 d各处死10只大鼠。
2.支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集：切开胸部，暴露气管和主支气管，结扎右主支气管，用14号针头插入气管中，结扎，经气管注入生理盐水2 mL，抽吸混匀，反复灌洗3次，共收集BALF 4 mL，1 500 r/min，离心15 min，上清液置于－80 ℃保存。
3.肺组织标本的留取：暴露气管与双肺，分离肺组织，用止血钳夹闭右肺门并结扎，立即取下右肺，PBS冲洗肺脏表面，用滤纸拭干，将肺组织给予4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片，用于苏木精-伊红(HE)染色。
4.PU.1和IRF4 mRNA测定：离心处理BALF，留取沉淀，采用Trizol法抽提RNA，逆转录为cDNA，实时荧光PCR检测PU.1 mRNA、IRF4 mRNA表达水平，引物由Primer 5.0软件自行设计，引物由南京Genscript公司合成，引物序列分别为PU.1：5′-TGC TTCCCTTATCCACCCTTG-3′(上游)，5′-TCTTCTTGC TGCCTGTCTCC-3′(下游)；IRF4：5′-AGAATGCCAGG ACCACAGAG-3′(上游)，5′-CTTAGTCAGTCACCAA TCTCAGC-3′(下游)；内参照GAPDH：5′-AACTCC CATTCTTCCACCTTT-3′(上游)，5′-CTCTTGCTCTC AGTATCCTTG-3′(下游)。通过检测模板梯度稀释时的CT值的变化来评价目的基因和内参基因的扩增效率，采用相对定量法，以2-△△Ct表示样本中目的基因相对表达含量。
5.IL-4测定：采用ELISA法检测外周血IL-4含量，严格按照试剂盒说明书操作，采用全自动酶标仪依序测量450 nm处各孔的吸光度，通过标准曲线计算IL-4含量。
三 统计学处理
采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，计量资料以x±s描述，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，若数据符合方差齐性，采用LSD-t检验进行多重比较；若数据方差不齐，采用非参数秩和检验。相关性分析采用Pearson法。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
一 肺组织病理学变化
健康对照组在各时间点肺组织结构完整，肺泡间隔无增厚，无明显炎症反应和纤维化改变。肺纤维化组大鼠肺组织早期为肺泡炎表现，肺间质和肺泡腔内可见大量巨噬细胞等炎症细胞浸润，此后肺泡炎随时间推移逐渐减轻，第14 d部分肺泡结构消失，炎症细胞浸润稍减少，肺泡间隔增宽，成纤维细胞增生；第28 d肺泡结构破坏，肺泡结构紊乱，部分肺泡壁塌陷，肺泡间隔明显增宽，细胞外基质增生，纤维沉积明显，肺组织呈广泛纤维化改变。地塞米松干预组肺泡结构存在，炎症细胞浸润减少，肺泡间隔增厚明显减轻，肺纤维化程度明显轻于肺纤维化组。结果见图 1。
图1
各组大鼠肺组织病理像(HE×100)
a.健康对照组：肺组织结构完整，肺泡间隔无增厚，无明显炎症反应和纤维化改变；b.地塞米松干预组第14 d，c.地塞米松干预组第28 d：肺泡结构存在，炎症细胞浸润减少，肺泡间隔轻微增厚；d.肺纤维化组第7 d，e.肺纤维化组第14 d，f.肺纤维化组第28 d：早期表现为肺间质和肺泡腔内大量巨噬细胞等炎症细胞浸润，第14 d时部分肺泡结构消失，炎症细胞浸润稍减少，肺泡间隔增宽，成纤维细胞增生，第28 d时肺组织呈广泛纤维化改变
二 大鼠BALF中PU.1、IRF4 mRNA含量比较
肺纤维化组各时间点BALF中PU.1 mRNA含量明显高于健康对照组，与肺纤维化组比较，地塞米松干预组PU.1 mRNA含量第14 d和第28 d明显减低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。肺纤维化组PU.1 mRNA在第7 d表达增加，第14 d达到高峰，第28 d有所下降。
肺纤维化组各时间点BALF中IRF4 mRNA含量明显高于健康对照组，与肺纤维化组比较，地塞米松干预组第28dIRF4 mRNA含量明显减低，差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见表 1。
表1
大鼠BALF中PU.1、IRF4 mRNA含量比较(n=10, x±s)
三 大鼠外周血IL-4含量比较
肺纤维化组IL-4含量在第7 d和第14 d明显高于健康对照组，与肺纤维化组比较，地塞米松干预组第14 d含量明显减低，差异有统计学意义(P＜0.05)，外周血IL-4含量第28 d三组差异未见明显统计学意义。肺纤维化组IL-4在第7 d表达为增加趋势，第14 d达到高峰，第28 d有所下降。结果见表 2。
表2
大鼠外周血IL-4含量比较(n=10, x±s, pg/mL)
四 相关性分析
肺纤维化组第14 d的IRF4 mRNA含量与IL-4含量呈正相关(r=0.044，P＜0.05)。
3 讨论
Th9细胞是新近发现的一种CD4+辅助性T细胞，于2008年由Kuchroo实验室和Stockinger实验室最先报道，体外实验研究表明Th9细胞在IL-4和转化生长因子β(TGF-β)联合诱导条件下由初始CD4+T细胞分化而来[4]，或TGF-β单独存在下由Th2细胞转化而来[5]。PU.1和IRF4是Th9细胞相对特应性的转录因子，PU.1是ETS转录因子家族成员，由Sfpi1基因编码，PU.1促进幼稚淋巴细胞发育和增殖分化，参与未成熟淋巴细胞向T细胞方向分化；IRF4是干扰素调节因子家族成员，是分子量为52 kD的一种转录因子，它参与免疫细胞的分化成熟及免疫球蛋白的类型转换[6-7]。
Th9细胞参与机体炎症反应及多种免疫性疾病[8]。在呼吸系统疾病中Th9细胞在过敏性鼻炎、支气管哮喘等疾病中均有表达。Hoppenot等[9]纳入过敏性哮喘患者、过敏性鼻炎患者和正常人对照，分别测定血清Th9细胞、凋亡嗜酸粒细胞、IL-9和IL-5，发现过敏性哮喘患者Th9细胞表达量明显高于其他两组，而凋亡嗜酸粒细胞含量明显减少，Th9细胞及其因子IL-9与气道炎症有关。Jones等[10]研究发现Th9细胞可以通过向肺部募集并激活肥大细胞导致肺部过敏性损伤。肺纤维化虽然病因未明，但损伤的肺泡上皮细胞、单核-巨噬细胞和淋巴细胞浸润及其分泌的炎症介质促进肺纤维化的发生发展。本研究旨在探讨Th9细胞相关因子在肺纤维化中的炎症作用。
本研究发现，大鼠BALF中PU.1 mRNA、IRF4 mRNA及IL-4在肺纤维化过程中尤其是早期肺泡炎阶段表达量明显升高，推测主要是因为Th9细胞及其相关因子作为炎症细胞因子在肺纤维化过程中发挥炎症损伤作用。有观点认为肺纤维化是经过单一的炎症反应阶段之后快速出现异常的损伤修复[11]，肺纤维化主要包括肺泡炎症阶段和肺纤维化两个阶段，其中肺泡炎症阶段是肺纤维化发病的中心环节，它的持续存在与肺组织结构和功能不可逆损伤密切相关。活化巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、损伤的肺泡上皮细胞及其释放的多种蛋白酶、趋化因子、IL-1、IL-2、IL-8、胶原酶等均参与肺组织损伤及其修复的过程。PU.1绑定在IL-9基因位点上，通过促进IL-9基因组蛋白乙酰化促进Th9细胞的表达[12]。IRF4同样与其他转录因子形成复合物共同调节Th9细胞基因的活性[13]。IL-4作为一种炎症介质，参与多种疾病过程的炎症反应。Th9细胞本身及通过分泌效应因子IL-9、IL-10[5]，主要在肺泡炎阶段起作用，继而促进肺纤维化发生发展。与肺纤维化组比较，地塞米松干预组PU.1、IRF、IL-4的含量不同程度的减低，表明地塞米松干预下肺组织的炎症反应减轻。地塞米松作为糖皮质激素，通常认为其抗纤维化作用与抑制中性粒细胞、淋巴细胞浸润，抑制巨噬细胞增殖和分泌等有关[14-15]。
本研究结果还表明，大鼠肺纤维化早期IRF4 mRNA与IL-4的表达量呈明显正相关。Goswami等[16]认为IL-4可能通过STAT途径激活IRF4转录因子，促进Th9细胞的表达。IL-4通过STAT6途径激活B细胞激活转录因子(B cell activating transcription factor，BATF)，BATF可以作为IRF4的上游因子调节IRF4，并且与IRF4协同作用促进Th9细胞的表达[17]。
肺纤维化的发病机制目前尚未完全阐明，本研究结果初步显示Th9细胞在致大鼠肺纤维化中起作用，这可能与转录因子PU.1和IRF4有关，并且IL-4可能通过激活转录因子IRF4起作用，具体机制仍需进一步研究。
