引用本文： 倪娟, 林远贵, 吴兰, 黄蔚, 江晓琴. 妊娠期糖尿病对肺发育的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2015, 14(2): 190-193. doi: 10.7507/1671-6205.2015048 复制
未控制的母体糖尿病，其高浓度的血糖可透过胎盘进入胎儿血液循环，致使胎儿代谢异常，从而引起胎儿中枢神经系统、心脏系统、肺等多种器官发育异常[1-3]，对胎儿和新生儿近期或远期结局产生影响[4]。研究表明，胎儿高血糖可修改大鼠神经巢和卵黄囊中编码促凋亡蛋白、细胞增殖的基因表达[5-7]。而细胞凋亡和增殖的调节与正常胎儿肺发育和成熟过程密切相关。高氧暴露、机械通气和急性炎症反应所引起的急性肺损伤，也观察到细胞凋亡和细胞增殖的改变，这些改变可能引起肺的形态学改变。目前，关于胎儿高血糖对肺细胞凋亡和细胞增殖的影响以及这些影响是否改变肺结构发育的研究较少，因此，我们设计了该研究探讨胎儿宫内高血糖暴露对新生鼠肺细胞凋亡、增殖和肺结构发育的影响。
材料与方法
一 材料
健康SD大鼠由四川大学实验动物中心提供，其中雄性体质量250~350 g,雌性240~280 g。链脲佐菌素(STZ)购自sigma公司,TUNEL试剂盒购自美国Promega公司，增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体购于SANTA Gruz公司。
二 方法
1．1% STZ的配制：将2.1 g柠檬酸加入双蒸水100 mL中配成A液，2.94 g柠檬酸钠加入双蒸水100 mL中配成B液。将新鲜配置的A液28 mL、B液22 mL混合，调节pH值为4.2～4.5，配制为0.1 mol/L柠檬酸缓冲液。1% STZ的配制方法：100 mg链脲佐菌素溶解在10 mL新鲜配制的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中。
2．实验分组：将妊娠大鼠随机分成高血糖组(STZ组)和正常妊娠组，每组各20只。STZ组：孕鼠妊娠第4.5天腹腔注射STZ建立胎鼠高血糖模型。正常妊娠组：在相同条件下腹腔注射相同体积柠檬酸缓冲液。两组妊娠SD大鼠在腹腔注射前、注射后48 h(即妊娠6.5 d)，妊娠11.5 d、16.5 d和20.5 d分别测尾静脉随机血糖。记录自然分娩后两组新生大鼠一般情况和存活情况。
3．胎鼠高血糖模型的建立：适应性喂养1周后，将健康SD大鼠于下午3：00～4：00点合笼(雄雌比例为1∶3)，次日上午8:00～9:00雌鼠阴道观察到阴栓或分泌物涂片查见精子者视为受孕，记为妊娠0.5 d。将孕鼠分笼饲养并标记，每只孕鼠给予充足的孕鼠饲料和饮水。孕鼠妊娠第4.5 d，STZ组腹腔注射新配制的1%STZ溶液40 mg/kg，注射前保证足够饮水且禁食至少12 h。腹腔注射1%STZ溶液48 h后首次测定尾静脉随机血糖值，STZ组血糖>16.7 mmol/L视为造模成功并纳入研究，反之剔除。此后每五天监测尾静脉随机血糖1次，STZ组随机血糖低于16.7 mmol/L者剔除研究。
4．标本的采取：于出生当天(D0)和第7天(D7)，分别在STZ组和正常妊娠组每组随机抽取40只存活的SD新生大鼠。其中20只吸入七氟醚麻醉后立即剖胸取肺组织，擦干血迹后称量湿肺重。另20只七氟醚吸入麻醉，打开胸腔，剪开右心耳，在心尖左心室插管，先用冰生理盐水10 mL灌洗，再用40 g/L多聚甲醛10 mL灌洗10～15 min，迅速取下肺组织，100 g/L福尔马林固定24~48 h，石蜡包埋。
5．肺间隔厚度和辐射状肺泡计数(radical alveolar count,RAC)：肺间隔厚度和RAC是肺泡发育期评价肺泡发育的重要指标之一。将肺组织常规固定、脱水、石蜡包埋、切片，行HE染色。RAC值指在HE切片上从终末细支气管中心至最近的纤维隔引垂线,该直线上的肺泡数，其反映终末呼吸单位所含肺泡数目。每组每个标本取1张HE切片，在100倍光镜下，每张切片计数10视野,取平均值作为每只胎鼠的RAC值。
6．肺组织凋亡的检测：按照TUNEL试剂盒说明书步骤，检测D0、D7时点肺细胞凋亡。荧光显微镜下正常肺细胞呈蓝色，凋亡细胞呈绿色。每个标本选5个视野，计数每个视野肺细胞中凋亡的细胞数，计算凋亡指数。凋亡指数(%)=凋亡肺细胞/肺细胞总数×100%。
7．肺细胞增殖的检测：PCNA是细胞DNA聚合酶的附属蛋白，仅仅在增殖细胞内合成和表达，反映细胞增殖情况。用免疫组化法检测D0、D7不同时点肺细胞PCNA染色情况，分析肺细胞增殖情况。显微镜下，细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每个标本选5个视野，计数每个视野肺细胞中增殖细胞数，计算增殖指数。PI增殖指数=增殖肺细胞/肺细胞总数×100%。
三 统计学处理
使用SPSS 15.0进行统计分析，计量资料采用
结果
一 两组孕鼠一般情况
两组孕鼠各时点体质量均比孕前增加。妊娠11.5 d、16.5 d和20.5 d STZ组母鼠体质量增加均明显低于正常对照组。结果见表 1。
表1
两组孕鼠不同时点体质量(g, 二 两组孕鼠各时点随机血糖比较
SD大鼠妊娠4.5 d腹腔注射STZ(40 mg/kg)可诱发随机血糖显著增加,且可持续整个妊娠期。结果见表 2。
表2
两组不同时点随机血糖值(mmol/L,三 两组新生鼠存活率比较
STZ组和正常妊娠组新生鼠出生当天存活率分别为79.6%(144/181)和99.0%(207/209),差异有统计学意义(P=0.00)。出生当天两组各取40只新生大鼠取标本后，STZ组和正常妊娠组各剩余大鼠104和167只。至出生第7 d剩余大鼠STZ组累计死亡12只，正常对照组无新生鼠死亡，存活率分别为88.5%(92/104)和100.0%(167/167)，差异有统计学意义(P=0.00)。
四 胎鼠高血糖暴露对出生后肺发育的影响
宫内高血糖暴露可引起新生大鼠出生时体质量降低，相对肺质量降低，肺间隔变薄(P<0.05)。但宫内高血糖对RAC无显著影响。出生第7 d，STZ组肺间隔仍显著薄于对照组(P<0.05)。结果见表 3。
表3
两组新生鼠体质量、相对肺质量、肺间隔厚度和RAC(五 新生鼠肺组织的凋亡和增殖
D0时，STZ组新生鼠肺组织凋亡指数比正常妊娠组增加(P=0.00),D7时两组新生鼠肺组织凋亡指数差异无统计学意义。结果见图 1，表 4。与正常妊娠组比，STZ组新生鼠在D0、D7 PCNA阳性细胞率显著增加(P<0.05)。结果见表 4。
表4
两组新生鼠肺细胞凋亡和增殖比较(%，
图1
各组新生大鼠肺组织各时点的细胞凋亡(TUNEL ×400) a.正常妊娠组D0；b.STZ 组D0；c.正常妊娠组D7；d.STZ 组D7
讨论
STZ是一种含亚硝基化合物的广谱抗生素，对胰岛细胞具有高选择性毒性作用，可特异性破坏大鼠胰岛β细胞。因此，我们选择STZ建立妊娠期糖尿病模型。我们研究结果显示：在妊娠4.5 d腹腔注射新配制的1% STZ溶液40 mg/kg可使妊娠大鼠孕期血糖维持16.7 mmol/L以上，该方法可成功建立妊娠糖尿病模型。预实验中，我们于妊娠第1天腹腔注射STZ建立妊娠糖尿病模型。在妊娠第12天时，妊娠大鼠剖腹探查发现胚胎数量少，阴道涂片阳性的SD大鼠没有或仅1~4个胚胎。我们推测：早期高血糖暴露可能会损伤精子或受精卵。而在妊娠4.5天腹腔注射同剂量的STZ，则上述情况明显改善。临床上，妊娠糖尿病也常常在妊娠中期诊断和发病。因此，我们选择在妊娠4.5 d腹腔注射STZ建立妊娠糖尿病模型。
本研究在腹腔注射STZ后48 h(妊娠6.5 d)、妊娠11.5 d、妊娠16.5 d和妊娠20.5 d持续监测妊娠大鼠血糖浓度，结果证明整个孕期妊娠大鼠血糖浓度均大于20 mmol/L。而血糖分子可通过胎盘到达胎儿体内，这提示腹腔注射40 mg/kg STZ可成功建立胎儿宫内高糖模型。研究结果发现，妊娠糖尿病孕鼠体质量增加比正常妊娠大鼠低，胎鼠宫内高糖暴露后新生鼠体质量降低，胎儿死亡率增加，出生当天存活率降低。胎鼠宫内高糖暴露后新生鼠体质量降低与既往李鑫等[8]和Kiss等[9]研究结果不一致，推测其可能原因：(1)本研究中孕鼠血糖较高，均超过了20 mmol/L，而李鑫等[8]研究中孕鼠血糖为10～20 mmol/L。(2)本研究是正常大鼠受孕后注射STZ建立的高血糖模型，而Kiss等[9]是先建立了大鼠糖尿病模型再受孕。
正常情况下，肺在新生大鼠出生后开始进行气体交换，完成呼吸功能。新生大鼠与人不同，出生后肺组织仍在不断的发育，原始肺泡壁第二嵴形成，肺泡壁再次分隔、变薄，囊泡期肺逐渐发育成肺泡期肺。这一肺发育成熟过程与细胞增殖和分化过程密切相关，肺细胞增殖分化异常可能导致肺成熟异常。本研究结果表明：正常组新生儿D0、D7天肺组织中可见大量PCNA阳性细胞，这说明该时期肺细胞具有较强的增殖能力。胎儿宫内高血糖暴露刺激后，新生鼠D0、D7天PCNA阳性细胞率均比正常妊娠组增加，提示胎儿宫内高糖暴露使出生后肺细胞增殖能力增强。本研究也证明了胎儿宫内高血糖暴露可使肺间隔相对变薄。我们推测变薄的肺间隔可能加速肺的成熟。既往研究发现，妊娠糖尿病可使新生儿肺发育不成熟或相对肺发育延迟[10]，结果与我们研究不一致。分析其可能原因是：本研究仅仅从形态学证明宫内高糖暴露的新生鼠肺相对成熟，这种成熟并不一定对应代谢或肺生理、生化功能的成熟。胎儿宫内高血糖暴露可引起胎儿代谢异常和肺生理生化功能方面发育不成熟。为适应这些功能不成熟，通过调节基因信号系统，机体调节促进肺间隔变薄，肺泡壁细胞凋亡及增殖增加。
综上所述，胎儿宫内高糖暴露可使新生鼠体质量减轻，死亡率增加，不成熟肺间隔相对变薄，肺细胞凋亡增加，增殖能力增强。然而，宫内高糖暴露通过何种信号通路调节肺细胞的凋亡和增殖能力尚需进一步研究。
未控制的母体糖尿病，其高浓度的血糖可透过胎盘进入胎儿血液循环，致使胎儿代谢异常，从而引起胎儿中枢神经系统、心脏系统、肺等多种器官发育异常[1-3]，对胎儿和新生儿近期或远期结局产生影响[4]。研究表明，胎儿高血糖可修改大鼠神经巢和卵黄囊中编码促凋亡蛋白、细胞增殖的基因表达[5-7]。而细胞凋亡和增殖的调节与正常胎儿肺发育和成熟过程密切相关。高氧暴露、机械通气和急性炎症反应所引起的急性肺损伤，也观察到细胞凋亡和细胞增殖的改变，这些改变可能引起肺的形态学改变。目前，关于胎儿高血糖对肺细胞凋亡和细胞增殖的影响以及这些影响是否改变肺结构发育的研究较少，因此，我们设计了该研究探讨胎儿宫内高血糖暴露对新生鼠肺细胞凋亡、增殖和肺结构发育的影响。
材料与方法
一 材料
健康SD大鼠由四川大学实验动物中心提供，其中雄性体质量250~350 g,雌性240~280 g。链脲佐菌素(STZ)购自sigma公司,TUNEL试剂盒购自美国Promega公司，增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体购于SANTA Gruz公司。
二 方法
1．1% STZ的配制：将2.1 g柠檬酸加入双蒸水100 mL中配成A液，2.94 g柠檬酸钠加入双蒸水100 mL中配成B液。将新鲜配置的A液28 mL、B液22 mL混合，调节pH值为4.2～4.5，配制为0.1 mol/L柠檬酸缓冲液。1% STZ的配制方法：100 mg链脲佐菌素溶解在10 mL新鲜配制的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中。
2．实验分组：将妊娠大鼠随机分成高血糖组(STZ组)和正常妊娠组，每组各20只。STZ组：孕鼠妊娠第4.5天腹腔注射STZ建立胎鼠高血糖模型。正常妊娠组：在相同条件下腹腔注射相同体积柠檬酸缓冲液。两组妊娠SD大鼠在腹腔注射前、注射后48 h(即妊娠6.5 d)，妊娠11.5 d、16.5 d和20.5 d分别测尾静脉随机血糖。记录自然分娩后两组新生大鼠一般情况和存活情况。
3．胎鼠高血糖模型的建立：适应性喂养1周后，将健康SD大鼠于下午3：00～4：00点合笼(雄雌比例为1∶3)，次日上午8:00～9:00雌鼠阴道观察到阴栓或分泌物涂片查见精子者视为受孕，记为妊娠0.5 d。将孕鼠分笼饲养并标记，每只孕鼠给予充足的孕鼠饲料和饮水。孕鼠妊娠第4.5 d，STZ组腹腔注射新配制的1%STZ溶液40 mg/kg，注射前保证足够饮水且禁食至少12 h。腹腔注射1%STZ溶液48 h后首次测定尾静脉随机血糖值，STZ组血糖>16.7 mmol/L视为造模成功并纳入研究，反之剔除。此后每五天监测尾静脉随机血糖1次，STZ组随机血糖低于16.7 mmol/L者剔除研究。
4．标本的采取：于出生当天(D0)和第7天(D7)，分别在STZ组和正常妊娠组每组随机抽取40只存活的SD新生大鼠。其中20只吸入七氟醚麻醉后立即剖胸取肺组织，擦干血迹后称量湿肺重。另20只七氟醚吸入麻醉，打开胸腔，剪开右心耳，在心尖左心室插管，先用冰生理盐水10 mL灌洗，再用40 g/L多聚甲醛10 mL灌洗10～15 min，迅速取下肺组织，100 g/L福尔马林固定24~48 h，石蜡包埋。
5．肺间隔厚度和辐射状肺泡计数(radical alveolar count,RAC)：肺间隔厚度和RAC是肺泡发育期评价肺泡发育的重要指标之一。将肺组织常规固定、脱水、石蜡包埋、切片，行HE染色。RAC值指在HE切片上从终末细支气管中心至最近的纤维隔引垂线,该直线上的肺泡数，其反映终末呼吸单位所含肺泡数目。每组每个标本取1张HE切片，在100倍光镜下，每张切片计数10视野,取平均值作为每只胎鼠的RAC值。
6．肺组织凋亡的检测：按照TUNEL试剂盒说明书步骤，检测D0、D7时点肺细胞凋亡。荧光显微镜下正常肺细胞呈蓝色，凋亡细胞呈绿色。每个标本选5个视野，计数每个视野肺细胞中凋亡的细胞数，计算凋亡指数。凋亡指数(%)=凋亡肺细胞/肺细胞总数×100%。
7．肺细胞增殖的检测：PCNA是细胞DNA聚合酶的附属蛋白，仅仅在增殖细胞内合成和表达，反映细胞增殖情况。用免疫组化法检测D0、D7不同时点肺细胞PCNA染色情况，分析肺细胞增殖情况。显微镜下，细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每个标本选5个视野，计数每个视野肺细胞中增殖细胞数，计算增殖指数。PI增殖指数=增殖肺细胞/肺细胞总数×100%。
三 统计学处理
使用SPSS 15.0进行统计分析，计量资料采用
结果
一 两组孕鼠一般情况
两组孕鼠各时点体质量均比孕前增加。妊娠11.5 d、16.5 d和20.5 d STZ组母鼠体质量增加均明显低于正常对照组。结果见表 1。
表1
两组孕鼠不同时点体质量(g, 二 两组孕鼠各时点随机血糖比较
SD大鼠妊娠4.5 d腹腔注射STZ(40 mg/kg)可诱发随机血糖显著增加,且可持续整个妊娠期。结果见表 2。
表2
两组不同时点随机血糖值(mmol/L,三 两组新生鼠存活率比较
STZ组和正常妊娠组新生鼠出生当天存活率分别为79.6%(144/181)和99.0%(207/209),差异有统计学意义(P=0.00)。出生当天两组各取40只新生大鼠取标本后，STZ组和正常妊娠组各剩余大鼠104和167只。至出生第7 d剩余大鼠STZ组累计死亡12只，正常对照组无新生鼠死亡，存活率分别为88.5%(92/104)和100.0%(167/167)，差异有统计学意义(P=0.00)。
四 胎鼠高血糖暴露对出生后肺发育的影响
宫内高血糖暴露可引起新生大鼠出生时体质量降低，相对肺质量降低，肺间隔变薄(P<0.05)。但宫内高血糖对RAC无显著影响。出生第7 d，STZ组肺间隔仍显著薄于对照组(P<0.05)。结果见表 3。
表3
两组新生鼠体质量、相对肺质量、肺间隔厚度和RAC(五 新生鼠肺组织的凋亡和增殖
D0时，STZ组新生鼠肺组织凋亡指数比正常妊娠组增加(P=0.00),D7时两组新生鼠肺组织凋亡指数差异无统计学意义。结果见图 1，表 4。与正常妊娠组比，STZ组新生鼠在D0、D7 PCNA阳性细胞率显著增加(P<0.05)。结果见表 4。
表4
两组新生鼠肺细胞凋亡和增殖比较(%，
图1
各组新生大鼠肺组织各时点的细胞凋亡(TUNEL ×400) a.正常妊娠组D0；b.STZ 组D0；c.正常妊娠组D7；d.STZ 组D7
讨论
STZ是一种含亚硝基化合物的广谱抗生素，对胰岛细胞具有高选择性毒性作用，可特异性破坏大鼠胰岛β细胞。因此，我们选择STZ建立妊娠期糖尿病模型。我们研究结果显示：在妊娠4.5 d腹腔注射新配制的1% STZ溶液40 mg/kg可使妊娠大鼠孕期血糖维持16.7 mmol/L以上，该方法可成功建立妊娠糖尿病模型。预实验中，我们于妊娠第1天腹腔注射STZ建立妊娠糖尿病模型。在妊娠第12天时，妊娠大鼠剖腹探查发现胚胎数量少，阴道涂片阳性的SD大鼠没有或仅1~4个胚胎。我们推测：早期高血糖暴露可能会损伤精子或受精卵。而在妊娠4.5天腹腔注射同剂量的STZ，则上述情况明显改善。临床上，妊娠糖尿病也常常在妊娠中期诊断和发病。因此，我们选择在妊娠4.5 d腹腔注射STZ建立妊娠糖尿病模型。
本研究在腹腔注射STZ后48 h(妊娠6.5 d)、妊娠11.5 d、妊娠16.5 d和妊娠20.5 d持续监测妊娠大鼠血糖浓度，结果证明整个孕期妊娠大鼠血糖浓度均大于20 mmol/L。而血糖分子可通过胎盘到达胎儿体内，这提示腹腔注射40 mg/kg STZ可成功建立胎儿宫内高糖模型。研究结果发现，妊娠糖尿病孕鼠体质量增加比正常妊娠大鼠低，胎鼠宫内高糖暴露后新生鼠体质量降低，胎儿死亡率增加，出生当天存活率降低。胎鼠宫内高糖暴露后新生鼠体质量降低与既往李鑫等[8]和Kiss等[9]研究结果不一致，推测其可能原因：(1)本研究中孕鼠血糖较高，均超过了20 mmol/L，而李鑫等[8]研究中孕鼠血糖为10～20 mmol/L。(2)本研究是正常大鼠受孕后注射STZ建立的高血糖模型，而Kiss等[9]是先建立了大鼠糖尿病模型再受孕。
正常情况下，肺在新生大鼠出生后开始进行气体交换，完成呼吸功能。新生大鼠与人不同，出生后肺组织仍在不断的发育，原始肺泡壁第二嵴形成，肺泡壁再次分隔、变薄，囊泡期肺逐渐发育成肺泡期肺。这一肺发育成熟过程与细胞增殖和分化过程密切相关，肺细胞增殖分化异常可能导致肺成熟异常。本研究结果表明：正常组新生儿D0、D7天肺组织中可见大量PCNA阳性细胞，这说明该时期肺细胞具有较强的增殖能力。胎儿宫内高血糖暴露刺激后，新生鼠D0、D7天PCNA阳性细胞率均比正常妊娠组增加，提示胎儿宫内高糖暴露使出生后肺细胞增殖能力增强。本研究也证明了胎儿宫内高血糖暴露可使肺间隔相对变薄。我们推测变薄的肺间隔可能加速肺的成熟。既往研究发现，妊娠糖尿病可使新生儿肺发育不成熟或相对肺发育延迟[10]，结果与我们研究不一致。分析其可能原因是：本研究仅仅从形态学证明宫内高糖暴露的新生鼠肺相对成熟，这种成熟并不一定对应代谢或肺生理、生化功能的成熟。胎儿宫内高血糖暴露可引起胎儿代谢异常和肺生理生化功能方面发育不成熟。为适应这些功能不成熟，通过调节基因信号系统，机体调节促进肺间隔变薄，肺泡壁细胞凋亡及增殖增加。
综上所述，胎儿宫内高糖暴露可使新生鼠体质量减轻，死亡率增加，不成熟肺间隔相对变薄，肺细胞凋亡增加，增殖能力增强。然而，宫内高糖暴露通过何种信号通路调节肺细胞的凋亡和增殖能力尚需进一步研究。
