引用本文： 孟文, 刘朝晖, 范伟, 梁志科, 蔡广平. 蛋白酶体抑制剂MG-132对脂多糖致急性肺损伤大鼠的抗炎作用. 中国呼吸与危重监护杂志, 2014, 13(4): 370-373. doi: 10.7507/1671-6205.2014090 复制
急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)是指由心源性以外的各种如感染、创伤、休克等肺内、外致病因素所致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭[1]。ALI/ARDS是一种常见的临床危重病症，有较高的患病率和死亡率[2]。蛋白酶体抑制剂MG-132是一种醛基肽类蛋白酶体抑制剂，能抑制NF-κB抑制蛋白(IκB)的降解，而下调核因子κB(NF-κB)的表达，减少机体的炎症反应[3]。本实验使用蛋白酶体抑制剂MG-132来观察其对内毒素性大鼠急性肺损伤后细胞间粘附分子1(ICAM-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、NF-κB P65表达的影响，进一步探讨MG-132对内毒素性肺损伤后NF-κB信号通路和炎症反应的影响及其机制。
对象与方法
一 材料
1．实验动物：清洁级成年雄性SD大鼠54只，由南方医科大学动物实验中心提供，体质量240~270 g。
2．主要试剂：脂多糖(LPS，美国sigma公司)；MG-132(美国Calbiochem公司)；ICAM-1、TNF-α ELISA试剂盒(均购于上海研吉生物公司)；大鼠NF-κB P65抗体(美国Cell Signaling公司)。
二 方法
1．动物分组与造模：健康清洁级成年雄性SD大鼠54只，按随机数字表法分为对照组、ALI组和MG-132组，每组18只。参照文献[4]的方法经尾静脉注射LPS 5 mg/kg制备大鼠急性肺损伤模型。对照组尾静脉注入生理盐水，ALI组和MG-132组尾静脉注射LPS 5 mg/kg，MG-132组于实验前30 min腹腔注射MG-132 10 mg/kg。
2．标本采集：3组大鼠在注射生理盐水或LPS后2、4、8 h各随机处死6只。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，心脏穿刺抽血处死大鼠，打开胸腔，取肺组织。结扎右肺门，经气管插入一次性静脉输液导管并固定，将7.5 mL无菌PBS分3次灌洗左肺，回收支气管肺泡灌洗液(BALF)。将BALF 4 ℃ 1 200 r/min离心10 min，上清液转移到离心管至于-80 ℃超低温冰箱中备测。同时分离出右肺组织。
3．病理检查：取右肺上叶，用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，常规苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织病理学变化。
4．肺组织湿/干重比值(W/D)检测：取大鼠右肺中叶，用滤纸吸干表面的血迹，称肺湿质量，然后置于75 ℃恒温干燥箱烘烤48 h至恒重，称肺干质量。肺湿质量与干质量的比值即W/D。
5．BALF中ICAM-1、TNF-α的检测：ELISA法测BALF中ICAM-1、TNF-α水平，方法严格按产品说明书进行。
6．Western blot法测定肺组织NF-κB P65蛋白的表达：取右肺下叶，迅速冻存于液氮中以备匀浆。参照文献[5]中介绍的方法，提取肺组织的胞核蛋白。用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，定量后-80 ℃超低温冰箱中保存备用。取50 μg样品蛋白，加人5×SDS加样缓冲液，100 ℃沸水浴中6 min使蛋白变性，进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后，加一抗(NF-κB P65一抗浓度为1∶1 000，β-actin浓度为1∶1 000)，4 ℃过夜，弃一抗，洗膜3次，加相应二抗，室温孵育1 h，洗膜3次，ECL显影，用BIORAD凝胶成像分析系统拍照并进行图像分析，实验重复3次，取平均值，计算目的蛋白的相对表达量(目的蛋白的相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参β-actin条带灰度值)。
三 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理。计量资料以
结果
一 各组大鼠病理特点
各组大鼠肺大体及光镜下观察，对照组大鼠肺组织表面光滑，呈均匀淡粉红色，表面未见病损灶，无充血、水肿；光镜下肺间质及肺泡无充血、水肿、炎症等改变。ALI组大鼠肺组织呈暗红色，肺充血、水肿明显，肺组织体积增大，并随观察时间的延长肺充血、水肿更加明显；光镜下可见肺泡间隔增宽，肺灶性出血，肺泡和肺间质水肿，肺泡腔明显变狭窄，大量炎性细胞浸润。MG-132组大鼠造模后肺组织可见充血、水肿，体积与ALI组比较变化不大；光镜下可见炎性细胞浸润较模型组减轻。结果见图 1。
图1
各组大鼠肺组织病理学变化(HE× 100) a．对照组；b．ALI组；c．MG-132组
二 大鼠肺组织W/D比值情况
对照组大鼠W/D比值在3个时间点变化不显著，差异无统计学意义。ALI组与对照组比较，各观察时间点肺组织W/D比值均明显升高(P＜0.05)。MG-132组各观察时间点肺组织W/D比值较ALI组明显降低，但高于对照组(P＜0.05)。结果见表 1。
表1
各时间点三组大鼠肺组织W/D(n=6，三 大鼠BALF中ICAM-1、TNF-α水平
与对照组比较，ALI组、MG-132组BALF中ICAM-1、TNF-α含量在各观察时间点均明显升高(P＜0.05)，并随着观察时间的延长有升高的趋势；MG-132组各观察时间点BALF中ICAM-1、TNF-α含量均较ALI组降低(P＜0.05)。结果见表 2。
表2
各时间点三组大鼠BALF 中ICAM-1、TNF-α的表达(n=6，n=50，四 肺组织NF-κB P65蛋白的表达
各观察时间点ALI组、MG-132组肺组织NF-κB P65蛋白的相对表达量较对照组升高(P＜0.05)；MG-132组肺组织NF-κB P65蛋白的相对表达量较ALI组降低(P＜0.05)。结果见图 2、表 3。
图2
各时间点三组大鼠肺组织NF-κB P65蛋白的表达
表3
各时间点三组大鼠肺组织NF-κB P65蛋白的相对表达量(n=6，五 相关性分析
三组大鼠肺组织NF-κB P65蛋白的表达与ICAM-1、TNF-α的表达呈显著正相关(r值为0.783~0.962，P均＜0.01)。
讨论
本研究参照文献采用尾静脉注射LPS 5 mg/kg的方法制备大鼠内毒素性急性肺损伤模型[4]，实验表明ALI组与对照组相比肺组织W/D升高，BALF中ICAM-1、TNF-α含量升高，光镜下可见肺组织充血、水肿、大量炎症细胞浸润，肺泡结构明显破坏，提示大鼠内毒素性急性肺损伤模型制备成功。LPS是革兰阴性细菌外膜的主要组成部分，它在ALI的病因中起重要作用，可以激活多种效应细胞释放大量炎症介质如TNF-α、ICAM-1，从而导致ALI[6]。本研究结果发现ALI组大鼠BALF中ICAM-1、TNF-α含量在使用内毒素2 h后开始明显升高，并随着时间的延长呈进行性增加趋势，证明ICAM-1、TNF-α参与了大鼠内毒素性急性肺损伤时的病理生理改变，与文献报道相符。
NF-κB作为一种转录调节因子，NF-κB的活化可上调ICAM-1、TNF-α等炎症相关因子的表达，诱发炎症反应，导致脏器损伤[7]。NF-κB的激活在LPS导致的ALI/ARDS中起关键作用[8]。NF-κB包括P50、P65两个亚基，且常以它们形成的异二聚体形式存在。在静止细胞中NF-κB与其抑制蛋白(IκB)偶联形成无活性的三聚体存留于胞浆[9-10]。在炎症刺激时，IκB发生磷酸化降解，释放出NF-κB，并转移至细胞核，与调控基因的启动子或增强子结合，启动和调控参与炎症反应的炎症相关因子[11]。研究发现蛋白酶体抑制剂MG-132作为一种新型的抗炎药物，能够通过抑制IκB发生磷酸化降解从而抑制NF-κB激活，减少ICAM-1、TNF-α等炎症相关因子的表达，最终减轻炎症损伤[12-13]。提前使用蛋白酶体抑制剂MG-132可明显提高重症肺炎大鼠的生存率[14]。参照文献[15]及预实验结果，选择MG-132剂量为10 mg/kg，结果表明与ALI组相比MG-132组肺组织光镜下可见肺组织损伤减轻，肺组织W/D降低，BALF中ICAM-1、TNF-α含量降低，核蛋白中NF-κB P65较模型组表达降低，提示MG-132可改善内毒素性急性肺损伤炎症反应。相关性分析表明三组大鼠肺组织NF-κB P65蛋白的表达与ICAM-1、TNF-α的表达呈显著正相关，证实抑制NF-κB的激活可以减少炎症相关因子ICAM-1、TNF-α的表达。
综上所述，本实验证实MG-132可改善内毒素性急性肺损伤炎症反应，这种作用可能与抑制NF-κB的激活，从而减少炎症相关因子ICAM-1、TNF-α的表达，抑制炎症损伤有关。然而，本研究MG-132为制备模型前用药，未设置模型制备后MG-132对照组，我们还需要进一步明确MG-132的最佳治疗时间及剂量，深入探讨和研究MG-132对脂多糖致急性肺损伤大鼠的抗炎作用机制。
急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)是指由心源性以外的各种如感染、创伤、休克等肺内、外致病因素所致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭[1]。ALI/ARDS是一种常见的临床危重病症，有较高的患病率和死亡率[2]。蛋白酶体抑制剂MG-132是一种醛基肽类蛋白酶体抑制剂，能抑制NF-κB抑制蛋白(IκB)的降解，而下调核因子κB(NF-κB)的表达，减少机体的炎症反应[3]。本实验使用蛋白酶体抑制剂MG-132来观察其对内毒素性大鼠急性肺损伤后细胞间粘附分子1(ICAM-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、NF-κB P65表达的影响，进一步探讨MG-132对内毒素性肺损伤后NF-κB信号通路和炎症反应的影响及其机制。
对象与方法
一 材料
1．实验动物：清洁级成年雄性SD大鼠54只，由南方医科大学动物实验中心提供，体质量240~270 g。
2．主要试剂：脂多糖(LPS，美国sigma公司)；MG-132(美国Calbiochem公司)；ICAM-1、TNF-α ELISA试剂盒(均购于上海研吉生物公司)；大鼠NF-κB P65抗体(美国Cell Signaling公司)。
二 方法
1．动物分组与造模：健康清洁级成年雄性SD大鼠54只，按随机数字表法分为对照组、ALI组和MG-132组，每组18只。参照文献[4]的方法经尾静脉注射LPS 5 mg/kg制备大鼠急性肺损伤模型。对照组尾静脉注入生理盐水，ALI组和MG-132组尾静脉注射LPS 5 mg/kg，MG-132组于实验前30 min腹腔注射MG-132 10 mg/kg。
2．标本采集：3组大鼠在注射生理盐水或LPS后2、4、8 h各随机处死6只。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，心脏穿刺抽血处死大鼠，打开胸腔，取肺组织。结扎右肺门，经气管插入一次性静脉输液导管并固定，将7.5 mL无菌PBS分3次灌洗左肺，回收支气管肺泡灌洗液(BALF)。将BALF 4 ℃ 1 200 r/min离心10 min，上清液转移到离心管至于-80 ℃超低温冰箱中备测。同时分离出右肺组织。
3．病理检查：取右肺上叶，用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，常规苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织病理学变化。
4．肺组织湿/干重比值(W/D)检测：取大鼠右肺中叶，用滤纸吸干表面的血迹，称肺湿质量，然后置于75 ℃恒温干燥箱烘烤48 h至恒重，称肺干质量。肺湿质量与干质量的比值即W/D。
5．BALF中ICAM-1、TNF-α的检测：ELISA法测BALF中ICAM-1、TNF-α水平，方法严格按产品说明书进行。
6．Western blot法测定肺组织NF-κB P65蛋白的表达：取右肺下叶，迅速冻存于液氮中以备匀浆。参照文献[5]中介绍的方法，提取肺组织的胞核蛋白。用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，定量后-80 ℃超低温冰箱中保存备用。取50 μg样品蛋白，加人5×SDS加样缓冲液，100 ℃沸水浴中6 min使蛋白变性，进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后，加一抗(NF-κB P65一抗浓度为1∶1 000，β-actin浓度为1∶1 000)，4 ℃过夜，弃一抗，洗膜3次，加相应二抗，室温孵育1 h，洗膜3次，ECL显影，用BIORAD凝胶成像分析系统拍照并进行图像分析，实验重复3次，取平均值，计算目的蛋白的相对表达量(目的蛋白的相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参β-actin条带灰度值)。
三 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理。计量资料以
结果
一 各组大鼠病理特点
各组大鼠肺大体及光镜下观察，对照组大鼠肺组织表面光滑，呈均匀淡粉红色，表面未见病损灶，无充血、水肿；光镜下肺间质及肺泡无充血、水肿、炎症等改变。ALI组大鼠肺组织呈暗红色，肺充血、水肿明显，肺组织体积增大，并随观察时间的延长肺充血、水肿更加明显；光镜下可见肺泡间隔增宽，肺灶性出血，肺泡和肺间质水肿，肺泡腔明显变狭窄，大量炎性细胞浸润。MG-132组大鼠造模后肺组织可见充血、水肿，体积与ALI组比较变化不大；光镜下可见炎性细胞浸润较模型组减轻。结果见图 1。
图1
各组大鼠肺组织病理学变化(HE× 100) a．对照组；b．ALI组；c．MG-132组
二 大鼠肺组织W/D比值情况
对照组大鼠W/D比值在3个时间点变化不显著，差异无统计学意义。ALI组与对照组比较，各观察时间点肺组织W/D比值均明显升高(P＜0.05)。MG-132组各观察时间点肺组织W/D比值较ALI组明显降低，但高于对照组(P＜0.05)。结果见表 1。
表1
各时间点三组大鼠肺组织W/D(n=6，三 大鼠BALF中ICAM-1、TNF-α水平
与对照组比较，ALI组、MG-132组BALF中ICAM-1、TNF-α含量在各观察时间点均明显升高(P＜0.05)，并随着观察时间的延长有升高的趋势；MG-132组各观察时间点BALF中ICAM-1、TNF-α含量均较ALI组降低(P＜0.05)。结果见表 2。
表2
各时间点三组大鼠BALF 中ICAM-1、TNF-α的表达(n=6，n=50，四 肺组织NF-κB P65蛋白的表达
各观察时间点ALI组、MG-132组肺组织NF-κB P65蛋白的相对表达量较对照组升高(P＜0.05)；MG-132组肺组织NF-κB P65蛋白的相对表达量较ALI组降低(P＜0.05)。结果见图 2、表 3。
图2
各时间点三组大鼠肺组织NF-κB P65蛋白的表达
表3
各时间点三组大鼠肺组织NF-κB P65蛋白的相对表达量(n=6，五 相关性分析
三组大鼠肺组织NF-κB P65蛋白的表达与ICAM-1、TNF-α的表达呈显著正相关(r值为0.783~0.962，P均＜0.01)。
讨论
本研究参照文献采用尾静脉注射LPS 5 mg/kg的方法制备大鼠内毒素性急性肺损伤模型[4]，实验表明ALI组与对照组相比肺组织W/D升高，BALF中ICAM-1、TNF-α含量升高，光镜下可见肺组织充血、水肿、大量炎症细胞浸润，肺泡结构明显破坏，提示大鼠内毒素性急性肺损伤模型制备成功。LPS是革兰阴性细菌外膜的主要组成部分，它在ALI的病因中起重要作用，可以激活多种效应细胞释放大量炎症介质如TNF-α、ICAM-1，从而导致ALI[6]。本研究结果发现ALI组大鼠BALF中ICAM-1、TNF-α含量在使用内毒素2 h后开始明显升高，并随着时间的延长呈进行性增加趋势，证明ICAM-1、TNF-α参与了大鼠内毒素性急性肺损伤时的病理生理改变，与文献报道相符。
NF-κB作为一种转录调节因子，NF-κB的活化可上调ICAM-1、TNF-α等炎症相关因子的表达，诱发炎症反应，导致脏器损伤[7]。NF-κB的激活在LPS导致的ALI/ARDS中起关键作用[8]。NF-κB包括P50、P65两个亚基，且常以它们形成的异二聚体形式存在。在静止细胞中NF-κB与其抑制蛋白(IκB)偶联形成无活性的三聚体存留于胞浆[9-10]。在炎症刺激时，IκB发生磷酸化降解，释放出NF-κB，并转移至细胞核，与调控基因的启动子或增强子结合，启动和调控参与炎症反应的炎症相关因子[11]。研究发现蛋白酶体抑制剂MG-132作为一种新型的抗炎药物，能够通过抑制IκB发生磷酸化降解从而抑制NF-κB激活，减少ICAM-1、TNF-α等炎症相关因子的表达，最终减轻炎症损伤[12-13]。提前使用蛋白酶体抑制剂MG-132可明显提高重症肺炎大鼠的生存率[14]。参照文献[15]及预实验结果，选择MG-132剂量为10 mg/kg，结果表明与ALI组相比MG-132组肺组织光镜下可见肺组织损伤减轻，肺组织W/D降低，BALF中ICAM-1、TNF-α含量降低，核蛋白中NF-κB P65较模型组表达降低，提示MG-132可改善内毒素性急性肺损伤炎症反应。相关性分析表明三组大鼠肺组织NF-κB P65蛋白的表达与ICAM-1、TNF-α的表达呈显著正相关，证实抑制NF-κB的激活可以减少炎症相关因子ICAM-1、TNF-α的表达。
综上所述，本实验证实MG-132可改善内毒素性急性肺损伤炎症反应，这种作用可能与抑制NF-κB的激活，从而减少炎症相关因子ICAM-1、TNF-α的表达，抑制炎症损伤有关。然而，本研究MG-132为制备模型前用药，未设置模型制备后MG-132对照组，我们还需要进一步明确MG-132的最佳治疗时间及剂量，深入探讨和研究MG-132对脂多糖致急性肺损伤大鼠的抗炎作用机制。
