引用本文： 杜娟, 高伟良, 冯清州, 刘晅. p38 MAPK信号通路在LPS诱导RAW264.7细胞表达sTREM-1中的作用. 中国呼吸与危重监护杂志, 2015, 14(2): 161-164. doi: 10.7507/1671-6205.2015041 复制
有研究表明，可溶性髓样细胞触发受体1(soluble triggering receptor expressed on myeloid cell-1，sTREM-1)可与下游细胞因子形成一个正反馈的自分泌调节回路，促使炎症反应增强、放大，影响脓毒症的发生发展[1-2]。sTREM-1是脓毒症发病中早期关键炎症介质，但其被诱导表达的信号转导机制尚不十分清楚。p38 MAPK是控制炎症反应的丝裂原活化蛋白激酶(mitiogen activated protein kinase，MAPK)家族的主要成员之一。ARDS、严重烧伤、急性胰腺炎等急危重症发病过程中，p38 MAPK均可被激活；阻断p38 MAPK级联反应有助于减轻炎症反应[3]。在脓毒症发病过程中，p38 MAPK信号转导通路可能影响sTREM-1的表达，本研究对此作出探讨，报告如下。
材料与方法
一 材料
小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞(美国ATCC细胞库)；脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)(Sigma公司，批号L20122880)；胰蛋白酶(Sigma公司，批号H20120116)；DMEM培养基(Gibcol BRL公司，批号FMX2012006)；p38 MAPK 特异性抑制剂SB203580(Promega公司，批号S20123400)；p38 MAPK的基因引物(上海生工生物科技有限公司合成，批号FMX2012006)；RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司，批号T20120501)；兔抗鼠p38 MAPK单克隆抗体、兔抗鼠磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)多克隆抗体、羊抗兔IgG单克隆抗体(SantaCruz公司，批号分别为SC201267166、SC2012591213、SC2012282178)；羊抗鼠IgG-HRP(华美生物工程有限公司，批号HA20121006)；小鼠sTREM-1 ELISA试剂盒(深圳晶美公司，批号JS201216521)。
二 方法
1．实验分组：在37 ℃、5%CO2恒温培养箱中，常规培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7，培养基选用DMEM培养液，每48 h更换1次。细胞铺满瓶底时传代，调整细胞密度为106/mL，接种6孔板，无血清培养基培养，72 h后随机分组培养：①LPS组(5 mL)： 加入终浓度为100 mg/mL的LPS培养，在加入LPS后1、6、12、24、48 h等不同时间点收集细胞；②SB+LPS组(5 mL)：加入不同终浓度为5.0、10.0、20.0 μmol/L的SB203580液预处理细胞1 h后，加入100 mg/mL LPS刺激1 h后收集细胞。
2．p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达检测：采用Western blott法，收集细胞经PBS洗涤2次，加入裂解液充分裂解，裂解产物12 000 r/min离心20 min，收集上清。使用BCA法测定总蛋白量。每份样品取50 μg蛋白，加入 SDS-Loading Buffer混匀，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直凝胶电泳后，300 mA电转移至聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂奶粉室温封2 h，TBS洗膜后分别加抗p38 MAPK(1∶200)和p-p38 MAPK(1∶2 000)抗体(各50体)4 ℃孵育过夜，1∶2 500 辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG单克隆抗体作为二抗孵育PVDF膜，室温孵育2 h，ECL试剂曝光。用抗体剥脱液剥脱抗体后，按同样的方法与抗β-actin抗体(1∶300)孵育。Quantity One软件分析蛋白条带。目的蛋白定量采用灰度比值(p38 MAPK/β-actin或p-p38 MAPK/β-actin)计算。p38 MAPK或p-p38 MAPK相对表达量=p38 MAPK 或p-p38 MAPK Ct值倒数/GADPH Ct值倒数。
3．p38 MAPK mRNA检测：采用RT-PCR法检测p38 MAPK mRNA的表达，p38 MAPK的基因引物序列由Primer5.0软件自行设计，上游序列：5′-TCC AAGGGCTACACCAAATC-3′，下游序列：5′-TGTTCC AGGTAAGGGTGAGC-3′；扩增产物长度341 bp；内参GAPDH的上游引物序列为：5′-ACCACCATGGAGAA GGCTGG-3′，下游引物序列为：5′-GGTTTCTTACTC CTTGGAGG-3′，扩增产物长度为698 bp。收集细胞后用Trizol试剂提取细胞总RNA；按逆转录试剂盒(TaKaRa) 说明书逆转录合成cDNA，再利用引物对目的基因进行扩增，扩增后产物于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在凝胶成像系统中进行分析，对各条带的积分光密度进行测定，然后同内参GAPDH的光密度积分值进行对比，得出p38 MAPK mRNA表达的相对水平。
4．sTREM-1表达的影响：用ELISA法检测细胞培养上清液中sTREM-1含量，操作遵照说明书进行。
三 统计学处理
采用SPSS 13.0统计学软件分析处理，计量资料数据采用
结果
一 LPS对p38 MAPK蛋白表达的影响
100 mg/mL LPS作用1、6、12、24 h，p-p38 MAPK蛋白表达不断增高；而从24~48 h，p-p38 MAPK蛋白表达降低。但LPS作用对p38 MAPK总蛋白表达水平无影响。结果见图 1。
图1
LPS对p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表达的影响
二 LPS对p38 MAPK mRNA表达的影响
100 mg/mL LPS作用1、6、12、24 h，p38 MAPK mRNA表达不断增高；而从24~48 h，p38 MAPK mRNA表达降低。结果见图 2。
图2
LPS对p38 MAPK mRNA表达的影响
三 SB203580对p-p38 MAPK表达的影响
SB203580可抑制p-p38 MAPK表达，而随着SB203580浓度的增高，抑制作用更加明显，呈明显的浓度依赖性。结果见图 3。
图3
SB203580对p-38MAPK表达的影响
四 LPS对sTREM-1表达水平的影响
随着LPS作用时间延长，sTREM-1表达水平呈时间依赖性上升。结果见图 4。
图4
LPS对sTREM-1表达水平的影响 图 5 SB203580对sTREM-1表达的影响
五 SB203580对sTREM-1表达的影响
SB203580可抑制sTREM-1表达，而随着SB203580浓度的增高，抑制作用更加明显，呈明显的浓度依赖性。结果见图 5。
讨论
脓毒症的发病机制非常复杂。研究表明，感染致使机体炎症细胞活化并产生多种促炎因子，这些因子又可引起更多炎症细胞的激活，两者互为因果，形成炎症级联反应，并且这种级联反应逐级放大，最终导致脓毒症的发生和发展[4]。因此，适时合理地干预炎症反应的始动环节，是治疗脓毒症的重要目标。
sTREM-1可选择性地表达在中性粒细胞和成熟单核、巨噬细胞上，能诱导这些细胞分泌TNF-β、IL-1β、干扰素γ等促炎细胞因子[3]；sTREM-1还可进一步作用于炎症反应，促进炎症因子的释放及正反馈促进 TREM-1 表达的上调，从而引起炎性反应的增强、放大,导致过度的炎性反应[6-7]，因此，sTREM-1作为一种重要的促炎症细胞因子，是导致脓毒症发生发展的关键启动因子，但是关于脓毒症时调控TREM-1表达的机制尚未完全阐明。
MAPK通路是细胞应激和损伤反应的主要信号通路，它通过影响基因的转录和调控，调节细胞的生物学行为，其中 p38 MAPK是MAPK家族成员之一，为一高度保守的苏氨酸酪氨酸蛋白激酶，它参与介导由细胞因子、细菌病原体及产物、应激等多种刺激引起的细胞反应，在炎症反应中起着重要的作用[8-9]。
细胞在外界各种因素的刺激下，通过一系列细胞内信号传导途径使p38 MAPK的Thrl80和Tyrl82同时被磷酸化而激活，活化后的p38 MAPK(p-p38)进入细胞核内通过磷酸化作用激活包括ATF2在内的多种转录因子，从而导致相应炎性细胞因子基因表达的增加，最终导致各种炎性细胞因子的大量产生，引起炎症产生。研究发现，在许多炎症反应中，如LPS处理的巨噬细胞、TNF-噬刺激的内皮细胞、IL-18刺激的U1单核细胞株可观察到p38 MAPK磷酸化及活化[10-12]。又有实验观察显示，TNF-α、IL-1、IL-6的产生亦受p38 MAPK信号通路的调控，应用p38 MAPK抑制剂sB203580后可明显减少炎性细胞因子的产生，减轻炎症程度[13-15]。此外,p38 MAPK通路还参与了细胞内酶的诱导(如一氧化氮合酶和环氧酶2)，粘附因子的生成(如细胞间粘附分子1)以及促进转录因子磷酸化(如活性蛋白1、ATF-2、NF-κB)等过程[16]。因此，P38MAPK在细胞因子的产生过程中起着“分子开关”的作用，阻断这条信号传导通路可从上游减少多种炎性细胞因子的产生，从而减轻炎症达到治疗目的。
Prufer等[17]发现PI3K和p38 MAPK信号通路通过调控Ca2+从而参与TREM-1信号传导，p38 MAPK通路的活化可增强sTREM-1的表达，而抑制p38 MAPK活化可抑制sTREM-1表达。而本研究亦发现，LPS诱导RAW264.7细胞后p-p38 MAPK及p38 MAPK mRNA表达增高，且呈时间依赖性，同时观察到sTREM-1表达增高，表明p38 MAPK信号通路可能介导sTREM-1的表达。为明确p38 MAPK信号通路在脓毒症中对sTREM-1的介导作用，本实验用 p38 MAPK特异性抑制剂SB203580抑制p38 MAPK 的活化，结果显示在抑制p38 MAPK mRNA及p-p38 MAPK表达的同时,对sTREM-1的表达具有拮抗作用，并且具有剂量依赖性。可见，p38 MAPK信号通路在LPS诱导RAW264.7细胞表达sTREM-1中可能起到关键作用，p38 MAPK抑制剂可能有助于减轻脓毒症炎症反应，这为治疗脓毒症提供了一个新的思路。
有研究表明，可溶性髓样细胞触发受体1(soluble triggering receptor expressed on myeloid cell-1，sTREM-1)可与下游细胞因子形成一个正反馈的自分泌调节回路，促使炎症反应增强、放大，影响脓毒症的发生发展[1-2]。sTREM-1是脓毒症发病中早期关键炎症介质，但其被诱导表达的信号转导机制尚不十分清楚。p38 MAPK是控制炎症反应的丝裂原活化蛋白激酶(mitiogen activated protein kinase，MAPK)家族的主要成员之一。ARDS、严重烧伤、急性胰腺炎等急危重症发病过程中，p38 MAPK均可被激活；阻断p38 MAPK级联反应有助于减轻炎症反应[3]。在脓毒症发病过程中，p38 MAPK信号转导通路可能影响sTREM-1的表达，本研究对此作出探讨，报告如下。
材料与方法
一 材料
小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞(美国ATCC细胞库)；脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)(Sigma公司，批号L20122880)；胰蛋白酶(Sigma公司，批号H20120116)；DMEM培养基(Gibcol BRL公司，批号FMX2012006)；p38 MAPK 特异性抑制剂SB203580(Promega公司，批号S20123400)；p38 MAPK的基因引物(上海生工生物科技有限公司合成，批号FMX2012006)；RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司，批号T20120501)；兔抗鼠p38 MAPK单克隆抗体、兔抗鼠磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)多克隆抗体、羊抗兔IgG单克隆抗体(SantaCruz公司，批号分别为SC201267166、SC2012591213、SC2012282178)；羊抗鼠IgG-HRP(华美生物工程有限公司，批号HA20121006)；小鼠sTREM-1 ELISA试剂盒(深圳晶美公司，批号JS201216521)。
二 方法
1．实验分组：在37 ℃、5%CO2恒温培养箱中，常规培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7，培养基选用DMEM培养液，每48 h更换1次。细胞铺满瓶底时传代，调整细胞密度为106/mL，接种6孔板，无血清培养基培养，72 h后随机分组培养：①LPS组(5 mL)： 加入终浓度为100 mg/mL的LPS培养，在加入LPS后1、6、12、24、48 h等不同时间点收集细胞；②SB+LPS组(5 mL)：加入不同终浓度为5.0、10.0、20.0 μmol/L的SB203580液预处理细胞1 h后，加入100 mg/mL LPS刺激1 h后收集细胞。
2．p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达检测：采用Western blott法，收集细胞经PBS洗涤2次，加入裂解液充分裂解，裂解产物12 000 r/min离心20 min，收集上清。使用BCA法测定总蛋白量。每份样品取50 μg蛋白，加入 SDS-Loading Buffer混匀，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直凝胶电泳后，300 mA电转移至聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂奶粉室温封2 h，TBS洗膜后分别加抗p38 MAPK(1∶200)和p-p38 MAPK(1∶2 000)抗体(各50体)4 ℃孵育过夜，1∶2 500 辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG单克隆抗体作为二抗孵育PVDF膜，室温孵育2 h，ECL试剂曝光。用抗体剥脱液剥脱抗体后，按同样的方法与抗β-actin抗体(1∶300)孵育。Quantity One软件分析蛋白条带。目的蛋白定量采用灰度比值(p38 MAPK/β-actin或p-p38 MAPK/β-actin)计算。p38 MAPK或p-p38 MAPK相对表达量=p38 MAPK 或p-p38 MAPK Ct值倒数/GADPH Ct值倒数。
3．p38 MAPK mRNA检测：采用RT-PCR法检测p38 MAPK mRNA的表达，p38 MAPK的基因引物序列由Primer5.0软件自行设计，上游序列：5′-TCC AAGGGCTACACCAAATC-3′，下游序列：5′-TGTTCC AGGTAAGGGTGAGC-3′；扩增产物长度341 bp；内参GAPDH的上游引物序列为：5′-ACCACCATGGAGAA GGCTGG-3′，下游引物序列为：5′-GGTTTCTTACTC CTTGGAGG-3′，扩增产物长度为698 bp。收集细胞后用Trizol试剂提取细胞总RNA；按逆转录试剂盒(TaKaRa) 说明书逆转录合成cDNA，再利用引物对目的基因进行扩增，扩增后产物于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在凝胶成像系统中进行分析，对各条带的积分光密度进行测定，然后同内参GAPDH的光密度积分值进行对比，得出p38 MAPK mRNA表达的相对水平。
4．sTREM-1表达的影响：用ELISA法检测细胞培养上清液中sTREM-1含量，操作遵照说明书进行。
三 统计学处理
采用SPSS 13.0统计学软件分析处理，计量资料数据采用
结果
一 LPS对p38 MAPK蛋白表达的影响
100 mg/mL LPS作用1、6、12、24 h，p-p38 MAPK蛋白表达不断增高；而从24~48 h，p-p38 MAPK蛋白表达降低。但LPS作用对p38 MAPK总蛋白表达水平无影响。结果见图 1。
图1
LPS对p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表达的影响
二 LPS对p38 MAPK mRNA表达的影响
100 mg/mL LPS作用1、6、12、24 h，p38 MAPK mRNA表达不断增高；而从24~48 h，p38 MAPK mRNA表达降低。结果见图 2。
图2
LPS对p38 MAPK mRNA表达的影响
三 SB203580对p-p38 MAPK表达的影响
SB203580可抑制p-p38 MAPK表达，而随着SB203580浓度的增高，抑制作用更加明显，呈明显的浓度依赖性。结果见图 3。
图3
SB203580对p-38MAPK表达的影响
四 LPS对sTREM-1表达水平的影响
随着LPS作用时间延长，sTREM-1表达水平呈时间依赖性上升。结果见图 4。
图4
LPS对sTREM-1表达水平的影响 图 5 SB203580对sTREM-1表达的影响
五 SB203580对sTREM-1表达的影响
SB203580可抑制sTREM-1表达，而随着SB203580浓度的增高，抑制作用更加明显，呈明显的浓度依赖性。结果见图 5。
讨论
脓毒症的发病机制非常复杂。研究表明，感染致使机体炎症细胞活化并产生多种促炎因子，这些因子又可引起更多炎症细胞的激活，两者互为因果，形成炎症级联反应，并且这种级联反应逐级放大，最终导致脓毒症的发生和发展[4]。因此，适时合理地干预炎症反应的始动环节，是治疗脓毒症的重要目标。
sTREM-1可选择性地表达在中性粒细胞和成熟单核、巨噬细胞上，能诱导这些细胞分泌TNF-β、IL-1β、干扰素γ等促炎细胞因子[3]；sTREM-1还可进一步作用于炎症反应，促进炎症因子的释放及正反馈促进 TREM-1 表达的上调，从而引起炎性反应的增强、放大,导致过度的炎性反应[6-7]，因此，sTREM-1作为一种重要的促炎症细胞因子，是导致脓毒症发生发展的关键启动因子，但是关于脓毒症时调控TREM-1表达的机制尚未完全阐明。
MAPK通路是细胞应激和损伤反应的主要信号通路，它通过影响基因的转录和调控，调节细胞的生物学行为，其中 p38 MAPK是MAPK家族成员之一，为一高度保守的苏氨酸酪氨酸蛋白激酶，它参与介导由细胞因子、细菌病原体及产物、应激等多种刺激引起的细胞反应，在炎症反应中起着重要的作用[8-9]。
细胞在外界各种因素的刺激下，通过一系列细胞内信号传导途径使p38 MAPK的Thrl80和Tyrl82同时被磷酸化而激活，活化后的p38 MAPK(p-p38)进入细胞核内通过磷酸化作用激活包括ATF2在内的多种转录因子，从而导致相应炎性细胞因子基因表达的增加，最终导致各种炎性细胞因子的大量产生，引起炎症产生。研究发现，在许多炎症反应中，如LPS处理的巨噬细胞、TNF-噬刺激的内皮细胞、IL-18刺激的U1单核细胞株可观察到p38 MAPK磷酸化及活化[10-12]。又有实验观察显示，TNF-α、IL-1、IL-6的产生亦受p38 MAPK信号通路的调控，应用p38 MAPK抑制剂sB203580后可明显减少炎性细胞因子的产生，减轻炎症程度[13-15]。此外,p38 MAPK通路还参与了细胞内酶的诱导(如一氧化氮合酶和环氧酶2)，粘附因子的生成(如细胞间粘附分子1)以及促进转录因子磷酸化(如活性蛋白1、ATF-2、NF-κB)等过程[16]。因此，P38MAPK在细胞因子的产生过程中起着“分子开关”的作用，阻断这条信号传导通路可从上游减少多种炎性细胞因子的产生，从而减轻炎症达到治疗目的。
Prufer等[17]发现PI3K和p38 MAPK信号通路通过调控Ca2+从而参与TREM-1信号传导，p38 MAPK通路的活化可增强sTREM-1的表达，而抑制p38 MAPK活化可抑制sTREM-1表达。而本研究亦发现，LPS诱导RAW264.7细胞后p-p38 MAPK及p38 MAPK mRNA表达增高，且呈时间依赖性，同时观察到sTREM-1表达增高，表明p38 MAPK信号通路可能介导sTREM-1的表达。为明确p38 MAPK信号通路在脓毒症中对sTREM-1的介导作用，本实验用 p38 MAPK特异性抑制剂SB203580抑制p38 MAPK 的活化，结果显示在抑制p38 MAPK mRNA及p-p38 MAPK表达的同时,对sTREM-1的表达具有拮抗作用，并且具有剂量依赖性。可见，p38 MAPK信号通路在LPS诱导RAW264.7细胞表达sTREM-1中可能起到关键作用，p38 MAPK抑制剂可能有助于减轻脓毒症炎症反应，这为治疗脓毒症提供了一个新的思路。
