引用本文： 王正彪, 武怡. 哮喘及呼吸道合胞病毒感染小鼠的神经生长因子、白血病抑制因子的表达及地塞米松的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2015, 14(2): 147-151. doi: 10.7507/1671-6205.2015038 复制
支气管哮喘(简称哮喘)是最常见的慢性呼吸道疾病，其发病机制较为复杂。接触过敏原，理化刺激，剧烈运动,呼吸道感染等多种因素可以诱发并加重哮喘，其中病毒性呼吸道感染是哮喘急性发作的常见诱因。有报道称，约30％～80％的哮喘急性发作病例中，病毒感染发挥了作用。在常见的病毒感染中呼吸道合胞病毒(RSV)感染占主导地位，RSV是婴幼儿呼吸道感染最为常见的病原之一,研究证实RSV感染可引起毛细支气管炎，向哮喘转化[1-2]，是导致儿童哮喘发生的高危因素。目前有关RSV感染引起哮喘的发病机制尚不明确，有研究证实，豚鼠感染RSV后，其气道高反应性明显增加[3-4]。有研究表明，气道的感觉神经及其营养因子可能与气道炎症的形成密切关联，神经生长因子(nerve grow factor，NGF)及白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等神经营养因子在气道炎症模型肺组织内表达明显升高，且能使神经激肽受体-1(neurokin receptor-1，NK-1R)等速激肽类物质表达增高，从而引发气道炎症性反应[5-6]，提示NGF、LIF是参与及调控气道神经源性炎症的重要炎症因子。本研究主要探讨Balb/c小鼠感染RSV后肺组织的NGF、LIF表达变化及与哮喘的关系，同时研究地塞米松对其表达是否存在影响，从而为哮喘的临床预防与治疗提供新思路。
材料与方法
一 材料
1．动物及主要试剂：清洁级健康雌性Balb/c纯系小鼠，6~8周龄，体质量(22±2) g，由徐州医学院实验动物中心提供；293-T人胚肾细胞株及RSV A2 标准株均由山东医学科学院微生物教研室孟红老师惠赠；HyClone改良型RPMI-1640培养基及HyClone胎牛血清均购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；鸡卵白蛋白(OVA)由美国Sigma公司提供；佐剂氢氧化铝 Al(OH)3干粉由上海生物工程有限公司提供；TRNzol总RNA提取试剂、TIANSscript cDNA第一链合成试剂盒及2×TaqRCR Master Mix均购自天根生物科技(北京)有限公司；NGF mRNA引物、LIF mRNA引物及GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司设计及合成；免抗NGF beta(免疫组化)由武汉博士德生物工程有限公司提供；免抗LIF(免疫组化)由北京博奥森生物技术有限公司提供;浓缩型二氨基联苯胺(DAB)试剂盒及兔超敏二步法检测试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
2．细胞和病毒：293-T人胚肾细胞株在含20 mL/L灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中37 ℃，50 mL/L CO2条件下培养，待生长成单层贴壁细胞后，将RSV病毒接种293-T细胞,继续在含20 mL/L灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基的维持液中培养，待细胞病变达100%时收集病毒，反复冻融、离心，收集RSV上清。
二 方法
1．实验分组及动物模型：参照国内外模型制作方法[7-8]。健康雌性Balb/c小鼠100只，采用随机数字表法分为5组,分别为正常对照组，RSV组，哮喘组，哮喘合并RSV组，地塞米松组，每组20只。正常对照组：于第1、14 d予以生理盐水0.2 mL腹腔注射，第21~25 d用37 ℃生理盐水20 mL雾化吸入30 min。哮喘组：于第1、14 d予以OVA/AL(OH)3 [含OVA100 μg，AL(OH)3 2 mg]腹腔注射，第21 d开始激发，以2%OVA生理盐水20 mL雾化30 min，持续激发5 d。RSV组：于第19、20、21天，取TCID50 10-6.5/mL的RSV病毒悬液100 μL，缓慢滴入鼻腔[9-10]。哮喘合并RSV组：模型制备同哮喘组，第19、20、21 d，以TCID5010-6.5/ mL的RSV病毒悬液100 μL鼻腔滴入。地塞米松组：RSV感染同RSV组，于21~25 d予腹腔注入地塞米松0.2 mg·kg-1·d-1。
2．标本收集：末次激发后24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg)。麻醉后，无菌条件下，眼科镊分离出两侧肺组织，取左肺下叶，-80 ℃冰箱冻存，用于肺组织病毒鉴定。将右肺下叶迅速冻存，留待匀浆后进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。4%甲醛固定液固定右肺中叶和左肺上叶肺组织分别置于标记好的4%甲醛中过夜固定，留待做石蜡切片、HE染色、免疫组化，观察肺组织病理改变及NGF及LIF的变化。
3．肺组织病理学检查：小鼠处死后，4%多聚甲醛固定24 h,脱水、透明、浸蜡及包埋，切片行HE染色，在400倍光镜下观察肺组织病变和炎性细胞浸润等病理改变。
4．肺组织RSV mRNA、NGF mRNA及LIF mRNA 表达检测：采用RT-PCR。各实验组同时进行RT-PCR。TRNzol液提取细胞总RNA,具体操作按说明书进行，紫外分光光度计(A260/A280)检测RNA纯度及完整性，按说明书步骤逆转录mRNA为cDNA。RSV引物：上游序列(5′→3′)TGGAGCCTCAGA TCATCCCA，下游序列(5′→3′)TGATTTTGCCTGG CGTGTTG，片段长度为153 bp；NGF引物：上游序列(5′→3′)GTCAGTGTGTGGGTTGGAGA，下游序列(5′→3′)TTCTTGTAGCCTTCCTGCTG，片段长度304 bp；LIF引物：上游序列(5′→3′)TGCTTGCTGGGT GTATGAAC，下游序列(5′→3′)TTCTGTGGGAGCCT GAACA，片段长度356 bp；GAPDH引物：上游序列(5′→3′)CCTTCATTGACCTCAACTACA，下游序列(5′→3′)CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC，片段长度215 bp。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性 45 s，58 ℃(RSV)/58.8 ℃(NGF)/57 ℃(LIF)/60 ℃(GAPDH)，退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。扩增产物于琼脂糖凝胶上电泳。凝胶成像分析系统测定目的基因产物与内参照基因产物的比值，半定量方法分析目的基因的表达。
5．免疫组化化学方法检测各组肺组织NGF及LIF的表达：石蜡切片恒温箱烤片后，经二甲苯脱蜡、梯度酒精复水，滴加3%H2O2室温孵育15 min灭活内源性过氧化物酶，PBS缓冲液浸泡冲洗3次，浸入0.01 mol/L柠檬酸枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，微波炉热修复抗原，冷却至室温后，PBS缓冲液浸泡清洗2次，继之兔超敏二步法(Polink-2 plus)进行免疫组织化学反应：(1)滴加兔抗小鼠NGF、LIF抗体稀释液(工作浓度1∶100)，4 ℃过夜，(2)滴加试剂Polymer Helper,37 ℃孵育15 min，(3)滴加试剂poly-HRP anti-Rabbit IgG，37 ℃孵育15 min。以上每一步骤之后均用PBS浸泡冲洗3次，每次5 min。最后用DAB法显色，显微镜下控制反应，适时终止。苏木素轻度复染，1%盐酸分化数秒，饱和碳酸锂返蓝1 min,常规脱水、透明及中性树胶(DPX)封固，光镜观察。阴性对照用PBS代替上述一抗进行反应。以细胞浆棕黄色为阳性，采用图像分析软件对NGF及LIF阳性部位进行测定。
三 统计学处理
采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量资料以
结果
一 一般情况
经致敏和激发后，哮喘组和哮喘合并RSV组小鼠出现烦躁不安，缩头弓背，抓挠头面部，前肢缩抬，呼吸急促，偶尔咳嗽等表现；RSV组小鼠滴鼻后第3 d 出现烦躁不安，第6 d表现明显，出现呼吸急促，易激惹，食欲不佳；地塞米松组小鼠症状表现较轻，24 h内精神、食欲均可获得不同程度上的恢复；正常对照组小鼠可见烦躁不安，但无上述其他表现。
二 肺组织病理学改变
正常对照组小鼠肺组织结构清晰，基本无炎症细胞浸润(图 1a)。RSV组支气管管腔狭窄甚至闭塞，肺泡上皮肿胀，肺泡间隔增宽，间质性水肿(图 1b)。哮喘组支气管、毛细支气管及伴行血管壁周围有大量嗜酸性细胞及单核细胞等炎症细胞浸润，支气管粘膜增厚，血管扩张，血管平滑肌增生肥厚(图 1c)。哮喘及RSV组兼具两组的共同表现(图 1d)。地塞米松组无明显炎症细胞浸润及间质性改变(图 1e)。
图1
肺组织病理检查像(HE染色 ×400) a.正常对照组；b.RSV组；c.哮喘组；d.RSV合并哮喘组；e.地塞米松组
三 各组肺组织NGF mRNA及LIF mRNA的表达
在各组肺组织NGF mRNA及LIF mRNA的表达中RSV组与正常对照组相比较升高(P<0.01)；RSV组与哮喘组相比较降低(P<0.01)；而哮喘合并RSV组与哮喘组相比显著升高(P<0.01)；地塞米松组相比RSV组显著降低(P<0.01)。结果见表 1、图 2。
表1
各组肺组织NGFmRNA及LIFmRNA的表达(
图2
RT-PCR检测肺组织中NGF mRNA及LIF mRNA表达 M.Marker；1.正常对照组；2.RSV组；3.哮喘组；4.RSV合并哮喘组；5.地塞米松组
四 各组肺组织NGF蛋白及LIF蛋白的表达
正常对照组可见NGF蛋白及LIF蛋白少量表达，RSV组比正常对照组升高(P<0.01)；RSV组比哮喘组降低(P<0.01)；而哮喘合并RSV组比哮喘组显著升高(P<0.01)；地塞米松组比RSV组显著降低(P<0.01)。结果与RT-PCR检测法一致。结果见表 2、图 3、图 4。
表2
各组肺组织NGF及LIF的相对含量(
图3
肺组织NGF蛋白表达(免疫组化染色 ×400) a.正常对照组；b.RSV组；c.哮喘组；d.RSV合并哮喘组；e.地塞米松组
图4
肺组织LIF蛋白表达(免疫组化染色 ×400) a.正常对照组；b.RSV组；b.哮喘组；d.RSV合并哮喘组；e.地塞米松组
讨论
哮喘是由多种炎性细胞及细胞组分共同参与的气道慢性炎症，表现为反复发作性的喘息、气促、胸闷等症状，具有可逆性气流受限和气道高反应等特征。有研究提示，支配气道感觉神经及相关神经营养因子与气道炎症密切有关，其机制可能为气管及支气管上皮因炎症反应受损脱落，暴露感觉神经末梢，刺激感觉神经元释放活性物质，这些递质反作用于外周靶细胞，循环作用，从而可引起神经营养因子的升高。NGF可由外周靶细胞合成，经轴突摄取后逆行转运至背根神经节细胞，具有促进神经细胞生长、存活和分化的作用，能够增强神经突触的可塑性，从而刺激神经递质分泌增加[11-12],除了神经营养因子的活性，NGF已被更广泛的认为具有非神经元细胞的生物活性，如可以参与和整合刺激自适系统的成熟以及表达，被认为是免疫系统工作的关键[13]。有文献报道[14-15]，NGF与LIF同属NGF家族成员，有类似生物学活性，作为胞外刺激因子作用于效应细胞过程中，二者具有相同的信号转导通路(Ras-Raf-MEK级联途径)，因此当一种因子受到抑制时，另一种因子的表达水平同样受到抑制，故二者可能参与哮喘发病机制，在RSV感染后导致支气管哮喘发生过程中起到相关作用。
本研究显示，小鼠RSV感染后其肺组织病理改主要为毛细支气管上皮坏死和周围淋巴细胞浸润，可有坏死组织和炎性渗出物充满支气管管腔，造成支气管闭塞等表现。同时出现肺泡间隔增宽及单核细胞为主的间质渗出改变，但无典型哮喘样病理改变。但哮喘合并RSV感染时可使病理组织改变较单纯哮喘病变或RSV感染明显加重。据此可推测RSV感染后并非直接导致哮喘发生，但哮喘感染RSV后在一定程度上加重哮喘病理组织的改变。
本研究应用RT-PCR法检测小鼠肺组织发现，NGF mRNA、LIF mRNA在正常对照组肺组织、RSV组肺组织、哮喘组肺组织、哮喘合并RSV组肺组织中以及地塞米松组肺组织均见表达，模型组均较正常对照组表达增高，其中哮喘组NGF mRNA、LIF mRNA表达较RSV组表达增高，哮喘合并RSV组NGF mRNA、LIF mRNA的表达较单一RSV感染或哮喘组增高，但RSV组予地塞米松干预后，NGF mRNA、LIF mRNA的表达较RSV组降低。与此同时，应用免疫组化法检测NGF、LIF含量，结果与RT-PCR法相一致。
有研究表明，哮喘大鼠气道组织中NGF表达显著增加气道炎症明显相关，予抗NGF干预后可抑制气道炎症[16]。小鼠RSV感染后肺间质有炎性细胞浸润，逐渐出现典型间质性肺炎表现，肺泡腔明显狭窄，炎性细胞浸润，毛细血管扩张充血，随着病情进展，肺间质的炎性细胞浸润逐渐减轻[17]。本研究结果与上述研究结果基本一致。
综合上述研究结果，提示哮喘气道神经源性炎症的发生可能为多种神经营养因子共同作用的结果，这些因子的作用机制相似，但并非相同，神经营养因子在哮喘及呼吸道感染模型中引起的组织病理变化不同，病程长短不同，其具体不同机制需进一步研究；地塞米松可同时抑制这些因子，可引起其他相关致病因子的表达障碍，在临床治疗过程中，可寻找抑制神经生长因子的抑制剂，从而减少RSV感染后发生哮喘的几率，为哮喘防治提供了新的思路。
支气管哮喘(简称哮喘)是最常见的慢性呼吸道疾病，其发病机制较为复杂。接触过敏原，理化刺激，剧烈运动,呼吸道感染等多种因素可以诱发并加重哮喘，其中病毒性呼吸道感染是哮喘急性发作的常见诱因。有报道称，约30％～80％的哮喘急性发作病例中，病毒感染发挥了作用。在常见的病毒感染中呼吸道合胞病毒(RSV)感染占主导地位，RSV是婴幼儿呼吸道感染最为常见的病原之一,研究证实RSV感染可引起毛细支气管炎，向哮喘转化[1-2]，是导致儿童哮喘发生的高危因素。目前有关RSV感染引起哮喘的发病机制尚不明确，有研究证实，豚鼠感染RSV后，其气道高反应性明显增加[3-4]。有研究表明，气道的感觉神经及其营养因子可能与气道炎症的形成密切关联，神经生长因子(nerve grow factor，NGF)及白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等神经营养因子在气道炎症模型肺组织内表达明显升高，且能使神经激肽受体-1(neurokin receptor-1，NK-1R)等速激肽类物质表达增高，从而引发气道炎症性反应[5-6]，提示NGF、LIF是参与及调控气道神经源性炎症的重要炎症因子。本研究主要探讨Balb/c小鼠感染RSV后肺组织的NGF、LIF表达变化及与哮喘的关系，同时研究地塞米松对其表达是否存在影响，从而为哮喘的临床预防与治疗提供新思路。
材料与方法
一 材料
1．动物及主要试剂：清洁级健康雌性Balb/c纯系小鼠，6~8周龄，体质量(22±2) g，由徐州医学院实验动物中心提供；293-T人胚肾细胞株及RSV A2 标准株均由山东医学科学院微生物教研室孟红老师惠赠；HyClone改良型RPMI-1640培养基及HyClone胎牛血清均购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；鸡卵白蛋白(OVA)由美国Sigma公司提供；佐剂氢氧化铝 Al(OH)3干粉由上海生物工程有限公司提供；TRNzol总RNA提取试剂、TIANSscript cDNA第一链合成试剂盒及2×TaqRCR Master Mix均购自天根生物科技(北京)有限公司；NGF mRNA引物、LIF mRNA引物及GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司设计及合成；免抗NGF beta(免疫组化)由武汉博士德生物工程有限公司提供；免抗LIF(免疫组化)由北京博奥森生物技术有限公司提供;浓缩型二氨基联苯胺(DAB)试剂盒及兔超敏二步法检测试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
2．细胞和病毒：293-T人胚肾细胞株在含20 mL/L灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中37 ℃，50 mL/L CO2条件下培养，待生长成单层贴壁细胞后，将RSV病毒接种293-T细胞,继续在含20 mL/L灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基的维持液中培养，待细胞病变达100%时收集病毒，反复冻融、离心，收集RSV上清。
二 方法
1．实验分组及动物模型：参照国内外模型制作方法[7-8]。健康雌性Balb/c小鼠100只，采用随机数字表法分为5组,分别为正常对照组，RSV组，哮喘组，哮喘合并RSV组，地塞米松组，每组20只。正常对照组：于第1、14 d予以生理盐水0.2 mL腹腔注射，第21~25 d用37 ℃生理盐水20 mL雾化吸入30 min。哮喘组：于第1、14 d予以OVA/AL(OH)3 [含OVA100 μg，AL(OH)3 2 mg]腹腔注射，第21 d开始激发，以2%OVA生理盐水20 mL雾化30 min，持续激发5 d。RSV组：于第19、20、21天，取TCID50 10-6.5/mL的RSV病毒悬液100 μL，缓慢滴入鼻腔[9-10]。哮喘合并RSV组：模型制备同哮喘组，第19、20、21 d，以TCID5010-6.5/ mL的RSV病毒悬液100 μL鼻腔滴入。地塞米松组：RSV感染同RSV组，于21~25 d予腹腔注入地塞米松0.2 mg·kg-1·d-1。
2．标本收集：末次激发后24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg)。麻醉后，无菌条件下，眼科镊分离出两侧肺组织，取左肺下叶，-80 ℃冰箱冻存，用于肺组织病毒鉴定。将右肺下叶迅速冻存，留待匀浆后进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。4%甲醛固定液固定右肺中叶和左肺上叶肺组织分别置于标记好的4%甲醛中过夜固定，留待做石蜡切片、HE染色、免疫组化，观察肺组织病理改变及NGF及LIF的变化。
3．肺组织病理学检查：小鼠处死后，4%多聚甲醛固定24 h,脱水、透明、浸蜡及包埋，切片行HE染色，在400倍光镜下观察肺组织病变和炎性细胞浸润等病理改变。
4．肺组织RSV mRNA、NGF mRNA及LIF mRNA 表达检测：采用RT-PCR。各实验组同时进行RT-PCR。TRNzol液提取细胞总RNA,具体操作按说明书进行，紫外分光光度计(A260/A280)检测RNA纯度及完整性，按说明书步骤逆转录mRNA为cDNA。RSV引物：上游序列(5′→3′)TGGAGCCTCAGA TCATCCCA，下游序列(5′→3′)TGATTTTGCCTGG CGTGTTG，片段长度为153 bp；NGF引物：上游序列(5′→3′)GTCAGTGTGTGGGTTGGAGA，下游序列(5′→3′)TTCTTGTAGCCTTCCTGCTG，片段长度304 bp；LIF引物：上游序列(5′→3′)TGCTTGCTGGGT GTATGAAC，下游序列(5′→3′)TTCTGTGGGAGCCT GAACA，片段长度356 bp；GAPDH引物：上游序列(5′→3′)CCTTCATTGACCTCAACTACA，下游序列(5′→3′)CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC，片段长度215 bp。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性 45 s，58 ℃(RSV)/58.8 ℃(NGF)/57 ℃(LIF)/60 ℃(GAPDH)，退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。扩增产物于琼脂糖凝胶上电泳。凝胶成像分析系统测定目的基因产物与内参照基因产物的比值，半定量方法分析目的基因的表达。
5．免疫组化化学方法检测各组肺组织NGF及LIF的表达：石蜡切片恒温箱烤片后，经二甲苯脱蜡、梯度酒精复水，滴加3%H2O2室温孵育15 min灭活内源性过氧化物酶，PBS缓冲液浸泡冲洗3次，浸入0.01 mol/L柠檬酸枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，微波炉热修复抗原，冷却至室温后，PBS缓冲液浸泡清洗2次，继之兔超敏二步法(Polink-2 plus)进行免疫组织化学反应：(1)滴加兔抗小鼠NGF、LIF抗体稀释液(工作浓度1∶100)，4 ℃过夜，(2)滴加试剂Polymer Helper,37 ℃孵育15 min，(3)滴加试剂poly-HRP anti-Rabbit IgG，37 ℃孵育15 min。以上每一步骤之后均用PBS浸泡冲洗3次，每次5 min。最后用DAB法显色，显微镜下控制反应，适时终止。苏木素轻度复染，1%盐酸分化数秒，饱和碳酸锂返蓝1 min,常规脱水、透明及中性树胶(DPX)封固，光镜观察。阴性对照用PBS代替上述一抗进行反应。以细胞浆棕黄色为阳性，采用图像分析软件对NGF及LIF阳性部位进行测定。
三 统计学处理
采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量资料以
结果
一 一般情况
经致敏和激发后，哮喘组和哮喘合并RSV组小鼠出现烦躁不安，缩头弓背，抓挠头面部，前肢缩抬，呼吸急促，偶尔咳嗽等表现；RSV组小鼠滴鼻后第3 d 出现烦躁不安，第6 d表现明显，出现呼吸急促，易激惹，食欲不佳；地塞米松组小鼠症状表现较轻，24 h内精神、食欲均可获得不同程度上的恢复；正常对照组小鼠可见烦躁不安，但无上述其他表现。
二 肺组织病理学改变
正常对照组小鼠肺组织结构清晰，基本无炎症细胞浸润(图 1a)。RSV组支气管管腔狭窄甚至闭塞，肺泡上皮肿胀，肺泡间隔增宽，间质性水肿(图 1b)。哮喘组支气管、毛细支气管及伴行血管壁周围有大量嗜酸性细胞及单核细胞等炎症细胞浸润，支气管粘膜增厚，血管扩张，血管平滑肌增生肥厚(图 1c)。哮喘及RSV组兼具两组的共同表现(图 1d)。地塞米松组无明显炎症细胞浸润及间质性改变(图 1e)。
图1
肺组织病理检查像(HE染色 ×400) a.正常对照组；b.RSV组；c.哮喘组；d.RSV合并哮喘组；e.地塞米松组
三 各组肺组织NGF mRNA及LIF mRNA的表达
在各组肺组织NGF mRNA及LIF mRNA的表达中RSV组与正常对照组相比较升高(P<0.01)；RSV组与哮喘组相比较降低(P<0.01)；而哮喘合并RSV组与哮喘组相比显著升高(P<0.01)；地塞米松组相比RSV组显著降低(P<0.01)。结果见表 1、图 2。
表1
各组肺组织NGFmRNA及LIFmRNA的表达(
图2
RT-PCR检测肺组织中NGF mRNA及LIF mRNA表达 M.Marker；1.正常对照组；2.RSV组；3.哮喘组；4.RSV合并哮喘组；5.地塞米松组
四 各组肺组织NGF蛋白及LIF蛋白的表达
正常对照组可见NGF蛋白及LIF蛋白少量表达，RSV组比正常对照组升高(P<0.01)；RSV组比哮喘组降低(P<0.01)；而哮喘合并RSV组比哮喘组显著升高(P<0.01)；地塞米松组比RSV组显著降低(P<0.01)。结果与RT-PCR检测法一致。结果见表 2、图 3、图 4。
表2
各组肺组织NGF及LIF的相对含量(
图3
肺组织NGF蛋白表达(免疫组化染色 ×400) a.正常对照组；b.RSV组；c.哮喘组；d.RSV合并哮喘组；e.地塞米松组
图4
肺组织LIF蛋白表达(免疫组化染色 ×400) a.正常对照组；b.RSV组；b.哮喘组；d.RSV合并哮喘组；e.地塞米松组
讨论
哮喘是由多种炎性细胞及细胞组分共同参与的气道慢性炎症，表现为反复发作性的喘息、气促、胸闷等症状，具有可逆性气流受限和气道高反应等特征。有研究提示，支配气道感觉神经及相关神经营养因子与气道炎症密切有关，其机制可能为气管及支气管上皮因炎症反应受损脱落，暴露感觉神经末梢，刺激感觉神经元释放活性物质，这些递质反作用于外周靶细胞，循环作用，从而可引起神经营养因子的升高。NGF可由外周靶细胞合成，经轴突摄取后逆行转运至背根神经节细胞，具有促进神经细胞生长、存活和分化的作用，能够增强神经突触的可塑性，从而刺激神经递质分泌增加[11-12],除了神经营养因子的活性，NGF已被更广泛的认为具有非神经元细胞的生物活性，如可以参与和整合刺激自适系统的成熟以及表达，被认为是免疫系统工作的关键[13]。有文献报道[14-15]，NGF与LIF同属NGF家族成员，有类似生物学活性，作为胞外刺激因子作用于效应细胞过程中，二者具有相同的信号转导通路(Ras-Raf-MEK级联途径)，因此当一种因子受到抑制时，另一种因子的表达水平同样受到抑制，故二者可能参与哮喘发病机制，在RSV感染后导致支气管哮喘发生过程中起到相关作用。
本研究显示，小鼠RSV感染后其肺组织病理改主要为毛细支气管上皮坏死和周围淋巴细胞浸润，可有坏死组织和炎性渗出物充满支气管管腔，造成支气管闭塞等表现。同时出现肺泡间隔增宽及单核细胞为主的间质渗出改变，但无典型哮喘样病理改变。但哮喘合并RSV感染时可使病理组织改变较单纯哮喘病变或RSV感染明显加重。据此可推测RSV感染后并非直接导致哮喘发生，但哮喘感染RSV后在一定程度上加重哮喘病理组织的改变。
本研究应用RT-PCR法检测小鼠肺组织发现，NGF mRNA、LIF mRNA在正常对照组肺组织、RSV组肺组织、哮喘组肺组织、哮喘合并RSV组肺组织中以及地塞米松组肺组织均见表达，模型组均较正常对照组表达增高，其中哮喘组NGF mRNA、LIF mRNA表达较RSV组表达增高，哮喘合并RSV组NGF mRNA、LIF mRNA的表达较单一RSV感染或哮喘组增高，但RSV组予地塞米松干预后，NGF mRNA、LIF mRNA的表达较RSV组降低。与此同时，应用免疫组化法检测NGF、LIF含量，结果与RT-PCR法相一致。
有研究表明，哮喘大鼠气道组织中NGF表达显著增加气道炎症明显相关，予抗NGF干预后可抑制气道炎症[16]。小鼠RSV感染后肺间质有炎性细胞浸润，逐渐出现典型间质性肺炎表现，肺泡腔明显狭窄，炎性细胞浸润，毛细血管扩张充血，随着病情进展，肺间质的炎性细胞浸润逐渐减轻[17]。本研究结果与上述研究结果基本一致。
综合上述研究结果，提示哮喘气道神经源性炎症的发生可能为多种神经营养因子共同作用的结果，这些因子的作用机制相似，但并非相同，神经营养因子在哮喘及呼吸道感染模型中引起的组织病理变化不同，病程长短不同，其具体不同机制需进一步研究；地塞米松可同时抑制这些因子，可引起其他相关致病因子的表达障碍，在临床治疗过程中，可寻找抑制神经生长因子的抑制剂，从而减少RSV感染后发生哮喘的几率，为哮喘防治提供了新的思路。
