引用本文： 朱晨, 赵亚滨, 孔灵菲, 李振华, 康健. 涎液化糖链蛋白6在特发性肺纤维化患者支气管肺泡灌洗液和血清中的表达及临床意义. 中国呼吸与危重监护杂志, 2015, 14(3): 225-228. doi: 10.7507/1671-6205.2015058 复制
特发性肺纤维化(IPF)是一种原因不明，主要发生于中老年人，局限于肺的慢性进行性致纤维化的间质性肺炎，是特发性间质性肺炎中最常见的类型，其确诊后的中位生存期仅3~5年。IPF通常为隐袭性起病，主要表现为渐进性的呼吸困难伴干咳，肺功能检查可见限制性通气功能障碍和弥散功能障碍，约60%的患者死于肺部疾病恶化和呼吸衰竭[1-2]。IPF的发病机制至今尚未完全清楚，成纤维细胞异常增殖分化、凋亡受阻，成纤维细胞灶形成，以及细胞外基质产生增多、降解减少均可导致IPF发生。KL-6是Ⅱ型肺泡上皮细胞膜上的一种糖蛋白，可从Ⅱ型肺泡上皮细胞上脱落进入肺泡腔和血液[3]。研究表明，涎液化糖链蛋白6(KL-6)参与了肺纤维化过程[4]。本文旨在研究KL-6在IPF患者支气管肺泡灌洗液(BALF)和血清中的表达水平，并与肺功能等指标进行相关性分析，探讨它对IPF辅助诊断的临床价值。
对象与方法
一 对象
选取2012年2月至2014年9月在中国医科大学附属第一医院初诊的IPF患者34例，结节病(SAR)Ⅰ期患者10例。IPF组诊断标准严格按照《特发性间质性肺纤维化循证诊治指南》[5]，所有患者临床上均有不同程度的进行性呼吸困难和干咳等症状，查体有Velcro啰音、杵状指等，结合病史、肺功能、血气分析、肺高分辨率CT(HRCT)等检查，排除了结节病、过敏性肺泡炎、结缔组织病等其他类型的弥漫性间质性肺疾病。SAR组主要为病理诊断，结合肺CT排除结核、淋巴瘤等其他类似肉芽肿性疾病，或经经验性激素治疗确诊为Ⅰ期SAR患者。患者均签署知情同意书。
二 方法
1.一般临床资料：对符合入选标准的患者，记录患者的性别、年龄、吸烟状况等一般情况及体征相关信息。
2.肺功能检测：使用德国耶格肺功能仪检测，记录第1秒用力呼气容积(FEV1)占预计值百分比(FEV1%pred)、用力肺活量(FVC)占预计值百分比(FVC%pred)、一氧化碳弥散量(DLCO)占预计值百分比(DLCO%pred)。
3.纤维支气管镜支气管肺泡灌洗：右肺中叶(B4或B5)或左肺舌叶注入100 mL生理盐水，回收至瓶中(标本回收率>35%)。收集支气管BALF后立即采静脉血5 mL。BALF用12目无菌纱布过滤后注入离心管中，以1 200 r/min、4 ℃下离心10 min，然后注入无菌透析袋10倍浓缩，浸入50％聚乙二醇溶液中10倍浓缩，24 h后加入生理盐水(原BALF量的1/10)，取浓缩液-80 ℃冰箱保存备用。BALF用于细胞学检查，检测方法参照《中华医学会呼吸学分会支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范(草案)》[6]。静脉血离心，取血清冰冻备用。BALF中T淋巴细胞亚群检测采用流式细胞法。
4.BALF和血清中的KL-6水平检测：采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，用标准曲线计算样本KL-6的浓度(U/mL)。
三 统计学处理
应用SPSS 17.0软件进行数据处理。计数资料的组间比较采用χ2检验，计量资料组间比较采用单因素方差分析。相关性分析采用Pearson相关性分析(正态分布)或Spearman等级相关(非正态分布)。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一 一般临床资料
IPF组患者的男/女、年龄、吸烟、杵状指高于SAR组(P均<0.01)，出现Velcro啰音者也多于SAR组(P<0.05)。结果见表 1。
表1
两组患者的一般情况及体征比较(二 肺功能
IPF组患者的FVC%pred低于SAR组(P<0.01)，DLCO%pred低于SAR组(P<0.01)。结果见表 2。
表2
两组患者的肺功能指标比较(三 BALF中细胞学检查
IPF组患者BALF中中性粒细胞百分比高于SAR组(P<0.05)，SAR组淋巴细胞百分比和CD4/CD8比值高于IPF组(P<0.05)。结果见表 3。
表3
BALF中细胞总数、分类计数、T细胞亚群比较(四 BALF和血清中KL-6浓度
IPF组患者BALF和血清中KL-6浓度均高于SAR组(P<0.05)。结果见表 4。
表4
BALF和血清中KL-6浓度比较(U/mL，五 IPF组血清KL-6浓度与肺功能相关性分析
IPF组患者血清KL-6浓度与FVC%pred和DLCO%pred均呈负相关，相关系数分别为-0.46和-0.58(P均<0.01)。结果见图 1和图 2。
图1
血清KL-6浓度与FVC%pred的相关性
图2
血清KL-6浓度与DLCO%pred的相关性
讨论
KL-6是由MUC1基因编码的属cluster9的黏蛋白1类糖蛋白，主要由增殖、再生的或受损的Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌。血清KL-6水平可以作为肺泡上皮细胞破坏和再生的指标。临床可用于某些呼吸系统疾病如肺泡蛋白沉着症的早期诊断和判断病情严重程度。KL-6还是一种细胞表面屏障，可能有防御功能，它的水平与肺泡上皮屏障损伤相关。国内外相关研究已证明KL-6在诊断间质性肺疾病中有一定的作用[3]。KL-6是一种黏蛋白而非表面活性物质，在间质性肺疾病中KL-6过度表达可能限制肺泡的通气和换气功能，影响肺泡复张，从而加重肺损伤，这种过度表达可能是导致间质性肺疾病加重的一种机制[7]。另外，KL-6是一种肺成纤维细胞潜在的促增殖和抗凋亡物质，影响作用类似于转化生长因子、成纤维细胞生长因子及血小板源性生长因子，可能为纤维化增殖的启动因素[4]。
因基底膜受损，Ⅱ型肺泡上皮细胞增生，与此同时KL-6表达增加，被释放入肺泡衬褶中，引起损伤处肺泡衬褶和血管通透性增强，KL-6移行到血液中，使血液中KL-6水平升高。KL-6可以促进肺成纤维细胞的迁移、增生和活化并释放趋化因子。尽管现在IPF发病机制尚未完全清楚，但研究表明与成纤维细胞的异常增殖活化、凋亡受阻，成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，上皮-间质转变，细胞外基质产生增多、降解减少有关。KL-6可以促进成纤维细胞产生胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ和诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，产生α-平滑肌肌动蛋白，导致上皮-间质转变，并且诱导产生更多的细胞外基质成分。另外，KL-6通过抑制成纤维细胞表达肝细胞生长因子，导致细胞外基质过度沉积、重塑，发生肺纤维化[8]。
关于KL-6，日本的相关研究较深入，用以鉴别弥漫性间质性肺疾病、健康人及其他呼吸系统疾病的患者，血清中KL-6的临床参考值设定为500 U/mL[9]。基于此参考值，一项关于日本人群大样本的研究，其中包括225例不同肺疾病的患者和200名健康人，发现KL-6对间质性肺疾病特异性较高，可有效鉴别间质性肺病与其他呼吸系统疾病；与非活动期相比，活动期的血液中KL-6浓度更高；随着间质性肺疾病的症状改善或恶化，KL-6在血液中的浓度也随之变动[10]。日本厚生省的《特发性间质性肺病的诊断和治疗指南》已将KL-6、表面活性蛋白D、表面活性蛋白A、乳酸脱氢酶中1个以上的指标上升作为诊断标准之一[11]。目前我国尚缺乏大样本的研究，今后有必要进行大样本研究以明确KL-6在中国人IPF的病情监测以及判定疾病活动性方面的作用。在BALF中，IPF以中性粒细胞为主，而结节病以淋巴细胞为主。本研究结果显示，IPF组中性粒细胞百分比为(8.91±6.79)%，SAR组淋巴细胞百分比为(23.30±12.68)%，均高于正常值。另外，IPF组BALF和血清中KL-6水平升高明显。IPF组血清KL-6浓度与肺容积和肺弥散功能的下降有显著相关性，提示其在病情监测及判定疾病活动性方面的作用。KL-6有可能作为一项提示IPF临床诊断的指标。
本研究尚有许多不足之处，由于收集标本时的临床实际情况，对照组采用尚未发生肺纤维化的SAR Ⅰ期患者，而非正常健康人。并且本研究时间较短，病例数相对偏少，尚未对患者进行随访以及动态观察治疗后KL-6水平。关于KL-6在IPF中的作用机制有待于进一步研究。
特发性肺纤维化(IPF)是一种原因不明，主要发生于中老年人，局限于肺的慢性进行性致纤维化的间质性肺炎，是特发性间质性肺炎中最常见的类型，其确诊后的中位生存期仅3~5年。IPF通常为隐袭性起病，主要表现为渐进性的呼吸困难伴干咳，肺功能检查可见限制性通气功能障碍和弥散功能障碍，约60%的患者死于肺部疾病恶化和呼吸衰竭[1-2]。IPF的发病机制至今尚未完全清楚，成纤维细胞异常增殖分化、凋亡受阻，成纤维细胞灶形成，以及细胞外基质产生增多、降解减少均可导致IPF发生。KL-6是Ⅱ型肺泡上皮细胞膜上的一种糖蛋白，可从Ⅱ型肺泡上皮细胞上脱落进入肺泡腔和血液[3]。研究表明，涎液化糖链蛋白6(KL-6)参与了肺纤维化过程[4]。本文旨在研究KL-6在IPF患者支气管肺泡灌洗液(BALF)和血清中的表达水平，并与肺功能等指标进行相关性分析，探讨它对IPF辅助诊断的临床价值。
对象与方法
一 对象
选取2012年2月至2014年9月在中国医科大学附属第一医院初诊的IPF患者34例，结节病(SAR)Ⅰ期患者10例。IPF组诊断标准严格按照《特发性间质性肺纤维化循证诊治指南》[5]，所有患者临床上均有不同程度的进行性呼吸困难和干咳等症状，查体有Velcro啰音、杵状指等，结合病史、肺功能、血气分析、肺高分辨率CT(HRCT)等检查，排除了结节病、过敏性肺泡炎、结缔组织病等其他类型的弥漫性间质性肺疾病。SAR组主要为病理诊断，结合肺CT排除结核、淋巴瘤等其他类似肉芽肿性疾病，或经经验性激素治疗确诊为Ⅰ期SAR患者。患者均签署知情同意书。
二 方法
1.一般临床资料：对符合入选标准的患者，记录患者的性别、年龄、吸烟状况等一般情况及体征相关信息。
2.肺功能检测：使用德国耶格肺功能仪检测，记录第1秒用力呼气容积(FEV1)占预计值百分比(FEV1%pred)、用力肺活量(FVC)占预计值百分比(FVC%pred)、一氧化碳弥散量(DLCO)占预计值百分比(DLCO%pred)。
3.纤维支气管镜支气管肺泡灌洗：右肺中叶(B4或B5)或左肺舌叶注入100 mL生理盐水，回收至瓶中(标本回收率>35%)。收集支气管BALF后立即采静脉血5 mL。BALF用12目无菌纱布过滤后注入离心管中，以1 200 r/min、4 ℃下离心10 min，然后注入无菌透析袋10倍浓缩，浸入50％聚乙二醇溶液中10倍浓缩，24 h后加入生理盐水(原BALF量的1/10)，取浓缩液-80 ℃冰箱保存备用。BALF用于细胞学检查，检测方法参照《中华医学会呼吸学分会支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范(草案)》[6]。静脉血离心，取血清冰冻备用。BALF中T淋巴细胞亚群检测采用流式细胞法。
4.BALF和血清中的KL-6水平检测：采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，用标准曲线计算样本KL-6的浓度(U/mL)。
三 统计学处理
应用SPSS 17.0软件进行数据处理。计数资料的组间比较采用χ2检验，计量资料组间比较采用单因素方差分析。相关性分析采用Pearson相关性分析(正态分布)或Spearman等级相关(非正态分布)。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一 一般临床资料
IPF组患者的男/女、年龄、吸烟、杵状指高于SAR组(P均<0.01)，出现Velcro啰音者也多于SAR组(P<0.05)。结果见表 1。
表1
两组患者的一般情况及体征比较(二 肺功能
IPF组患者的FVC%pred低于SAR组(P<0.01)，DLCO%pred低于SAR组(P<0.01)。结果见表 2。
表2
两组患者的肺功能指标比较(三 BALF中细胞学检查
IPF组患者BALF中中性粒细胞百分比高于SAR组(P<0.05)，SAR组淋巴细胞百分比和CD4/CD8比值高于IPF组(P<0.05)。结果见表 3。
表3
BALF中细胞总数、分类计数、T细胞亚群比较(四 BALF和血清中KL-6浓度
IPF组患者BALF和血清中KL-6浓度均高于SAR组(P<0.05)。结果见表 4。
表4
BALF和血清中KL-6浓度比较(U/mL，五 IPF组血清KL-6浓度与肺功能相关性分析
IPF组患者血清KL-6浓度与FVC%pred和DLCO%pred均呈负相关，相关系数分别为-0.46和-0.58(P均<0.01)。结果见图 1和图 2。
图1
血清KL-6浓度与FVC%pred的相关性
图2
血清KL-6浓度与DLCO%pred的相关性
讨论
KL-6是由MUC1基因编码的属cluster9的黏蛋白1类糖蛋白，主要由增殖、再生的或受损的Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌。血清KL-6水平可以作为肺泡上皮细胞破坏和再生的指标。临床可用于某些呼吸系统疾病如肺泡蛋白沉着症的早期诊断和判断病情严重程度。KL-6还是一种细胞表面屏障，可能有防御功能，它的水平与肺泡上皮屏障损伤相关。国内外相关研究已证明KL-6在诊断间质性肺疾病中有一定的作用[3]。KL-6是一种黏蛋白而非表面活性物质，在间质性肺疾病中KL-6过度表达可能限制肺泡的通气和换气功能，影响肺泡复张，从而加重肺损伤，这种过度表达可能是导致间质性肺疾病加重的一种机制[7]。另外，KL-6是一种肺成纤维细胞潜在的促增殖和抗凋亡物质，影响作用类似于转化生长因子、成纤维细胞生长因子及血小板源性生长因子，可能为纤维化增殖的启动因素[4]。
因基底膜受损，Ⅱ型肺泡上皮细胞增生，与此同时KL-6表达增加，被释放入肺泡衬褶中，引起损伤处肺泡衬褶和血管通透性增强，KL-6移行到血液中，使血液中KL-6水平升高。KL-6可以促进肺成纤维细胞的迁移、增生和活化并释放趋化因子。尽管现在IPF发病机制尚未完全清楚，但研究表明与成纤维细胞的异常增殖活化、凋亡受阻，成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，上皮-间质转变，细胞外基质产生增多、降解减少有关。KL-6可以促进成纤维细胞产生胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ和诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，产生α-平滑肌肌动蛋白，导致上皮-间质转变，并且诱导产生更多的细胞外基质成分。另外，KL-6通过抑制成纤维细胞表达肝细胞生长因子，导致细胞外基质过度沉积、重塑，发生肺纤维化[8]。
关于KL-6，日本的相关研究较深入，用以鉴别弥漫性间质性肺疾病、健康人及其他呼吸系统疾病的患者，血清中KL-6的临床参考值设定为500 U/mL[9]。基于此参考值，一项关于日本人群大样本的研究，其中包括225例不同肺疾病的患者和200名健康人，发现KL-6对间质性肺疾病特异性较高，可有效鉴别间质性肺病与其他呼吸系统疾病；与非活动期相比，活动期的血液中KL-6浓度更高；随着间质性肺疾病的症状改善或恶化，KL-6在血液中的浓度也随之变动[10]。日本厚生省的《特发性间质性肺病的诊断和治疗指南》已将KL-6、表面活性蛋白D、表面活性蛋白A、乳酸脱氢酶中1个以上的指标上升作为诊断标准之一[11]。目前我国尚缺乏大样本的研究，今后有必要进行大样本研究以明确KL-6在中国人IPF的病情监测以及判定疾病活动性方面的作用。在BALF中，IPF以中性粒细胞为主，而结节病以淋巴细胞为主。本研究结果显示，IPF组中性粒细胞百分比为(8.91±6.79)%，SAR组淋巴细胞百分比为(23.30±12.68)%，均高于正常值。另外，IPF组BALF和血清中KL-6水平升高明显。IPF组血清KL-6浓度与肺容积和肺弥散功能的下降有显著相关性，提示其在病情监测及判定疾病活动性方面的作用。KL-6有可能作为一项提示IPF临床诊断的指标。
本研究尚有许多不足之处，由于收集标本时的临床实际情况，对照组采用尚未发生肺纤维化的SAR Ⅰ期患者，而非正常健康人。并且本研究时间较短，病例数相对偏少，尚未对患者进行随访以及动态观察治疗后KL-6水平。关于KL-6在IPF中的作用机制有待于进一步研究。
