引用本文： 骆伟, 苏圆辉, 于澄, 柴长鹏, 唐欢, 苗龙, 王正峰, 徐浩. 悬浮培养构建源于胃癌患者的类器官及鉴定. 中国普外基础与临床杂志, 2024, 31(8): 924-927. doi: 10.7507/1007-9424.202401079 复制
虽然胃癌发病率自20世纪中期以来开始下降[1]，但它仍是造成全球癌症相关死亡的第三大原因[2-3]。由于胃癌患者的临床症状出现较晚，大部分患者就诊时已处于疾病中晚期，所以胃癌患者的治疗效果仍欠佳[4]。因此，对胃癌的发病机制和防治方法进行深入研究意义重大。近年来研究较热的类器官是通过原代组织的成体干细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞在富含层粘连蛋白的细胞外基质中自组装而形成[5-6]，它与原代组织在生理结构和功能上相似，是肿瘤研究的良好模型。早在2018年始已有4个团队[7-10]报道了胃类器官的建立及应用研究，在这些研究中均是利用基质胶Matrigel进行类器官的培养，其实验费用相对较高。本研究采用悬浮法建立胃癌类器官，探讨其可行性，为胃癌类器官的培养探索一种实用且较经济的实验方法。
1 资料与方法
1.1 组织来源
本研究仅是初步验证悬浮培养构建胃癌类器官的可行性，因此仅选取2021年7–12月期间于兰州大学第一医院行手术治疗的3例胃癌患者的组织标本。患者术前均未接受肿瘤放化疗，经术后组织病理学检查确认。本研究获得了兰州大学第一医院医学伦理委员会的批准通过（批文编号：LDYYLL2022-292），并且也获得了3例患者授权委托人的知情同意。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂和仪器
12孔培养板购自无锡耐思生物科技有限公司（货号：71201B01）。DMEM/F12培养基、胎牛血清及Trypsin（胰蛋白酶）均购自以色列BI公司。细胞培养添加剂Glutamax（货号：35050061）和组织分散酶Dispase Ⅱ（货号：17105041）均购自美国Invitrogen公司；胶原酶Ⅱ（货号：17101015）购自美国Gibco公司；无血清快速细胞冻存液M5 HiPure（货号：MF699-01）购自北京聚合美生物科技有限公司；抗体低分子量细胞角蛋白（low molecular weight cytokeratin，CK-LMW，货号：MAB-0051）、p53（货号：MAB-0674）及Ki67（货号： MAB-0672）均购自福州迈新生物技术开发有限公司。倒置显微镜购自日本Nikon公司，石蜡切片机购自德国Laica公司。
1.2.2 类器官的建立
严格采取无菌操作原则。根据肿瘤大小切取适量新鲜肿瘤组织后置于运输液中保存，在最短时间内转运至实验室。将癌组织标本放入60 mm培养皿内，用磷酸盐缓冲液冲洗，去除血块、坏死组织及纤维成分。然后用无菌手术刀片切取清理干净的部分组织，冻存于–80 ℃冰箱中，备后续实验用；将剩余肿瘤组织尽可能切碎，然后加入至10 mL混合消化酶的离心管中消化，于37 ℃下摇床中消化20～60 min。期间不时观察组织块消化情况，待组织体积减少至一半时，将消化液用100目细胞筛过滤后收集至15 mL离心管内，400×g离心4 min，弃去上清液。重复2次。收集细胞沉淀，用类器官完全培养液重悬肿瘤细胞。然后按每孔200个小细胞团将细胞悬液直接接种至12孔超低吸附板进行类器官的培养。类器官培养基成分为DMEM/F12培养基中加入1×Glutamax、10%胎牛血清和1%青-链霉素。
1.2.3 类器官的传代、冻存和复苏
当胃癌类器官直径达到100 μm时进行传代。将类器官悬液移至15 mL离心管中，加入适量磷酸盐缓冲液，用枪头轻柔吹打混匀，400×g离心4 min，弃去上清液。向沉淀中加入约2 mL的0.25%胰蛋白酶，轻柔吹打，分散团块，37 ℃环境消化，同时保持镜下观察，直至类器官酶解至3～5个细胞的小细胞团状态。终止消化时向细胞团块加入5 mL完全培养基，枪头轻柔吹打混匀，400×g离心4 min，弃去上清液。按照1∶2～1∶3的比例进行传代。一部分类器官加入冻存液冻存，于液氮中长期保存。复苏时冻存管用37 ℃水浴，溶解后快速转移至15 mL离心管，添加5 mL类器官培养基，用移液管轻轻吹打3次，400×g离心4 min，弃去上清液，再次重悬后接种至超低吸附板进行类器官培养。
1.2.4 类器官包埋切片
通过离心将悬浮培养的类器官分离出来，浸入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后用梯度（50%、70%、80%、95%、100%×2，每梯度30 min）乙醇脱水；放入二甲苯乙醇对半溶液中30 min，再转入纯二甲苯中浸渍2次，每次1 h。类器官进行琼脂包埋，切成厚度约为5 μm的薄片，粘于玻片并干燥，备用。
1.2.5 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色
将固定原发胃癌组织与类器官石蜡切片的载玻片分别放在染色架上，二甲苯清除样品中的石蜡，每次2 min，重复3次；将载玻片置入100%乙醇中处理2 min，重复3次；接着转移到95%的乙醇中处理2 min；转移到70%乙醇中处理2 min；在室温下，用自来水冲洗载玻片至少2 min。将样品在苏木精溶液中染色3 min。将载玻片置于室温下的自来水冲洗至少5 min。将样品在伊红溶液中染色2 min。将载玻片用95%的乙醇浸泡约20次。转移到95%的乙醇中处理2 min。转移到100%的乙醇中处理2 min，重复2次。将载玻片置入二甲苯中处理2 min，重复3次。在载玻片的组织上滴1滴中性树胶，然后盖玻片封片；最后显微镜镜检，进行图像采集分析。
1.2.6 免疫组织化学染色
将原发胃癌组织与类器官分别在4%多聚甲醛溶液中室温下固定30 min，石蜡包埋。切片后按照标准流程对CK-LMW、p53和Ki67进行免疫组织化学染色。最后用BX51荧光显微镜（Olympus）进行图像采集分析。
2 结果
最终1例成功构建了胃癌类器官，建立的类器官经冻存、复苏后依旧活性良好。倒置显微镜下观察，类器官初始时（培养至第5天时）呈球形结构（图1a），随着时间的延长，至第10天时见类器官逐渐呈短棒状结构（图1b），至第15天时出现分枝样改变（图1c），至第20天时形成不规则的腺管样结构（图1d）。光镜下观察，建立的胃癌类器官呈团块状或者不规则腺体样，腺体结构复杂，可见腺腔样结构、细胞核有异型性、染色质浓聚的腺癌特征（图1e），与原发胃癌的组织病理学特征高度一致（图1f）。显微镜下观察，在胃癌类器官及原发胃癌组织中CK-LMW（图1g、1h）、p53 （图1i、1j）蛋白表达均呈阳性，Ki67均呈高比例（阳性率约为70%）表达（图1k、1l）。以上胃癌类器官和原发胃癌组织的形态学和免疫组织化学染色分析结果提示，本研究成功构建了胃癌类器官。
图1
示胃癌类器官的结果
a～d：分别为培养至第5 （a）、10 （b）、15 （c） 和20 （d） 天时的胃癌类器官；e、f：分别为胃癌类器官和原发胃癌组织的HE染色结果，f 图中黄箭所示为原发性胃癌组织的腺腔样结构；g～l：分别为类器官和原发胃癌组织中CK-LMN （g、h）、p53 （i、j） 及Ki67（k、l） 的阳性表达结果
3 讨论
尽管二维肿瘤细胞系为药物筛选等提供了重要的数据，但它们存在的基因变化导致了在临床试验中的高失败率[11]。肿瘤类器官是一种全新的肿瘤模型，它保留了原发肿瘤的大部分遗传和组织学特征，是肿瘤机制研究、药物研发等的优良模型[8, 12]。目前类器官的培养，绝大部分是通过将细胞接种于基质胶Matrigel进行构建[13]。随着对细胞外基质的深入了解，Matrigel的使用受到越来越多地质疑，如它来自于肿瘤组织，其生物安全性值得关注；基质胶复杂且不明确，批次间变异率高；其高成本也限制了它的广泛应用[14-17]。本研究采用悬浮培养，使用的是普通完全培养基，未使用文献[12-13]中推荐的无血清培养基+高浓度各种生长因子的方案，成功建立了胃癌类器官。悬浮培养法的优势在于：本方法在后续类器官的收集、传代、冻存等实验中处理起来更简单、方便；培养过程中未使用Matrigel，可以减少鼠源成分与人源肿瘤间的相互作用带来的影响，还可以较大幅度地降低类器官培养成本[18-19]。本研究团队的体会是：在原代细胞获取方面，结合文献及既往的细胞系培养经验，建议在酶消化过程中要勤于观察组织消化情况并做好及时终止消化，最理想的状态是肿瘤组织被消化成亚腺管或者小细胞团样结构而不是被消化成单细胞，这样可以极大地提高细胞系或者类器官的培养成功率；另外一点体会是，在肿瘤类器官的培养过程中，细胞的自身特性最为重要，即使在简化培养体系下，肿瘤类器官仍能保留原发肿瘤的病理及分子特征，能够满足后续药物筛选、功能验证等实验应用的需求。
目前总体来说，胃癌类器官培养的成功率相对偏低，50%的胃癌类器官培养成功率已是较高的水平[10, 12]。本研究中的胃癌类器官的培养成功率为1/3，这可能与本研究样本量较少有关，有必要进一步扩大样本量进行验证。此外，笔者团队将进一步优化胃癌类器官悬浮培养体系，以期提高胃癌类器官的培养成功率，为胃癌基础研究、新药研发和高通量测序分析提供理想的体外模型。
重要声明
利益冲突声明：所有作者声明无利益冲突。
作者贡献声明：骆伟、苏圆辉、于澄、柴长鹏、唐欢及苗龙进行实验操作及论文撰写；徐浩、骆伟及柴长鹏经费支持；王正峰和徐浩指导研究及修改论文。
伦理声明：本研究通过了兰州大学第一医院医学伦理委员会的批准（批文编号：LDYYLL2022-292）。
虽然胃癌发病率自20世纪中期以来开始下降[1]，但它仍是造成全球癌症相关死亡的第三大原因[2-3]。由于胃癌患者的临床症状出现较晚，大部分患者就诊时已处于疾病中晚期，所以胃癌患者的治疗效果仍欠佳[4]。因此，对胃癌的发病机制和防治方法进行深入研究意义重大。近年来研究较热的类器官是通过原代组织的成体干细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞在富含层粘连蛋白的细胞外基质中自组装而形成[5-6]，它与原代组织在生理结构和功能上相似，是肿瘤研究的良好模型。早在2018年始已有4个团队[7-10]报道了胃类器官的建立及应用研究，在这些研究中均是利用基质胶Matrigel进行类器官的培养，其实验费用相对较高。本研究采用悬浮法建立胃癌类器官，探讨其可行性，为胃癌类器官的培养探索一种实用且较经济的实验方法。
1 资料与方法
1.1 组织来源
本研究仅是初步验证悬浮培养构建胃癌类器官的可行性，因此仅选取2021年7–12月期间于兰州大学第一医院行手术治疗的3例胃癌患者的组织标本。患者术前均未接受肿瘤放化疗，经术后组织病理学检查确认。本研究获得了兰州大学第一医院医学伦理委员会的批准通过（批文编号：LDYYLL2022-292），并且也获得了3例患者授权委托人的知情同意。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂和仪器
12孔培养板购自无锡耐思生物科技有限公司（货号：71201B01）。DMEM/F12培养基、胎牛血清及Trypsin（胰蛋白酶）均购自以色列BI公司。细胞培养添加剂Glutamax（货号：35050061）和组织分散酶Dispase Ⅱ（货号：17105041）均购自美国Invitrogen公司；胶原酶Ⅱ（货号：17101015）购自美国Gibco公司；无血清快速细胞冻存液M5 HiPure（货号：MF699-01）购自北京聚合美生物科技有限公司；抗体低分子量细胞角蛋白（low molecular weight cytokeratin，CK-LMW，货号：MAB-0051）、p53（货号：MAB-0674）及Ki67（货号： MAB-0672）均购自福州迈新生物技术开发有限公司。倒置显微镜购自日本Nikon公司，石蜡切片机购自德国Laica公司。
1.2.2 类器官的建立
严格采取无菌操作原则。根据肿瘤大小切取适量新鲜肿瘤组织后置于运输液中保存，在最短时间内转运至实验室。将癌组织标本放入60 mm培养皿内，用磷酸盐缓冲液冲洗，去除血块、坏死组织及纤维成分。然后用无菌手术刀片切取清理干净的部分组织，冻存于–80 ℃冰箱中，备后续实验用；将剩余肿瘤组织尽可能切碎，然后加入至10 mL混合消化酶的离心管中消化，于37 ℃下摇床中消化20～60 min。期间不时观察组织块消化情况，待组织体积减少至一半时，将消化液用100目细胞筛过滤后收集至15 mL离心管内，400×g离心4 min，弃去上清液。重复2次。收集细胞沉淀，用类器官完全培养液重悬肿瘤细胞。然后按每孔200个小细胞团将细胞悬液直接接种至12孔超低吸附板进行类器官的培养。类器官培养基成分为DMEM/F12培养基中加入1×Glutamax、10%胎牛血清和1%青-链霉素。
1.2.3 类器官的传代、冻存和复苏
当胃癌类器官直径达到100 μm时进行传代。将类器官悬液移至15 mL离心管中，加入适量磷酸盐缓冲液，用枪头轻柔吹打混匀，400×g离心4 min，弃去上清液。向沉淀中加入约2 mL的0.25%胰蛋白酶，轻柔吹打，分散团块，37 ℃环境消化，同时保持镜下观察，直至类器官酶解至3～5个细胞的小细胞团状态。终止消化时向细胞团块加入5 mL完全培养基，枪头轻柔吹打混匀，400×g离心4 min，弃去上清液。按照1∶2～1∶3的比例进行传代。一部分类器官加入冻存液冻存，于液氮中长期保存。复苏时冻存管用37 ℃水浴，溶解后快速转移至15 mL离心管，添加5 mL类器官培养基，用移液管轻轻吹打3次，400×g离心4 min，弃去上清液，再次重悬后接种至超低吸附板进行类器官培养。
1.2.4 类器官包埋切片
通过离心将悬浮培养的类器官分离出来，浸入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后用梯度（50%、70%、80%、95%、100%×2，每梯度30 min）乙醇脱水；放入二甲苯乙醇对半溶液中30 min，再转入纯二甲苯中浸渍2次，每次1 h。类器官进行琼脂包埋，切成厚度约为5 μm的薄片，粘于玻片并干燥，备用。
1.2.5 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色
将固定原发胃癌组织与类器官石蜡切片的载玻片分别放在染色架上，二甲苯清除样品中的石蜡，每次2 min，重复3次；将载玻片置入100%乙醇中处理2 min，重复3次；接着转移到95%的乙醇中处理2 min；转移到70%乙醇中处理2 min；在室温下，用自来水冲洗载玻片至少2 min。将样品在苏木精溶液中染色3 min。将载玻片置于室温下的自来水冲洗至少5 min。将样品在伊红溶液中染色2 min。将载玻片用95%的乙醇浸泡约20次。转移到95%的乙醇中处理2 min。转移到100%的乙醇中处理2 min，重复2次。将载玻片置入二甲苯中处理2 min，重复3次。在载玻片的组织上滴1滴中性树胶，然后盖玻片封片；最后显微镜镜检，进行图像采集分析。
1.2.6 免疫组织化学染色
将原发胃癌组织与类器官分别在4%多聚甲醛溶液中室温下固定30 min，石蜡包埋。切片后按照标准流程对CK-LMW、p53和Ki67进行免疫组织化学染色。最后用BX51荧光显微镜（Olympus）进行图像采集分析。
2 结果
最终1例成功构建了胃癌类器官，建立的类器官经冻存、复苏后依旧活性良好。倒置显微镜下观察，类器官初始时（培养至第5天时）呈球形结构（图1a），随着时间的延长，至第10天时见类器官逐渐呈短棒状结构（图1b），至第15天时出现分枝样改变（图1c），至第20天时形成不规则的腺管样结构（图1d）。光镜下观察，建立的胃癌类器官呈团块状或者不规则腺体样，腺体结构复杂，可见腺腔样结构、细胞核有异型性、染色质浓聚的腺癌特征（图1e），与原发胃癌的组织病理学特征高度一致（图1f）。显微镜下观察，在胃癌类器官及原发胃癌组织中CK-LMW（图1g、1h）、p53 （图1i、1j）蛋白表达均呈阳性，Ki67均呈高比例（阳性率约为70%）表达（图1k、1l）。以上胃癌类器官和原发胃癌组织的形态学和免疫组织化学染色分析结果提示，本研究成功构建了胃癌类器官。
图1
示胃癌类器官的结果
a～d：分别为培养至第5 （a）、10 （b）、15 （c） 和20 （d） 天时的胃癌类器官；e、f：分别为胃癌类器官和原发胃癌组织的HE染色结果，f 图中黄箭所示为原发性胃癌组织的腺腔样结构；g～l：分别为类器官和原发胃癌组织中CK-LMN （g、h）、p53 （i、j） 及Ki67（k、l） 的阳性表达结果
3 讨论
尽管二维肿瘤细胞系为药物筛选等提供了重要的数据，但它们存在的基因变化导致了在临床试验中的高失败率[11]。肿瘤类器官是一种全新的肿瘤模型，它保留了原发肿瘤的大部分遗传和组织学特征，是肿瘤机制研究、药物研发等的优良模型[8, 12]。目前类器官的培养，绝大部分是通过将细胞接种于基质胶Matrigel进行构建[13]。随着对细胞外基质的深入了解，Matrigel的使用受到越来越多地质疑，如它来自于肿瘤组织，其生物安全性值得关注；基质胶复杂且不明确，批次间变异率高；其高成本也限制了它的广泛应用[14-17]。本研究采用悬浮培养，使用的是普通完全培养基，未使用文献[12-13]中推荐的无血清培养基+高浓度各种生长因子的方案，成功建立了胃癌类器官。悬浮培养法的优势在于：本方法在后续类器官的收集、传代、冻存等实验中处理起来更简单、方便；培养过程中未使用Matrigel，可以减少鼠源成分与人源肿瘤间的相互作用带来的影响，还可以较大幅度地降低类器官培养成本[18-19]。本研究团队的体会是：在原代细胞获取方面，结合文献及既往的细胞系培养经验，建议在酶消化过程中要勤于观察组织消化情况并做好及时终止消化，最理想的状态是肿瘤组织被消化成亚腺管或者小细胞团样结构而不是被消化成单细胞，这样可以极大地提高细胞系或者类器官的培养成功率；另外一点体会是，在肿瘤类器官的培养过程中，细胞的自身特性最为重要，即使在简化培养体系下，肿瘤类器官仍能保留原发肿瘤的病理及分子特征，能够满足后续药物筛选、功能验证等实验应用的需求。
目前总体来说，胃癌类器官培养的成功率相对偏低，50%的胃癌类器官培养成功率已是较高的水平[10, 12]。本研究中的胃癌类器官的培养成功率为1/3，这可能与本研究样本量较少有关，有必要进一步扩大样本量进行验证。此外，笔者团队将进一步优化胃癌类器官悬浮培养体系，以期提高胃癌类器官的培养成功率，为胃癌基础研究、新药研发和高通量测序分析提供理想的体外模型。
重要声明
利益冲突声明：所有作者声明无利益冲突。
作者贡献声明：骆伟、苏圆辉、于澄、柴长鹏、唐欢及苗龙进行实验操作及论文撰写；徐浩、骆伟及柴长鹏经费支持；王正峰和徐浩指导研究及修改论文。
伦理声明：本研究通过了兰州大学第一医院医学伦理委员会的批准（批文编号：LDYYLL2022-292）。
