引用本文： 王均鹏, 包明威. 培哚普利对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织PI3K及肺功能的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2015, 14(3): 260-263. doi: 10.7507/1671-6205.2015064 复制
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)的发病机制虽至今尚未完全阐明，多种炎性细胞及其分泌的细胞因子和炎性介质无疑参与了慢阻肺的发生，其调控机制与PI3K-Akt-NF-κB信号传导通路密切相关[1]。磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)是一类普遍存在于体内各类细胞的脂类激酶，它能使细胞膜上磷酯酰肌醇发生磷酸化，激活核转录因子κB(NF-κB)，PI3K-NF-κB信号传导途径的激活可上调多种炎症因子，并导致气道重构。NF-κB同样可被血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)激活并调节[2]，AngⅡ是肾素-血管紧张素系统(RAS)中最主要的活性蛋白，在慢阻肺诱导的肺损伤中起重要作用[3]。血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)通过抑制Ang I转化为AngⅡ，减轻AngⅡ诱导的炎症反应以明显减轻肺损伤[4]，但是其参与AngⅡ对NF-κB的调节途径是否与PI3K-NF-κB信号传导途径有关尚未明确。本研究旨在通过观察ACEI类药物培哚普利对慢阻肺大鼠肺组织匀浆中PI3K表达量及肺功能的影响，探讨ACEI类药物培哚普利改善慢阻肺大鼠肺功能的可能作用机制。
材料与方法
一 材料
实验动物、药物、试剂及仪器：健康SD雄性大鼠60只，由三峡大学动物中心提供。脂多糖(LPS)、培哚普利(美国Sigma公司)，PI3K兔抗大鼠多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，Anti-rabbit IgG-HRP(美国Santa Cruz Biotechnology公司)，HRP-GAPDH抗体(上海康成生物)，凝胶电泳成像分析仪器-Gel Doc2000型(美国Bio-Rad公司)，小动物肺功能检测仪(北京宣武医院制)。
二 方法
1.造模与分组：选取健康雄性SD大鼠60只，体重(250±20)g。适应性饲养1周后，随机分为正常对照组、模型组及培哚普利干预组(简称干预组)，每组各20只。参照文献[5]采用2次气管内滴注脂多糖(LPS)联合烟熏法制备慢阻肺大鼠模型。具体操作如下：分别在第1 d和第7 d往对照组大鼠气管内滴注生理盐水1 mL，模型组、干预组滴入相同体积浓度为1 μg/g 的LPS溶液。在第2~13 d、15~28 d，每日上午将3组大鼠置于密闭箱内，对照组不做任何处理，30 min后用生理盐水灌胃(2.5 mL)；模型组、干预组于密闭箱内点燃红金龙牌香烟，烟熏30 min，然后模型组以生理盐水灌胃(2.5 mL)；干预组用200 mg/L的培哚普利溶液以2×10-3 mg·g-1·d-1的剂量灌胃(2.5 mL)，第28 d时检测3组大鼠的肺功能，然后禁食大鼠12 h，用4％水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后固定、解剖大鼠，腹主动脉取血5 mL 置于预冷的负压真空采血管中，静置2 h后，1 000 r/min，4 ℃离心20 min，收集上清液即血清于-80 ℃冰箱冻存备用；同时，取肺组织5 g置于中性福尔马林液中固定 12 h，石蜡包埋、 切片，用于病理检查。病理切片分别作常规HE染色。其余肺组织用冰生理盐水冲洗后置于冻存管中并立即存放于液氮中备用。
2.大鼠肺功能测定：利用小动物呼吸功能测定仪测定大鼠呼吸功能：每分钟呼气量(VE)、最大呼气流量(PEF)和0.3 s用力呼气容积(FEV0.3)。
3.大鼠肺组织中PI3K表达量检测：取大鼠肺组织10 g研磨，加入蛋白抽提试剂1 mL与蛋白酶抑制剂10 μL，12 000 r/min低温离心机中离心10 min，收集上清液，转至新的EP管中在-80 ℃超低温冰箱中保存；在96孔板中加入待检测样品及蛋白标准品，于37 ℃温箱中孵育30 min。待反应结束后，采用562 nm激发波长测定样品吸光度，CurveExpert 1.4软件统计绘制标准曲线，计算蛋白浓度；Western blot法检测大鼠肺组织PI3K的表达量：制备十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，用微量加样器将变性的蛋白加入上样孔中，电泳后湿转至硝酸纤维素膜上，封闭液室温封闭 2 h后洗膜，抗PI3K (1∶1 000)，内参抗体(HRP-GAPDH，1∶10 000) 4 ℃摇床过夜，洗膜，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体(IgG-HRP，1∶10 000)室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，洗后的膜加入化学发光试剂(ECL)，反应1 min，暗室曝光显影后冲洗胶片，在凝胶成像分析系统上行摄像分析并计算出A值(即检测蛋白灰度值与GAPDH灰度值的比值)。
三 统计学处理
采用SPSS 19.0统计软件，计量资料数据均用
结果
一 大鼠症状体征观察
建模结束后模型组大鼠神情倦怠，拱背蜷缩，皮毛发黄，毫无光泽，脱毛严重，活动能力下降，进食及饮水量较对照组明显减少，出现咳嗽、呼吸急促、哮鸣、呼吸困难等症状，体型消瘦，灵敏度降低，大便干涩，小便色暗黄；干预组大鼠上述症状及体征较模型组轻。
二 大鼠肺组织病理学改变
对照组大鼠支气管及肺泡结构完整，上皮纤毛排列整齐，管壁内有少数散在的淋巴细胞，管壁未见增厚变形；慢阻肺模型组大鼠支气管黏膜上皮纤毛倒伏，部分上皮脱落，杯状细胞增生，黏膜下层及肺泡间隔可见大量炎症细胞浸润，管壁增厚、变形，肺泡结构不完整，肺泡壁变薄、断裂肺气肿形成；干预组大鼠支气管上皮细胞部分脱落、杯状细胞增多，支气管及肺泡间隔可见炎症细胞浸润，管壁增厚变形，肺泡壁部分断裂，上述病理改变较模型组均有不同程度减轻。结果见图 1。
图1
大鼠肺组织形态(HE ×100) a.对照组；b.模型组；c.干预组
三 大鼠呼吸功能测定结果
药物干预28 d结束后，模型组、干预组大鼠的肺功能与对照组比较均有下降，模型组的VE值、PEP值、FEV0.3值较干预组下降更为显著，3组间两两比较有显著的统计学差异(P<0.01或P<0.05)。结果见表 1。
表1
各组大鼠呼吸功能的比较(n=20，四 PI3K的表达量
COPD大鼠PI3K表达量的Western blot检测结果见图 2，其图像分析结果见图 3。由图 2和图 3可知，对照组、干预组与模型组的条带依次增粗；模型组分别与对照组、干预组比较差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，干预组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
图2
PI3K表达量的Western blot结果
图3
PI3K表达量的图像分析结果
注：与模型组和对照组比较，*
讨论
慢阻肺的发病机制至今虽未完全阐明，但其两个重要的特点已被普遍所接受，即慢性气道炎症及进行性肺功能下降。本实验采用烟熏加气管内注入LPS 法建立慢阻肺大鼠模型，大鼠肺组织病理显示支气管管壁增厚，管腔严重变形，黏膜上皮脱落，纤毛倒伏，杯状细胞增生，管壁周围大量炎性细胞浸润，肺泡壁变薄，肺泡腔扩大融合。同时，通过测量大鼠呼吸功能表明模型组大鼠肺功能显著下降，本模型符合慢阻肺的病理生理改变，成功建立慢阻肺大鼠模型。
PI3K是一类普遍存在于体内各类细胞的脂类激酶，支气管平滑肌细胞、肺纤维细胞、中性粒细胞及嗜酸粒细胞、T细胞、肺泡巨噬细胞等均广泛表达IA类PI3K[6]。它能使细胞膜上磷酯酰肌醇发生磷酸化，从而活化第二信使，通过募集与激活下游的靶物质而启动一系列信号级联反应，活化NF-κB，参与细胞增生、分化、细胞骨架构型与重塑、凋亡、囊胞的运输过程[7]。通过PI3K-Akt信号通路可调节NF-κB的活化水平，激活大鼠气道平滑肌细胞NF-κB使TGF-β的表达增加、细胞增殖增加、细胞凋亡减少[1]。研究表明，在支气管哮喘的大鼠气道平滑肌细胞中PI3K的表达量增多[8]；PI3K在肺损伤的早期炎症反应、肺水肿以及后期组织修复、气道重塑以及肺气肿的发生和发展中起着关键作用[9]。PI3K的表达水平可间接反映慢阻肺病情的严重程度，并可作为监测慢阻肺病情、观察疗效、判断预后的重要指标。
而PI3K抑制剂能够有效预防LPS所导致的小鼠急性肺损伤[10]，其机制主要是保护毛细血管的内皮屏障、抑制炎症细胞的浸润和黏附、抑制上皮细胞的活化以及减少炎症因子的释放等；且不同PI3K抑制剂的保护作用也有差异，这可能和药物的化学结构、靶向部位以及药动学特点有关，提示PI3K抑制剂可能成为慢性气道疾病的一个治疗的新靶点。PI3K可能被AngⅡ激活，作为ACEI的培哚普利能够抑制AngⅠ转化为AngⅡ，减少AngⅡ的生成。本研究表明，慢阻肺大鼠PI3K的表达较对照组显著上调，而使用培哚普利干预后，慢阻肺大鼠PI3K的表达得到下调；研究还表明培哚普利干预组慢阻肺大鼠的呼吸功能、症状体征及肺组织病理改变也较模型组得到明显的改善，据此推测慢阻肺大鼠的呼吸功能的改善可能与培哚普利下调肺组织中PI3K的表达水平有关。至于培哚普利对慢阻肺大鼠血流动力学的改变及拮抗组织纤维增生[11]、细胞凋亡[12]和氧化应激反应[13]等方面尚有待进一步的实验证实。
综上所述，培哚普利能明显改善慢阻肺大鼠肺功能，其机制可能是通过下调慢阻肺大鼠肺组织中PI3K的表达水平来实现的，或可能成为慢阻肺临床治疗的新靶点。
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)的发病机制虽至今尚未完全阐明，多种炎性细胞及其分泌的细胞因子和炎性介质无疑参与了慢阻肺的发生，其调控机制与PI3K-Akt-NF-κB信号传导通路密切相关[1]。磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)是一类普遍存在于体内各类细胞的脂类激酶，它能使细胞膜上磷酯酰肌醇发生磷酸化，激活核转录因子κB(NF-κB)，PI3K-NF-κB信号传导途径的激活可上调多种炎症因子，并导致气道重构。NF-κB同样可被血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)激活并调节[2]，AngⅡ是肾素-血管紧张素系统(RAS)中最主要的活性蛋白，在慢阻肺诱导的肺损伤中起重要作用[3]。血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)通过抑制Ang I转化为AngⅡ，减轻AngⅡ诱导的炎症反应以明显减轻肺损伤[4]，但是其参与AngⅡ对NF-κB的调节途径是否与PI3K-NF-κB信号传导途径有关尚未明确。本研究旨在通过观察ACEI类药物培哚普利对慢阻肺大鼠肺组织匀浆中PI3K表达量及肺功能的影响，探讨ACEI类药物培哚普利改善慢阻肺大鼠肺功能的可能作用机制。
材料与方法
一 材料
实验动物、药物、试剂及仪器：健康SD雄性大鼠60只，由三峡大学动物中心提供。脂多糖(LPS)、培哚普利(美国Sigma公司)，PI3K兔抗大鼠多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，Anti-rabbit IgG-HRP(美国Santa Cruz Biotechnology公司)，HRP-GAPDH抗体(上海康成生物)，凝胶电泳成像分析仪器-Gel Doc2000型(美国Bio-Rad公司)，小动物肺功能检测仪(北京宣武医院制)。
二 方法
1.造模与分组：选取健康雄性SD大鼠60只，体重(250±20)g。适应性饲养1周后，随机分为正常对照组、模型组及培哚普利干预组(简称干预组)，每组各20只。参照文献[5]采用2次气管内滴注脂多糖(LPS)联合烟熏法制备慢阻肺大鼠模型。具体操作如下：分别在第1 d和第7 d往对照组大鼠气管内滴注生理盐水1 mL，模型组、干预组滴入相同体积浓度为1 μg/g 的LPS溶液。在第2~13 d、15~28 d，每日上午将3组大鼠置于密闭箱内，对照组不做任何处理，30 min后用生理盐水灌胃(2.5 mL)；模型组、干预组于密闭箱内点燃红金龙牌香烟，烟熏30 min，然后模型组以生理盐水灌胃(2.5 mL)；干预组用200 mg/L的培哚普利溶液以2×10-3 mg·g-1·d-1的剂量灌胃(2.5 mL)，第28 d时检测3组大鼠的肺功能，然后禁食大鼠12 h，用4％水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后固定、解剖大鼠，腹主动脉取血5 mL 置于预冷的负压真空采血管中，静置2 h后，1 000 r/min，4 ℃离心20 min，收集上清液即血清于-80 ℃冰箱冻存备用；同时，取肺组织5 g置于中性福尔马林液中固定 12 h，石蜡包埋、 切片，用于病理检查。病理切片分别作常规HE染色。其余肺组织用冰生理盐水冲洗后置于冻存管中并立即存放于液氮中备用。
2.大鼠肺功能测定：利用小动物呼吸功能测定仪测定大鼠呼吸功能：每分钟呼气量(VE)、最大呼气流量(PEF)和0.3 s用力呼气容积(FEV0.3)。
3.大鼠肺组织中PI3K表达量检测：取大鼠肺组织10 g研磨，加入蛋白抽提试剂1 mL与蛋白酶抑制剂10 μL，12 000 r/min低温离心机中离心10 min，收集上清液，转至新的EP管中在-80 ℃超低温冰箱中保存；在96孔板中加入待检测样品及蛋白标准品，于37 ℃温箱中孵育30 min。待反应结束后，采用562 nm激发波长测定样品吸光度，CurveExpert 1.4软件统计绘制标准曲线，计算蛋白浓度；Western blot法检测大鼠肺组织PI3K的表达量：制备十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，用微量加样器将变性的蛋白加入上样孔中，电泳后湿转至硝酸纤维素膜上，封闭液室温封闭 2 h后洗膜，抗PI3K (1∶1 000)，内参抗体(HRP-GAPDH，1∶10 000) 4 ℃摇床过夜，洗膜，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体(IgG-HRP，1∶10 000)室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，洗后的膜加入化学发光试剂(ECL)，反应1 min，暗室曝光显影后冲洗胶片，在凝胶成像分析系统上行摄像分析并计算出A值(即检测蛋白灰度值与GAPDH灰度值的比值)。
三 统计学处理
采用SPSS 19.0统计软件，计量资料数据均用
结果
一 大鼠症状体征观察
建模结束后模型组大鼠神情倦怠，拱背蜷缩，皮毛发黄，毫无光泽，脱毛严重，活动能力下降，进食及饮水量较对照组明显减少，出现咳嗽、呼吸急促、哮鸣、呼吸困难等症状，体型消瘦，灵敏度降低，大便干涩，小便色暗黄；干预组大鼠上述症状及体征较模型组轻。
二 大鼠肺组织病理学改变
对照组大鼠支气管及肺泡结构完整，上皮纤毛排列整齐，管壁内有少数散在的淋巴细胞，管壁未见增厚变形；慢阻肺模型组大鼠支气管黏膜上皮纤毛倒伏，部分上皮脱落，杯状细胞增生，黏膜下层及肺泡间隔可见大量炎症细胞浸润，管壁增厚、变形，肺泡结构不完整，肺泡壁变薄、断裂肺气肿形成；干预组大鼠支气管上皮细胞部分脱落、杯状细胞增多，支气管及肺泡间隔可见炎症细胞浸润，管壁增厚变形，肺泡壁部分断裂，上述病理改变较模型组均有不同程度减轻。结果见图 1。
图1
大鼠肺组织形态(HE ×100) a.对照组；b.模型组；c.干预组
三 大鼠呼吸功能测定结果
药物干预28 d结束后，模型组、干预组大鼠的肺功能与对照组比较均有下降，模型组的VE值、PEP值、FEV0.3值较干预组下降更为显著，3组间两两比较有显著的统计学差异(P<0.01或P<0.05)。结果见表 1。
表1
各组大鼠呼吸功能的比较(n=20，四 PI3K的表达量
COPD大鼠PI3K表达量的Western blot检测结果见图 2，其图像分析结果见图 3。由图 2和图 3可知，对照组、干预组与模型组的条带依次增粗；模型组分别与对照组、干预组比较差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，干预组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
图2
PI3K表达量的Western blot结果
图3
PI3K表达量的图像分析结果
注：与模型组和对照组比较，*
讨论
慢阻肺的发病机制至今虽未完全阐明，但其两个重要的特点已被普遍所接受，即慢性气道炎症及进行性肺功能下降。本实验采用烟熏加气管内注入LPS 法建立慢阻肺大鼠模型，大鼠肺组织病理显示支气管管壁增厚，管腔严重变形，黏膜上皮脱落，纤毛倒伏，杯状细胞增生，管壁周围大量炎性细胞浸润，肺泡壁变薄，肺泡腔扩大融合。同时，通过测量大鼠呼吸功能表明模型组大鼠肺功能显著下降，本模型符合慢阻肺的病理生理改变，成功建立慢阻肺大鼠模型。
PI3K是一类普遍存在于体内各类细胞的脂类激酶，支气管平滑肌细胞、肺纤维细胞、中性粒细胞及嗜酸粒细胞、T细胞、肺泡巨噬细胞等均广泛表达IA类PI3K[6]。它能使细胞膜上磷酯酰肌醇发生磷酸化，从而活化第二信使，通过募集与激活下游的靶物质而启动一系列信号级联反应，活化NF-κB，参与细胞增生、分化、细胞骨架构型与重塑、凋亡、囊胞的运输过程[7]。通过PI3K-Akt信号通路可调节NF-κB的活化水平，激活大鼠气道平滑肌细胞NF-κB使TGF-β的表达增加、细胞增殖增加、细胞凋亡减少[1]。研究表明，在支气管哮喘的大鼠气道平滑肌细胞中PI3K的表达量增多[8]；PI3K在肺损伤的早期炎症反应、肺水肿以及后期组织修复、气道重塑以及肺气肿的发生和发展中起着关键作用[9]。PI3K的表达水平可间接反映慢阻肺病情的严重程度，并可作为监测慢阻肺病情、观察疗效、判断预后的重要指标。
而PI3K抑制剂能够有效预防LPS所导致的小鼠急性肺损伤[10]，其机制主要是保护毛细血管的内皮屏障、抑制炎症细胞的浸润和黏附、抑制上皮细胞的活化以及减少炎症因子的释放等；且不同PI3K抑制剂的保护作用也有差异，这可能和药物的化学结构、靶向部位以及药动学特点有关，提示PI3K抑制剂可能成为慢性气道疾病的一个治疗的新靶点。PI3K可能被AngⅡ激活，作为ACEI的培哚普利能够抑制AngⅠ转化为AngⅡ，减少AngⅡ的生成。本研究表明，慢阻肺大鼠PI3K的表达较对照组显著上调，而使用培哚普利干预后，慢阻肺大鼠PI3K的表达得到下调；研究还表明培哚普利干预组慢阻肺大鼠的呼吸功能、症状体征及肺组织病理改变也较模型组得到明显的改善，据此推测慢阻肺大鼠的呼吸功能的改善可能与培哚普利下调肺组织中PI3K的表达水平有关。至于培哚普利对慢阻肺大鼠血流动力学的改变及拮抗组织纤维增生[11]、细胞凋亡[12]和氧化应激反应[13]等方面尚有待进一步的实验证实。
综上所述，培哚普利能明显改善慢阻肺大鼠肺功能，其机制可能是通过下调慢阻肺大鼠肺组织中PI3K的表达水平来实现的，或可能成为慢阻肺临床治疗的新靶点。
