引用本文： 徐宪韬, 孙丽华, 史莹. 柚皮素对人肺成纤维细胞表达血管内皮生长因子的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2014, 13(1): 18-20. doi: 10.7507/1671-6205.2014005 复制
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是我国乃至世界范围内主要影响人类健康的疾病之一。目前认为慢阻肺是以气道、肺实质和肺血管的慢性炎症为特征的病变[1]。在疾病发展过程中，血管内皮生长因子(VEGF)通过诱导血管内皮细胞生长、迁移及增加血管渗透性等参与了慢性炎症和血管生成 [2]。在我国，慢阻肺的发生与吸烟有密切关系。研究发现香烟提取物(CSE)能够通过Smad3介导促使肺成纤维细胞产生VEGF，成为慢阻肺患者肺内VEGF的重要来源[3]。柚皮素是一种天然的、不良反应轻微的二氢黄酮类化合物，具有抗炎、免疫调节、抗氧化、抗增殖、抗肿瘤等作用[4-7]。研究表明在大鼠动脉损伤重建后，柚皮素具有抑制平滑肌细胞增殖和抑制血管内皮内细胞过渡增生的作用[8]。因此，柚皮素可能抑制慢阻肺的气道重塑过程。我们之前的研究已发现，柚皮素能抑制Smad2磷酸化，但是柚皮素对Smad3及VEGF的作用如何，目前尚不清楚。本研究以肺成纤维细胞为研究对象，探讨柚皮素能否影响CSE诱导的VEGF的生成，并对其机制做进一步探讨。
对象与方法
一 材料
DEME培养基、0.25%Trypsin-EDTA、胎牛血清(GIBCO公司)；多克隆兔VEGFR-1抗体(SC-316)、辣根过氧化物酶标记羊抗体兔IgG、单克隆小鼠抗β-actin、柚皮素激动剂T0901317(Santa Cruz)、VEGF ELISA检测试剂盒、人胚肺成纤维细胞(南京凯基生物公司)。
二 方法
1．细胞培养以及柚皮素和CSE的准备：将人胚肺成纤维细胞接种于50 mL培养瓶，培养基为RPMI 1640+10%胎牛血清。每隔3 d换液1次，当细胞80%~90%铺满，先用PBS洗涤2次，加入1.5 mL 0.25%Trypsin-EDTA，显微镜下观察，当细胞收缩成圆形后，弃去消化液，加入培养液，无菌吸管吹打至贴壁细胞全部浮起，1∶3接种于培养瓶继续培养，初始细胞接种密度为(2~5)×105个/mL。柚皮素用DMSO溶解，终浓度0.1 mg/ L。CSE制备参照Yunchao等[9]的方法，1只香烟用25 mL无血清的DMEM培养液制成悬液，密封瓶内，摇动使其充分溶解，调pH至7.3，过滤除菌，放置1 h。
2．细胞分组：当细胞进入对数生长期，细胞融合达80%~90%时，分为对照组、CES组(2.5%，5%，10%)和柚皮素干预组。对照组为不含血清的DEME培养液；CSE组为2.5%、5%、10%CSE的DEME培养液；柚皮素干预组再分为低剂量组、中剂量组和高剂量组，终浓度分别为5、10、20 μmol/L。
3．ELISA检测：使用ELISA试剂盒测定细胞培养上清液中的VEGF，根据试剂盒说明制作标准曲线，取100 μL样品加入已包被抗血管内皮生长因子抗体的酶标板上，充分混匀后置37 ℃温度下反应90 min，洗板后加入生物素化的一抗1 h，再次洗板后加入酶标二抗30 min，然后加入酶底物15 min，测定吸光度，计算样品中的VEGF的含量。
4．Western blot法测定Smad3水平和磷酸化后的Smad3(p-Smad3)水平：提取对照组、CSE(5%)组，以及柚皮素干预低剂量组、中剂量组、高剂量组的细胞总蛋白，电泳后转膜，以脱脂奶粉封闭，标一抗4 ℃过夜，二抗为辣根过氧化物酶标记抗体，于室温下震摇1 h，X光压片曝光后分析。
三 统计学处理
采用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析。数据以
结果
一 CSE对人胚肺成纤维细胞VEGF表达的影响
用含CSE的DEME培养基培养的人胚肺成纤维细胞VEGF表达较对照组明显升高，且随着剂量与时间的增加，VEGF的增加越明显。结果见图 1。
图1
CSE诱导人胚肺成纤维细胞生成VEGF
与对照组比较，*
二 柚皮素对CSE诱导的人胚肺成纤维细胞VEGF表达的影响
CSE可以刺激成纤维细胞释放VEGF，加入2 mL含10、20和40 μmol/L柚皮素的DEME培养液(加入5%CSE)，与对照组和5%CSE组比较，柚皮素干预组VEGF释放减少，且随着柚皮素浓度的增加，抑制越明显。结果见图 2。
图2
柚皮素对CSE诱导的VEGF表达的影响
与对照组比较，*
三 柚皮素干预对TGF-β1诱导的Smad3磷酸化的影响
对照组和CSE组Smad3表达总量无明显差异(P＞0.05)，而CSE组p-Smad3明显高于对照组。与柚皮素共同孵育，柚皮素干预组Smda3的表达总量与CSE组比较无明显差异，而p-Smad3的含量较CSE组明显降低(P＜0.05)，且柚皮素剂量越大，降低越明显。结果见图 3。
图3
柚皮素(20 μmol/L)对Smad3及p-Smad3的影响 a：Smad3和p-Smad3电泳图；b：Smad3与GAPDH灰度比值；c：p-Smad3与GAPDH灰度比值
与对照组比较，*
讨论
在慢阻肺病程中，成纤维细胞不仅起着结构支撑作用，还能释放生长因子以旁分泌和自分泌的形式调节和维持微环境稳态。其中成纤维细胞分泌的VEGF通过刺激有丝分裂调节内皮细胞的生存与分化，促进肺气肿、肺动脉高压的形成。烟雾作为慢阻肺主要的发病原因之一，其引起的气道损伤及此后的肺动脉高压与VEGF密切相关，因此研究VEGF的生成及影响因素具有重要意义。目前已发现成纤维细胞可以在TGF-β1刺激下诱导生成VEGF。Kobayashi等[10]通过siRNA对Smad2与Smad3的RNA干扰实验，发现TGF-β1与TβR1结合后，通过Smad3而非Smad2产生VEGF。CSE可以不依赖TGF-β1活化TβR1，从而通过Smad3诱导VEGF生成。我们的研究亦发现，随着CSE浓度的增加，成纤维细胞生成VEGF逐渐增加，与之前的研究一致。
柚皮素活化后能抑制部分炎性基因的表达，并且能降低大鼠动脉损伤重建后血管内皮的过度增生，提示其可能具有抑制血管增生及气道重塑的作用。本研究发现柚皮素能抑制CSE引起的VEGF生成，并且随柚皮素浓度的增加，抑制作用越明显。
由于CSE是通过TβR1/Smad3途径诱导VEGF生成，而柚皮素可以抑制此种效应，那么柚皮素可否抑制TβR1/Smad3通路呢？通过对Smad3及Smad3磷酸化程度的检测，我们发现柚皮素能抑制加入CSE后60 min时人胚肺成纤维细胞内Smad3的总量，同时Smad3磷酸化程度降低，提示柚皮素可以通过抑制TβR1/Smad3通路抑制CSE诱导的VEGF产生。
综上所述，本研究证实了柚皮素可以抑制成纤维细胞生成VEGF，原因可能是抑制了Smad3效应蛋白行使生物学功能，从而影响TβR1/Smad3通路，减少了其靶基因的表达。本研究结果为利用柚皮素治疗呼吸系统疾病提供了理论依据，为治疗慢阻肺提供了新的思路和方法
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是我国乃至世界范围内主要影响人类健康的疾病之一。目前认为慢阻肺是以气道、肺实质和肺血管的慢性炎症为特征的病变[1]。在疾病发展过程中，血管内皮生长因子(VEGF)通过诱导血管内皮细胞生长、迁移及增加血管渗透性等参与了慢性炎症和血管生成 [2]。在我国，慢阻肺的发生与吸烟有密切关系。研究发现香烟提取物(CSE)能够通过Smad3介导促使肺成纤维细胞产生VEGF，成为慢阻肺患者肺内VEGF的重要来源[3]。柚皮素是一种天然的、不良反应轻微的二氢黄酮类化合物，具有抗炎、免疫调节、抗氧化、抗增殖、抗肿瘤等作用[4-7]。研究表明在大鼠动脉损伤重建后，柚皮素具有抑制平滑肌细胞增殖和抑制血管内皮内细胞过渡增生的作用[8]。因此，柚皮素可能抑制慢阻肺的气道重塑过程。我们之前的研究已发现，柚皮素能抑制Smad2磷酸化，但是柚皮素对Smad3及VEGF的作用如何，目前尚不清楚。本研究以肺成纤维细胞为研究对象，探讨柚皮素能否影响CSE诱导的VEGF的生成，并对其机制做进一步探讨。
对象与方法
一 材料
DEME培养基、0.25%Trypsin-EDTA、胎牛血清(GIBCO公司)；多克隆兔VEGFR-1抗体(SC-316)、辣根过氧化物酶标记羊抗体兔IgG、单克隆小鼠抗β-actin、柚皮素激动剂T0901317(Santa Cruz)、VEGF ELISA检测试剂盒、人胚肺成纤维细胞(南京凯基生物公司)。
二 方法
1．细胞培养以及柚皮素和CSE的准备：将人胚肺成纤维细胞接种于50 mL培养瓶，培养基为RPMI 1640+10%胎牛血清。每隔3 d换液1次，当细胞80%~90%铺满，先用PBS洗涤2次，加入1.5 mL 0.25%Trypsin-EDTA，显微镜下观察，当细胞收缩成圆形后，弃去消化液，加入培养液，无菌吸管吹打至贴壁细胞全部浮起，1∶3接种于培养瓶继续培养，初始细胞接种密度为(2~5)×105个/mL。柚皮素用DMSO溶解，终浓度0.1 mg/ L。CSE制备参照Yunchao等[9]的方法，1只香烟用25 mL无血清的DMEM培养液制成悬液，密封瓶内，摇动使其充分溶解，调pH至7.3，过滤除菌，放置1 h。
2．细胞分组：当细胞进入对数生长期，细胞融合达80%~90%时，分为对照组、CES组(2.5%，5%，10%)和柚皮素干预组。对照组为不含血清的DEME培养液；CSE组为2.5%、5%、10%CSE的DEME培养液；柚皮素干预组再分为低剂量组、中剂量组和高剂量组，终浓度分别为5、10、20 μmol/L。
3．ELISA检测：使用ELISA试剂盒测定细胞培养上清液中的VEGF，根据试剂盒说明制作标准曲线，取100 μL样品加入已包被抗血管内皮生长因子抗体的酶标板上，充分混匀后置37 ℃温度下反应90 min，洗板后加入生物素化的一抗1 h，再次洗板后加入酶标二抗30 min，然后加入酶底物15 min，测定吸光度，计算样品中的VEGF的含量。
4．Western blot法测定Smad3水平和磷酸化后的Smad3(p-Smad3)水平：提取对照组、CSE(5%)组，以及柚皮素干预低剂量组、中剂量组、高剂量组的细胞总蛋白，电泳后转膜，以脱脂奶粉封闭，标一抗4 ℃过夜，二抗为辣根过氧化物酶标记抗体，于室温下震摇1 h，X光压片曝光后分析。
三 统计学处理
采用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析。数据以
结果
一 CSE对人胚肺成纤维细胞VEGF表达的影响
用含CSE的DEME培养基培养的人胚肺成纤维细胞VEGF表达较对照组明显升高，且随着剂量与时间的增加，VEGF的增加越明显。结果见图 1。
图1
CSE诱导人胚肺成纤维细胞生成VEGF
与对照组比较，*
二 柚皮素对CSE诱导的人胚肺成纤维细胞VEGF表达的影响
CSE可以刺激成纤维细胞释放VEGF，加入2 mL含10、20和40 μmol/L柚皮素的DEME培养液(加入5%CSE)，与对照组和5%CSE组比较，柚皮素干预组VEGF释放减少，且随着柚皮素浓度的增加，抑制越明显。结果见图 2。
图2
柚皮素对CSE诱导的VEGF表达的影响
与对照组比较，*
三 柚皮素干预对TGF-β1诱导的Smad3磷酸化的影响
对照组和CSE组Smad3表达总量无明显差异(P＞0.05)，而CSE组p-Smad3明显高于对照组。与柚皮素共同孵育，柚皮素干预组Smda3的表达总量与CSE组比较无明显差异，而p-Smad3的含量较CSE组明显降低(P＜0.05)，且柚皮素剂量越大，降低越明显。结果见图 3。
图3
柚皮素(20 μmol/L)对Smad3及p-Smad3的影响 a：Smad3和p-Smad3电泳图；b：Smad3与GAPDH灰度比值；c：p-Smad3与GAPDH灰度比值
与对照组比较，*
讨论
在慢阻肺病程中，成纤维细胞不仅起着结构支撑作用，还能释放生长因子以旁分泌和自分泌的形式调节和维持微环境稳态。其中成纤维细胞分泌的VEGF通过刺激有丝分裂调节内皮细胞的生存与分化，促进肺气肿、肺动脉高压的形成。烟雾作为慢阻肺主要的发病原因之一，其引起的气道损伤及此后的肺动脉高压与VEGF密切相关，因此研究VEGF的生成及影响因素具有重要意义。目前已发现成纤维细胞可以在TGF-β1刺激下诱导生成VEGF。Kobayashi等[10]通过siRNA对Smad2与Smad3的RNA干扰实验，发现TGF-β1与TβR1结合后，通过Smad3而非Smad2产生VEGF。CSE可以不依赖TGF-β1活化TβR1，从而通过Smad3诱导VEGF生成。我们的研究亦发现，随着CSE浓度的增加，成纤维细胞生成VEGF逐渐增加，与之前的研究一致。
柚皮素活化后能抑制部分炎性基因的表达，并且能降低大鼠动脉损伤重建后血管内皮的过度增生，提示其可能具有抑制血管增生及气道重塑的作用。本研究发现柚皮素能抑制CSE引起的VEGF生成，并且随柚皮素浓度的增加，抑制作用越明显。
由于CSE是通过TβR1/Smad3途径诱导VEGF生成，而柚皮素可以抑制此种效应，那么柚皮素可否抑制TβR1/Smad3通路呢？通过对Smad3及Smad3磷酸化程度的检测，我们发现柚皮素能抑制加入CSE后60 min时人胚肺成纤维细胞内Smad3的总量，同时Smad3磷酸化程度降低，提示柚皮素可以通过抑制TβR1/Smad3通路抑制CSE诱导的VEGF产生。
综上所述，本研究证实了柚皮素可以抑制成纤维细胞生成VEGF，原因可能是抑制了Smad3效应蛋白行使生物学功能，从而影响TβR1/Smad3通路，减少了其靶基因的表达。本研究结果为利用柚皮素治疗呼吸系统疾病提供了理论依据，为治疗慢阻肺提供了新的思路和方法
