引用本文： 郏琴, 皮卫峰, 王妍敏, 蔡蓉, 刘乾, 管文斌, 郭雪君. 肺泡灌洗液在诊断真菌性肺炎中的价值. 中国呼吸与危重监护杂志, 2014, 13(6): 569-573. doi: 10.7507/1671-6205.2014139 复制
肺部真菌感染在临床上是引起死亡的重要原因之一，尤其是免疫功能低下和癌症患者[1-2]。及时和准确的诊断非常重要，但由于临床表现不典型造成诊断困难[3-4]。可通过肺组织活检和培养作出正确的诊断[5]，但组织活检的主要缺点是侵入性检查，而培养往往需要较长时间且阳性率较低[6]，肺孢子菌感染不能通过培养获得。在免疫抑制患者中真菌血清抗体效价过低造成假阴性结果；而真菌抗原检测和分子生物学技术是新近出现的能快速诊断肺部真菌感染的方法，但只能用于少数真菌检测，且前者的敏感性较低，后者的费用较高、有假阴性结果，故在临床上使用受到限制[7-9]，可弯曲气管镜肺泡灌洗液(BALF)病原菌检查成为诊断肺部真菌感染重要方法[10-11]。由于支气管镜下的BALF检查并非无菌性操作，检查的结果难以区别定植还是感染[12-13]。区分是肺部定植菌还是真正的真菌感染临床上至关重要，几乎所有肺部肿瘤患者气道内均可同时伴有真菌定植[14-15]。本研究通过5年回顾分析肺泡灌洗液真菌种类，结合患者临床表现、影像学改变和组织活检结果，探讨BALF细胞学检查在诊断肺部真菌感染中价值。
对象与方法
一 对象
收集2009年1月1日至2013年12月31日我院呼吸科通过BALF找到真菌的60例住院患者的临床资料，男46例，女14例；年龄38~78岁，平均(47.8±20.0)岁。最常见的临床症状为咳嗽(32例)、 咳痰(26例)、咯血(10例)和气促(7例)。16例患者有吸烟病史。其中6例患者有反复肺炎经抗生素治疗效果欠佳且血气分析有呼吸衰竭。2例患者因血清胞浆型抗中性粒细胞胞浆抗体(C-ANCA)阳性且两肺多发空洞样小结节诊断韦格纳肉芽肿。3例患者曾有恶性肿瘤病史接受过放射治疗或化学治疗。18例患者入院后经实验室检查发现细胞免疫、体液免疫低下考虑存在免疫功能不全，使用免疫抑制剂；严重糖尿病伴有脏器功能损害；恶性肿瘤；人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和呼吸系统及其他脏器严重疾病。结果见表 1。其中27例诊断为肺部真菌感染，33例为肺部定植菌，诊断标准参照肺部真菌感染和专家共识的标准。确诊患者均经组织病理学确诊，标本包括经皮肺穿刺、支气管镜下肺活检和手术肺组织病理等。
表1
18例免疫功能不全的真菌肺炎患者的临床特征[例(%)]
二 方法
BALF标本采集：所有需行支气管镜检查的患者均在治疗前(排除抗生素及抗真菌药物等干扰因素)签署知情同意书后行支气管检查，在活检、刷检前行支气管肺泡灌洗，常规行左舌叶或右中叶灌洗，影像学有改变行病变肺段灌洗，每次灌洗20 mL，总灌洗量为60~100 mL，回收率达40%~60%，每一份灌洗液通过离心沉淀作PAS和吉姆萨染色确认真菌病原体，通过六胺银染色进一步辨认真菌和肺孢子菌形态[16-24]。进行诱导痰细胞学检查，同时记录患者的临床表现、免疫状况、影像学表现和有关肺组织活检病理结果。通过临床、影像、气管镜检查和组织病理结果分析判断是定植菌还是真正的肺部真菌感染。
结果
一 BALF细胞学检查
最常见的病原体为曲霉35例(58.33%)，念珠菌13例(21.67%)，隐球菌10例(16.67%)和肺孢子菌2例(3.33%)。曲霉显示有分隔菌丝分支约成45°角，念珠菌为2~5 μm大小带有假菌丝的酵母菌(图 1)，隐球菌直径为4~10 μm有荚膜的酵母菌(图 2)，肺孢子菌在肺泡灌洗液中呈串或簇分布，大小4~7 μm，有较厚囊壁(图 3)。
图1
糖尿病患者肺泡灌洗液离心沉淀六胺银染色(×200) a.念珠菌纤细、假菌丝；b.念珠菌孢子
图2
肺泡灌洗液多核巨细胞内可见圆形含有折射体的隐球菌(×400) 图 3 肺泡灌洗液离心沉淀后可见成簇的肺孢子菌(×400)
二 影像学和病理学结果
60例中有33例为定植菌(表 2和表 3)。BALF中找到曲霉(23例)和念珠菌(10例)的患者胸部CT影像检查发现肺实质肿块，或纤维支气管镜(简称纤支镜)发现支气管管腔内有新生物。曲霉中20例(86.96%)和念珠菌中9例(90.00%)最终通过肺组织活检确诊为非小细胞肺癌。1例患者诊断为支气管平滑肌瘤同时伴有曲霉定植。33例患者中有3例同时在BALF中找到恶性肿瘤细胞。另有3例诊断为定植菌的患者，既未发现支气管内有新生物，也未通过实变的肺组织活检找到恶性肿瘤细胞(表 2)，所有诊断为定植菌的患者，反复痰找真菌阴性，免疫功能检查正常，且GM及乳胶凝集试验均为阴性，33例患者中30例(90.91%)纤支镜检查发现气管内新生物，最终经病理确诊非小细胞肺癌29例，平滑肌瘤1例。27例经病理确诊为肺部真菌感染的患者(表 4)影像学有多发结节和实变表现(图 4a，b)而纤支镜检查正常，4例隐球菌肺炎影像学表现为肺实质团块样改变(图 4c)，3例患者通过经皮肺组织活检确诊为隐球菌肺炎，1例患者经气管镜下肺活检确诊为隐球菌肺炎。2例肺孢子菌感染影像学表现为多发磨玻璃样渗出影，1例侵袭性曲霉菌肺炎纤支镜检查发现气管内有新生物，18例免疫功能低下，12例诊断为曲霉菌肺炎和10例诊断为隐球菌肺炎患者血检查(GM、乳胶凝集试验)均提示阳性。通过BALF诊断肺部真菌感染和组织病理学吻合率为45%。
表2
BALF中找到真菌
表3
肺部真菌定植患者的纤支镜、影像学和免疫状况(例)
表4
27例肺部真菌感染患者的纤支镜、影像学和免疫状况(例)
图4
肺部真菌感染影像学改变 a.肺窗示两肺多发散在小结节；b.左上肺小结节及右下肺外后基底段实变影；c.右下肺团块，边缘有长毛刺
讨论
由于临床症状和影像表现不典型，同时存在其他感染和非感染(肿瘤)情况，真菌培养相对较困难且时间较长，肺部真菌感染的诊断及区分定植菌对临床医生是一个挑战[6, 20]。侵袭性肺部真菌有时类似恶性肿瘤生长，也有报道肺部肿瘤被误诊为肺部真菌感染[6, 25]。组织活检诊断特异性较高，但属于侵入性检查，不适于病情较重患者[6, 26]。BALF细胞学检查有助于侵袭性肺部真菌早期诊断，区分是肺部恶性肿瘤的定植菌还是真正的肺部感染临床上至关重要。影像学检查发现肺部肿块或纤支镜检查发现支气管内有新生物时，诊断肺部真菌感染时需考虑定植菌。回顾5年我院呼吸科纤支镜肺泡灌洗液找到真菌60例，其中30例患者通过组织活检确诊为肺部恶性肿瘤。当患者临床症状不典型或在肺泡灌洗液中同时找到肿瘤细胞时，诊断定植菌相对较容易，如前文叙述，有3例患者同时在肺泡灌洗液中找到肿瘤[27]。
另一方面，有免疫功能低下的患者，侵袭性肺部真菌感染可能造成致命威胁，需要早期、准确作出诊断，尽早使用抗真菌药。肺部真菌感染影像学可表现为肺部实变、肺内单发或多发结节，肺门和纵隔淋巴结肿大，有时可表现肺部磨玻璃样渗出影[28-29]。27例肺部真菌感染患者中有6例临床症状和影像上类似肺部恶性肿瘤，最后有4例确诊为隐球菌肺炎、1例确诊为侵袭性肺曲霉菌感染和1例为念珠菌肺炎。在通过肺泡灌洗液细胞学检查诊断肺部真菌感染时，需同时全面评估患者免疫状况(包括细胞免疫和体液免疫)，患者的免疫情况在诊断是肺部真菌感染而非定植菌时有参考价值，据报道，有较多的肺部真菌感染患者伴有免疫功能低下[30-31]。回顾27例肺部真菌感染患者，4例隐球菌肺炎和2例肺孢子菌患者有显著的免疫功能缺陷，实验显示肺孢子菌可以在免疫低下的宿主肺泡中反复复制和引起持续感染[32]，在免疫低下患者中隐球菌肺炎可引起较高发病率和死亡率[33-34]。尽管有报道肺部恶性肿瘤患者同时伴有隐球菌为定植菌，我院却未发现类似病例[35-36]。有别于组织活检可发现局部肺组织缺血坏死、血管侵犯和栓塞很容易确认为肺部真菌感染，灌洗液中找到隐球菌无法从形态上区分是定植菌还是肺部真菌感染[37]。但两者在临床上有细微区别，肺部真菌感染往往有咯血和肺泡出血，同时在其他部位体液和组织活检标本中找到病原菌[38]。有3例隐球菌肺炎和1例侵袭性肺曲霉菌感染通过组织活检得到确认。在灌洗液中找到肺孢子菌可以确认为致病菌。
临床上区分是定植菌还是肺部真菌感染具有重要意义。通常在隆突以上有少数真菌定植，曲霉和念珠菌是最常见的定植菌。通过详细询问病史、特别是患者的免疫情况，相关的影像学和纤支镜检查，经综合考虑可区分是定植菌还是肺部真菌感染，如果临床高度疑似恶性肿瘤而灌洗液细胞学检查阴性需考虑进一步组织活检明确诊断。
综上所述，肺部有恶性肿瘤的患者中曲霉和念珠菌是最常见定植菌，而侵袭性肺曲霉菌和念珠菌肺炎临床和影像有时类似肺部恶性肿瘤。患者的免疫状况在鉴别是定植菌还是肺部真菌感染有重要参考价值，在免疫低下的患者中肺部真菌感染发病率显著高于免疫正常的患者。 在免疫正常的患者肺泡灌洗液中找到真菌首先考虑定植菌，且需警惕可能存在肺部恶性肿瘤。通过肺泡灌洗液诊断肺部真菌感染与组织病理学吻合率为45%。目前，BALF病原菌检查已成为肺部真菌感染的重要辅助方法，随着先进的分子和抗原技术在BALF中的应用，BALF在诊断肺部真菌感染中的价值将越来越重要。
肺部真菌感染在临床上是引起死亡的重要原因之一，尤其是免疫功能低下和癌症患者[1-2]。及时和准确的诊断非常重要，但由于临床表现不典型造成诊断困难[3-4]。可通过肺组织活检和培养作出正确的诊断[5]，但组织活检的主要缺点是侵入性检查，而培养往往需要较长时间且阳性率较低[6]，肺孢子菌感染不能通过培养获得。在免疫抑制患者中真菌血清抗体效价过低造成假阴性结果；而真菌抗原检测和分子生物学技术是新近出现的能快速诊断肺部真菌感染的方法，但只能用于少数真菌检测，且前者的敏感性较低，后者的费用较高、有假阴性结果，故在临床上使用受到限制[7-9]，可弯曲气管镜肺泡灌洗液(BALF)病原菌检查成为诊断肺部真菌感染重要方法[10-11]。由于支气管镜下的BALF检查并非无菌性操作，检查的结果难以区别定植还是感染[12-13]。区分是肺部定植菌还是真正的真菌感染临床上至关重要，几乎所有肺部肿瘤患者气道内均可同时伴有真菌定植[14-15]。本研究通过5年回顾分析肺泡灌洗液真菌种类，结合患者临床表现、影像学改变和组织活检结果，探讨BALF细胞学检查在诊断肺部真菌感染中价值。
对象与方法
一 对象
收集2009年1月1日至2013年12月31日我院呼吸科通过BALF找到真菌的60例住院患者的临床资料，男46例，女14例；年龄38~78岁，平均(47.8±20.0)岁。最常见的临床症状为咳嗽(32例)、 咳痰(26例)、咯血(10例)和气促(7例)。16例患者有吸烟病史。其中6例患者有反复肺炎经抗生素治疗效果欠佳且血气分析有呼吸衰竭。2例患者因血清胞浆型抗中性粒细胞胞浆抗体(C-ANCA)阳性且两肺多发空洞样小结节诊断韦格纳肉芽肿。3例患者曾有恶性肿瘤病史接受过放射治疗或化学治疗。18例患者入院后经实验室检查发现细胞免疫、体液免疫低下考虑存在免疫功能不全，使用免疫抑制剂；严重糖尿病伴有脏器功能损害；恶性肿瘤；人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和呼吸系统及其他脏器严重疾病。结果见表 1。其中27例诊断为肺部真菌感染，33例为肺部定植菌，诊断标准参照肺部真菌感染和专家共识的标准。确诊患者均经组织病理学确诊，标本包括经皮肺穿刺、支气管镜下肺活检和手术肺组织病理等。
表1
18例免疫功能不全的真菌肺炎患者的临床特征[例(%)]
二 方法
BALF标本采集：所有需行支气管镜检查的患者均在治疗前(排除抗生素及抗真菌药物等干扰因素)签署知情同意书后行支气管检查，在活检、刷检前行支气管肺泡灌洗，常规行左舌叶或右中叶灌洗，影像学有改变行病变肺段灌洗，每次灌洗20 mL，总灌洗量为60~100 mL，回收率达40%~60%，每一份灌洗液通过离心沉淀作PAS和吉姆萨染色确认真菌病原体，通过六胺银染色进一步辨认真菌和肺孢子菌形态[16-24]。进行诱导痰细胞学检查，同时记录患者的临床表现、免疫状况、影像学表现和有关肺组织活检病理结果。通过临床、影像、气管镜检查和组织病理结果分析判断是定植菌还是真正的肺部真菌感染。
结果
一 BALF细胞学检查
最常见的病原体为曲霉35例(58.33%)，念珠菌13例(21.67%)，隐球菌10例(16.67%)和肺孢子菌2例(3.33%)。曲霉显示有分隔菌丝分支约成45°角，念珠菌为2~5 μm大小带有假菌丝的酵母菌(图 1)，隐球菌直径为4~10 μm有荚膜的酵母菌(图 2)，肺孢子菌在肺泡灌洗液中呈串或簇分布，大小4~7 μm，有较厚囊壁(图 3)。
图1
糖尿病患者肺泡灌洗液离心沉淀六胺银染色(×200) a.念珠菌纤细、假菌丝；b.念珠菌孢子
图2
肺泡灌洗液多核巨细胞内可见圆形含有折射体的隐球菌(×400) 图 3 肺泡灌洗液离心沉淀后可见成簇的肺孢子菌(×400)
二 影像学和病理学结果
60例中有33例为定植菌(表 2和表 3)。BALF中找到曲霉(23例)和念珠菌(10例)的患者胸部CT影像检查发现肺实质肿块，或纤维支气管镜(简称纤支镜)发现支气管管腔内有新生物。曲霉中20例(86.96%)和念珠菌中9例(90.00%)最终通过肺组织活检确诊为非小细胞肺癌。1例患者诊断为支气管平滑肌瘤同时伴有曲霉定植。33例患者中有3例同时在BALF中找到恶性肿瘤细胞。另有3例诊断为定植菌的患者，既未发现支气管内有新生物，也未通过实变的肺组织活检找到恶性肿瘤细胞(表 2)，所有诊断为定植菌的患者，反复痰找真菌阴性，免疫功能检查正常，且GM及乳胶凝集试验均为阴性，33例患者中30例(90.91%)纤支镜检查发现气管内新生物，最终经病理确诊非小细胞肺癌29例，平滑肌瘤1例。27例经病理确诊为肺部真菌感染的患者(表 4)影像学有多发结节和实变表现(图 4a，b)而纤支镜检查正常，4例隐球菌肺炎影像学表现为肺实质团块样改变(图 4c)，3例患者通过经皮肺组织活检确诊为隐球菌肺炎，1例患者经气管镜下肺活检确诊为隐球菌肺炎。2例肺孢子菌感染影像学表现为多发磨玻璃样渗出影，1例侵袭性曲霉菌肺炎纤支镜检查发现气管内有新生物，18例免疫功能低下，12例诊断为曲霉菌肺炎和10例诊断为隐球菌肺炎患者血检查(GM、乳胶凝集试验)均提示阳性。通过BALF诊断肺部真菌感染和组织病理学吻合率为45%。
表2
BALF中找到真菌
表3
肺部真菌定植患者的纤支镜、影像学和免疫状况(例)
表4
27例肺部真菌感染患者的纤支镜、影像学和免疫状况(例)
图4
肺部真菌感染影像学改变 a.肺窗示两肺多发散在小结节；b.左上肺小结节及右下肺外后基底段实变影；c.右下肺团块，边缘有长毛刺
讨论
由于临床症状和影像表现不典型，同时存在其他感染和非感染(肿瘤)情况，真菌培养相对较困难且时间较长，肺部真菌感染的诊断及区分定植菌对临床医生是一个挑战[6, 20]。侵袭性肺部真菌有时类似恶性肿瘤生长，也有报道肺部肿瘤被误诊为肺部真菌感染[6, 25]。组织活检诊断特异性较高，但属于侵入性检查，不适于病情较重患者[6, 26]。BALF细胞学检查有助于侵袭性肺部真菌早期诊断，区分是肺部恶性肿瘤的定植菌还是真正的肺部感染临床上至关重要。影像学检查发现肺部肿块或纤支镜检查发现支气管内有新生物时，诊断肺部真菌感染时需考虑定植菌。回顾5年我院呼吸科纤支镜肺泡灌洗液找到真菌60例，其中30例患者通过组织活检确诊为肺部恶性肿瘤。当患者临床症状不典型或在肺泡灌洗液中同时找到肿瘤细胞时，诊断定植菌相对较容易，如前文叙述，有3例患者同时在肺泡灌洗液中找到肿瘤[27]。
另一方面，有免疫功能低下的患者，侵袭性肺部真菌感染可能造成致命威胁，需要早期、准确作出诊断，尽早使用抗真菌药。肺部真菌感染影像学可表现为肺部实变、肺内单发或多发结节，肺门和纵隔淋巴结肿大，有时可表现肺部磨玻璃样渗出影[28-29]。27例肺部真菌感染患者中有6例临床症状和影像上类似肺部恶性肿瘤，最后有4例确诊为隐球菌肺炎、1例确诊为侵袭性肺曲霉菌感染和1例为念珠菌肺炎。在通过肺泡灌洗液细胞学检查诊断肺部真菌感染时，需同时全面评估患者免疫状况(包括细胞免疫和体液免疫)，患者的免疫情况在诊断是肺部真菌感染而非定植菌时有参考价值，据报道，有较多的肺部真菌感染患者伴有免疫功能低下[30-31]。回顾27例肺部真菌感染患者，4例隐球菌肺炎和2例肺孢子菌患者有显著的免疫功能缺陷，实验显示肺孢子菌可以在免疫低下的宿主肺泡中反复复制和引起持续感染[32]，在免疫低下患者中隐球菌肺炎可引起较高发病率和死亡率[33-34]。尽管有报道肺部恶性肿瘤患者同时伴有隐球菌为定植菌，我院却未发现类似病例[35-36]。有别于组织活检可发现局部肺组织缺血坏死、血管侵犯和栓塞很容易确认为肺部真菌感染，灌洗液中找到隐球菌无法从形态上区分是定植菌还是肺部真菌感染[37]。但两者在临床上有细微区别，肺部真菌感染往往有咯血和肺泡出血，同时在其他部位体液和组织活检标本中找到病原菌[38]。有3例隐球菌肺炎和1例侵袭性肺曲霉菌感染通过组织活检得到确认。在灌洗液中找到肺孢子菌可以确认为致病菌。
临床上区分是定植菌还是肺部真菌感染具有重要意义。通常在隆突以上有少数真菌定植，曲霉和念珠菌是最常见的定植菌。通过详细询问病史、特别是患者的免疫情况，相关的影像学和纤支镜检查，经综合考虑可区分是定植菌还是肺部真菌感染，如果临床高度疑似恶性肿瘤而灌洗液细胞学检查阴性需考虑进一步组织活检明确诊断。
综上所述，肺部有恶性肿瘤的患者中曲霉和念珠菌是最常见定植菌，而侵袭性肺曲霉菌和念珠菌肺炎临床和影像有时类似肺部恶性肿瘤。患者的免疫状况在鉴别是定植菌还是肺部真菌感染有重要参考价值，在免疫低下的患者中肺部真菌感染发病率显著高于免疫正常的患者。 在免疫正常的患者肺泡灌洗液中找到真菌首先考虑定植菌，且需警惕可能存在肺部恶性肿瘤。通过肺泡灌洗液诊断肺部真菌感染与组织病理学吻合率为45%。目前，BALF病原菌检查已成为肺部真菌感染的重要辅助方法，随着先进的分子和抗原技术在BALF中的应用，BALF在诊断肺部真菌感染中的价值将越来越重要。
