引用本文： 彭磊, 朱克祥. 类器官模型在胰腺癌中的研究进展. 中国普外基础与临床杂志, 2023, 30(7): 863-869. doi: 10.7507/1007-9424.202302021 复制
胰腺癌是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，具有早期诊断困难、恶性程度高、侵袭性强、缺乏有效治疗方法等特点[1]。尽管近年来胰腺癌治疗，特别是免疫治疗和辅助化学药物治疗（简称“化疗” ）已取得了较大进展，但胰腺癌患者的5年生存率仍然只有10%左右[2]。2017年的统计数据[3]显示，胰腺癌是美国第3大癌症死亡原因；预计到2030年胰腺癌将成为继肺癌之后的第2大癌症死亡原因[4]。2022年我国估计新发胰腺癌病例数约为75 178例（约占中国癌症病例数的2.9%），死亡病例数约为72 680例（占中国癌症死亡病例数的3.8%）[5]。因此，亟需可用于临床研究的患者模型和用于早期诊断的生物标志物，以寻求对患者最有效的治疗方法和治疗药物。
近年来，类器官（organoid）技术已成为一种强大的体外工具，可用于重建胰腺癌的发病和进展的复杂病理生理学模型，有望成为发现胰腺癌生物标志物、测试药物敏感性及制定个体化胰腺癌治疗方案的新型平台[6-9]。胰腺癌类器官实质上就是生长在培养皿中的微小器官，保留了患者原发肿瘤细胞的生理特性和机能，应用此技术可以直接使用患者来源的组织发现潜在的生物标志物和进行个体化药物筛选、药物敏感性测试，以用于胰腺癌的早期诊断和个体化治疗，从而延长患者的生存时间和提高生存质量[10-11]。为此，现就胰腺癌类器官模型的构建并用于潜在生物标志物的发现，以及个体化药物筛选和药物敏感性测试中的研究现状及其潜在的临床前景进行综述。
1 胰腺癌类器官模型的构建
胰腺癌类器官模型的构建可以通过手术切除的癌组织、细针穿刺抽吸活检（fine-needle aspiration，FNA）获得的癌组织或者人多能干细胞（human pluripotent stem cell，hPSC）衍生的上皮细胞构建，其原理类似于发育生物学研究中的器官培养，其出现使局限性、晚期和转移性患者的研究成为可能。胰腺癌类器官模型的构建过程一般包括机械和化学消化、洗涤、培养、传代等步骤。与二维培养的细胞系相比，类器官模型可以更为有效地建立细胞系，并与患者原发肿瘤细胞的异质性保持一致[12]。
1.1 利用手术切除组织构建胰腺癌类器官
在利用手术切除胰腺癌组织构建胰腺癌类器官的初步研究[13]中，Clevers和Tuveson实验室的类器官培养成功率分别为75%和83%。在近来的一项利用手术切除胰腺癌组织构建类器官模型的研究[14]中发现，胰腺癌类器官在优化的无血清培养基中的培养成功率超过90%。Watanabe等[15]使用手术切除胰腺癌标本构建胰腺癌类器官的培养成功率为42%（8/19），并对成功构建的8个胰腺癌类器官的基因组区域进行了测序，这8个胰腺癌类器官涵盖了50个癌症相关基因的突变热点，显示了胰腺癌中KRAS、TP53、SMAD4和CDKN2A基因的典型突变[16]。
手术切除来源组织构建的类器官的优点：从患者标本中建立，表明了起源组织的特征如基因组和转录组特征，而且还可以维持原发肿瘤的表型反应。这种类器官移植到免疫缺陷小鼠体内，可以形成类似于原始肿瘤的异种移植瘤，并且可以在移植前进行修饰，如通过基因扰动、基因过表达基因修饰或荧光蛋白标记[17]。
手术切除来源组织构建的类器官也有不足：这种操作方式涉及肿瘤组织的机械或酶消化，并且通常源自单细胞类型（肿瘤细胞），缺乏特征性的肿瘤纤维化间质以及肿瘤相关成纤维细胞和血管，这是一个关键的药物传递障碍[18]，因此其预测临床治疗反应的能力有待提高；其次是正常（非肿瘤）细胞污染的风险，由于胰腺癌通常表现为弥漫性肿瘤，在利用手术切除组织构建胰腺癌类器官时，正常细胞的污染是一个较为突出的问题[19]，因此含有更高百分比的（肿瘤）上皮细胞的手术切除组织有更高的机会形成有效的类器官生长[20]；此外，组织的储存也会影响成功率，获得的组织材料应尽快储存在培养基中，并保持在4 ℃直至处理，以增加类器官生长的机会和频率[21]，这样才能更好地构建有效的类器官模型并用于临床研究，然而事实上，由于手术困难，肿瘤取样和组织提取之间的时间间隔为0.5～2 h，以及目前没有标准的培养基组成，导致手术切除胰腺癌组织构建胰腺癌类器官的成功率在不同实验室的结果不尽相同。
1.2 FNA获得的癌组织构建的胰腺癌类器官
近年来，使用FNA获得的癌组织构建胰腺癌类器官作为一种新型的类器官构建方法，可以在较短的时间范围内（甚至在治疗之前）对胰腺癌患者进行分子表征的研究。通过FNA的标本，构建胰腺癌类器官模型具有较高的成功率，尤其是在活检组织非常有限的胰腺癌患者中进行早期诊断和药物敏感性测试方面具有巨大的潜力，未来有望利用这一技术在胰腺癌个体化治疗过程中提供帮助。
在一项通过FNA获得的癌组织构建初级胰腺癌类器官培养的研究[22]结果显示，初始成功率为87%，随后由于各种未知原因的损耗，导致最终超过5次传代的胰腺癌类器官成功率为66%。这是一项相当重要的研究，在此之前胰腺癌类器官主要是从包含更多细胞的手术切除标本中构建的。在 Seppälä等[23]的一项研究中，手术切除样本的初始培养成功率只有77%，而FNA 样本成功率为78%。Dantes 团队[24]在利用超声内镜引导下FNA获取的癌组织构建胰腺癌类器官的过程中，为了提高成功率进行了额外的一次穿刺（该研究所有患者均根据慕尼黑工业大学IRB项目编号207/15和1946/07以及德累斯顿EK451122014招募、登记并签署知情同意书；所有动物实验和护理均按照机构委员会的指导方针进行，并经当地权威机构Regierung von Oberbayern批准，项目编号55.2-1-54-2532.0-54-2016。 ），以便在活检后30 min内开始处理癌组织，构建的胰腺癌类器官可传代超过5次，并经受至少1个冻融周期。
相比于手术切除组织构建类器官，FNA获得的癌组织构建的胰腺癌类器官具有以下优势：① 可以直接利用从床旁的患者或从获得的肿瘤组织（包括小至2 mm3的活检组织）分离培养肿瘤类器官，同时保留用于诊断的生长结构[25]。② 该技术可与超声结合或在计算机断层扫描引导下进行，从而精确地靶向病变部位，最大程度减少患者不适感[26]。③ 此种方法无需经过组织消化或细胞簇的胰蛋白酶消化，因此能够保留肿瘤组织的重要三维架构和细胞的高活力[27]。④ FNA可以产生完整的上皮细胞聚集体且避免了非肿瘤细胞的污染。
利用FNA获得的癌组织构建胰腺癌类器官也有不足：用于构建类器官的额外穿刺可能会增加不良事件的风险，包括出血和肿瘤播散，如Yane等[28]报道了3.4%的病例发生肿瘤播散，因此应减少穿刺次数，尤其是在可切除的胰腺癌患者中；此外，如果使用等分的组织样本来构建类器官，则可能会减少剩余样本的数量而对病理和基因诊断产生负面影响[29]。
1.3 hPSC构建胰腺癌类器官
hPSC具有持续的自我更新能力和高分化能力，因此可转化为几乎每个成人人体组织的各种细胞类型。利用源自hPSC的类器官，能够研究胰腺发育和胰腺癌类器官发病的过程和机制[30]。
与患者衍生的类器官相比，基于hPSC构建的胰腺癌类器官具有独特的优势：① 及时无限制地获取生物样本，即使是在单细胞水平上也能成功构建[31]；② 可由研究者制造特定的遗传环境；③ 使用hPSC具有通过体细胞制造、非侵入性收集的能力等优势[32]；④ 形态学上，患者来源的胰腺癌类器官只包含一个上皮层，没有间充质成分，而hPSC衍生的胰腺癌类器官包含多个上皮层和间充质，这有助于后续研究，因为不同细胞之间会发生一种称为串扰的现象，也就是不同细胞之间的通信；由于hPSC衍生的胰腺癌类器官具有基质间室，因此可以观察和调节细胞内的交叉信号，以发现胰腺癌发生的一些潜在机制和（或）更好地使用癌症靶向治疗（如化疗）[33]；⑤ 近年来使用hPSC衍生的胰腺癌类器官来研究肿瘤微环境，因为它具有显示上皮-间充质相互作用的能力，通过改变胰腺癌类器官的微环境，可以研究触发特定的基因突变以及治疗反应的潜在变化[34-35]。⑥ 未来，可以通过hPSC衍生的胰腺癌类器官研究特定基因突变对胰腺癌肿瘤微环境的影响。⑦ 利用最先进的基因编辑和体细胞重编程技术，可以直接提供具有可诱导癌基因和（或）敲除肿瘤抑制基因的hPSC，从而揭示细胞类型特异性模式以响应特定人类环境中的致癌压力，有助于验证胰腺癌类器官的发病机制[36-37]。
与患者来源的胰腺癌类器官相比，hPSC衍生的胰腺癌类器官的不足：需要更长的时间才能成熟，患者组织来源的上皮胰腺癌类器官可以在不到2周的时间内快速生成，而hPSC来源的胰腺癌类器官需要4～5周才能建立；此外，hPSC衍生的胰腺癌类器官的成熟过程更复杂，培养过程需要更加频繁地关注[38]。
2 胰腺癌类器官模型用于生物标志物的筛选
由于缺乏早期诊断的生物学标志物及早期症状不明显，大部分胰腺癌患者到了疾病晚期才被检查出来，使得胰腺癌患者手术切除率低于20%，这也是导致胰腺癌5年生存率一直无法得到明显提高的重要原因之一[39]。胰腺癌类器官保留了原发肿瘤的组织学、结构异质性等特点，可以利用胰腺癌类器官来进行胰腺癌生物学标志物的筛选。目前研究较多的胰腺癌生物学标志物主要有细胞外囊泡中的微小RNA（microRNA，miRNA）、glypican-1（GPC1）、膜联蛋白A6（annexin A6，ANXA6）以及蛋白质生物学标志物细胞角蛋白（cytokeratin，CK）7、CK20、细胞肿瘤抗原p53、Claudin-4、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等。
2.1 胰腺癌类器官与细胞外囊泡
细胞外囊泡是具有生物活性分子的膜包围结构，它们能将某些生物活性分子如miRNA、蛋白质、脂质以分泌物形式转移到靶细胞；可以通过基质细胞增加生长因子、细胞因子和血管生成因子的分泌[40]；此外，肿瘤衍生的细胞外囊泡会诱导上皮-间充质转化，降解基质，并上调内皮细胞黏附因子。这些效应可以直接或间接影响免疫细胞，通过激活巨噬细胞干扰内皮细胞，从而支持癌细胞的扩散和增殖，以进行微转移[41]。因此，细胞外囊泡被认为是癌诊断和预后的有价值的生物学标志物，可作为肿瘤治疗方法的靶标[42]。
三维类器官技术维持了体内组织的细胞和遗传异质性，并已被证明是迄今为止人类癌症的最佳离体模型[43]。类器官能够将细胞外囊泡释放到其周围的基质中，而这些囊泡是功能性的，它们经常负载有生物活性分子。例如，由胰腺癌衍生的类器官分泌的细胞外囊泡可以激活p38丝裂原活化蛋白激酶并控制肌管中F-box蛋白32和N-端规则泛素E3连接酶UBR2的表达[44]。一项关于直肠癌类器官的研究[45]显示，直肠癌患者衍生的类器官的培养上清液中可以检测到肿瘤衍生的携带蛋白质和miRNA的细胞外囊泡，并随着Apc突变和胶原蛋白沉积而观察到细胞外囊泡释放的增加，提示Apc突变是直肠癌起始和进展中的关键因素。此外，有研究[46]显示，由hPSC衍生的三维视网膜类器官释放的细胞外囊泡包含许多小的非编码RNA，包括miRNA、转运RNA和Piwi蛋白相互作用的RNA，可作为翻译后修饰的新调节剂和视网膜发育和疾病的生物标志物。Zeöld等[47]团队在比较源自不同胰腺癌患者胰腺癌类器官的细胞外囊泡时，发现只有一小部分miRNA重叠，表示不同胰腺癌患者之间的个体差异很大，而且所有类器官中常见的细胞外囊泡miRNA也存在于胰腺癌患者来源的血液细胞外囊泡中，与对照组相比，在胰腺癌患者血浆细胞外囊泡样品中miRNA-21和miRNA-195表达量更高，并且在胰腺癌类器官中显示了与循环细胞外囊泡的miRNA生物活性因子之间的重叠现象。
目前正在研究用于诊断目的的细胞外囊泡相关胰腺癌生物学标志物，包括表面标志物如GPC1[48]和ANXA6[49]，以及细胞外囊泡携带突变的遗传物质如突变体Kras+ DNA[50]和miRNA[51]。用细胞外囊泡进行胰腺癌筛查，将显著提高早期检出胰腺癌的敏感度和特异度。
2.2 胰腺癌类器官和人源化异种移植（patient-derived xenografts，PDX）与相应的原发性肿瘤具有相同蛋白质表达特征
Romero-Calvo等[30]使用免疫组织化学标志确定了胰腺癌类器官和PDX的相关蛋白质表达谱，选择CK7和CK20以及细胞肿瘤抗原p53、Claudin-4和CA19-9来评估胰腺上皮分化，因为它们在肿瘤性胰腺导管上皮中频繁表达[52-53]。将这些蛋白质表达模式与正常胰腺组织和胰腺癌组织进行比较，与现有的研究结果一致，CK7和CK20的蛋白质表达谱在胰腺癌类器官中得以维持[54]；正常胰腺上皮显示出低水平的p53表达，而在原发性肿瘤和相应的PDX和胰腺癌类器官模型中p53表达升高[55]；常在胰腺癌中过表达的Claudin-4在PDX和胰腺癌类器官模型中均升高[56]；所有研究的原发性肿瘤均表达CA19-9，并且PDX和胰腺癌类器官模型的CA19-9也呈阳性[57]。
为了研究PDX和类器官模型是否保留了其相应肿瘤的基因组和转录组特征，Romero-Calvo等[58]研究团队从原发肿瘤、外周血、PDX、类器官和二维细胞系中提取了7例患者的DNA，并对由已知的癌症相关基因组成的1 213个基因组进行了靶向测序，与先前的报道[59-60]一致，所有患者的原发性肿瘤均具有Kras和TP53突变，并在PDX、类器官和二维细胞系中复制。此外，个别患者的特异性突变如CDKN2A、NALCN、ZBTB16和PARP1也存在于相应的肿瘤模型中。为了进一步研究RNA表达谱，对肿瘤、PDX和二维细胞系RNAseq数据进行了途径分析，发现癌症相关的基因表达途径包括p53信号传导和细胞周期调控，在所有样本类型中都有类似的上调或下调，值得注意的是，上调的p53信号与观察到的TP53蛋白水平的增加一致；然后通过比较肿瘤、二维细胞系、类器官和PDX的维恩图显示，大多数差异表达的基因（1 815个基因）在3个模型和肿瘤样品之间重叠[30]。
总之，用于胰腺癌分析的常用蛋白质生物标志物在胰腺癌类器官和PDX模型与原发性肿瘤之间的表达具有较强的一致性。
3 胰腺癌个体化药物筛选和敏感性测试
近年来，得益于新辅助治疗和辅助治疗在内的综合治疗手段的应用，胰腺癌的5年生存率从5%提高到了10%左右[2]。有证据[61]表明，有效的化疗可使胰腺癌长期存活患者增加1倍。但在多数情况下，不符合手术条件的患者仍主要接受标准化的“一刀切”的非个体化、非特异性的综合化疗，化学药物的选择笼统而没有个体化。胰腺癌类器官可反映原发肿瘤的体内特性，并可在体外进行任意化学药物的测试，可针对不同胰腺癌患者特征制定个体化治疗方案，有望从根本上改善患者的预后[62]。
3.1 胰腺癌类器官模型预测药物反应及药物筛选
目前，治疗胰腺癌的有效手段主要依赖于原发肿瘤的完全手术切除和有效的全身化疗的使用，选择合适的化疗药物对于患者预后极其重要。在一项前瞻性研究[63]中，从16例胰腺癌患者中生成了胰腺癌类器官，并通过使用标准化疗药物进行系统药物筛选，对于从未接受过治疗患者的预测药物反应准确率为90%，对于接受过治疗的患者预测药物反应准确率为80%。胰腺癌类器官预测药物反应和药物筛选对患者的预后有明显影响，如纳米白蛋白结合型紫杉醇/吉西他滨或FOLFIRINOX（亚叶酸、氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂）治疗晚期胰腺癌患者。然而当使用胰腺癌类器官预测结果作为临床支持时必须考虑诸如实际患者需要立即治疗时，类器官相对较长的培养时间或在药物分型过程中获得亲本肿瘤的耐药性等限制。近年来，随着3D打印以芯片格式生成微流体系统技术的进步，实现了大规模标准化药物筛选，并在多个胰腺癌类器官线上并行自动读出[64]。由此可见，胰腺癌类器官可为临床预测药物反应和药物筛选提供指导。
3.2 利用胰腺癌类器官模型进行药物敏感性测试
类器官作为个体化的临床前模型，可以对每例患者进行药物敏感性测试，准确反映每个患者对于不同化疗药物的敏感性。Romero-Calvo等[30]将胰腺癌一线化疗药物吉西他滨用于2例不同胰腺癌患者的类器官，结果显示，2例患者之间存在明显的药物敏感性差异；进一步将联合化疗FOLFIRINOX方案及吉西他滨联合白蛋白紫杉醇方案分别用于同一患者的类器官及PDX，结果显示，肿瘤在体内与体外表现出的药物敏感性一致，并与患者临床实际情况相符合。有研究[65]在12例胰腺癌患者的类器官中测试了对吉西他滨、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康的活性代谢物SN-38、紫杉醇和其他药物的敏感性，在此基础上计算了49个剂量-反应曲线下的独立面积并标准化，通过在每个胰腺癌类器官上测试的每种药物的独立受试者操作特征曲线下面积评估进行比较，为每例患者制定出个体化治疗的排名，结果发现，胰腺癌患者的临床结果与胰腺癌类器官药物敏感性数据之间有高度相关性，强烈表明胰腺癌类器官模型中的药物敏感性具有预测临床反应的能力。Huang等[66]团队在5例胰腺癌患者的类器官中进行表观遗传调控因子组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂UNC1999的敏感性试验，结果显示，在5例胰腺癌患者的类器官中，有3例对UNC1999敏感，并且对应的原肿瘤组织中呈组蛋白H3乙酰化赖氨酸27三甲基化阳性，而不敏感的2例均为组蛋白H3乙酰化赖氨酸27三甲基化阴性，结果提示，类器官模型能够维持原肿瘤组织的特性，可以进行表观遗传学小分子化合物的筛选。
从类器官模型能够维持原肿瘤组织特性的研究结果及胰腺癌类器官药物敏感性数据与胰腺癌患者的临床结果之间存在高度相关性的结果提示，未来可参照胰腺癌类器官药物敏感性的数据，以避免无效化疗，以提高治疗应答率和减轻化疗毒性，也可用胰腺癌类器官模型中化疗的受试者操作特征曲线下面积合理选择胰腺癌患者的个体化治疗方案，延长患者生存时间和提高患者生存质量。
4 总结与展望
胰腺癌类器官为胰腺癌患者寻求新的潜在诊断生物标志物成为可能。胰腺癌类器官作为药物敏感性和耐药性检测平台，在胰腺癌的药物治疗研究中具有潜在的价值，可对患者样本进行离体药物测试，可用于临床治疗决策个体化药物选择。尤其随着基因编辑技术的发展，有望将该技术与类器官技术相结合，从而发现控制治疗敏感性的关键分子节点，并探索新的治疗方法或弥补现有治疗方法的缺陷，同时要加强基础研究向临床研究与治疗的转化，通过对原发性肿瘤和（或）转移性肿瘤进行活检，从无法切除的患者身上获取新鲜的肿瘤组织以构建类器官模型或利用基因编辑进行类器官模型重编辑与修饰，再应用于胰腺癌的发病机制研究，从而为胰腺癌患者提供个体化的治疗。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：彭磊负责查阅文献、起草并撰写文章；朱克祥修订论文格式、文章结构及文章重要论点，给予指导性意见并对最终文稿内容进行审阅。
胰腺癌是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，具有早期诊断困难、恶性程度高、侵袭性强、缺乏有效治疗方法等特点[1]。尽管近年来胰腺癌治疗，特别是免疫治疗和辅助化学药物治疗（简称“化疗” ）已取得了较大进展，但胰腺癌患者的5年生存率仍然只有10%左右[2]。2017年的统计数据[3]显示，胰腺癌是美国第3大癌症死亡原因；预计到2030年胰腺癌将成为继肺癌之后的第2大癌症死亡原因[4]。2022年我国估计新发胰腺癌病例数约为75 178例（约占中国癌症病例数的2.9%），死亡病例数约为72 680例（占中国癌症死亡病例数的3.8%）[5]。因此，亟需可用于临床研究的患者模型和用于早期诊断的生物标志物，以寻求对患者最有效的治疗方法和治疗药物。
近年来，类器官（organoid）技术已成为一种强大的体外工具，可用于重建胰腺癌的发病和进展的复杂病理生理学模型，有望成为发现胰腺癌生物标志物、测试药物敏感性及制定个体化胰腺癌治疗方案的新型平台[6-9]。胰腺癌类器官实质上就是生长在培养皿中的微小器官，保留了患者原发肿瘤细胞的生理特性和机能，应用此技术可以直接使用患者来源的组织发现潜在的生物标志物和进行个体化药物筛选、药物敏感性测试，以用于胰腺癌的早期诊断和个体化治疗，从而延长患者的生存时间和提高生存质量[10-11]。为此，现就胰腺癌类器官模型的构建并用于潜在生物标志物的发现，以及个体化药物筛选和药物敏感性测试中的研究现状及其潜在的临床前景进行综述。
1 胰腺癌类器官模型的构建
胰腺癌类器官模型的构建可以通过手术切除的癌组织、细针穿刺抽吸活检（fine-needle aspiration，FNA）获得的癌组织或者人多能干细胞（human pluripotent stem cell，hPSC）衍生的上皮细胞构建，其原理类似于发育生物学研究中的器官培养，其出现使局限性、晚期和转移性患者的研究成为可能。胰腺癌类器官模型的构建过程一般包括机械和化学消化、洗涤、培养、传代等步骤。与二维培养的细胞系相比，类器官模型可以更为有效地建立细胞系，并与患者原发肿瘤细胞的异质性保持一致[12]。
1.1 利用手术切除组织构建胰腺癌类器官
在利用手术切除胰腺癌组织构建胰腺癌类器官的初步研究[13]中，Clevers和Tuveson实验室的类器官培养成功率分别为75%和83%。在近来的一项利用手术切除胰腺癌组织构建类器官模型的研究[14]中发现，胰腺癌类器官在优化的无血清培养基中的培养成功率超过90%。Watanabe等[15]使用手术切除胰腺癌标本构建胰腺癌类器官的培养成功率为42%（8/19），并对成功构建的8个胰腺癌类器官的基因组区域进行了测序，这8个胰腺癌类器官涵盖了50个癌症相关基因的突变热点，显示了胰腺癌中KRAS、TP53、SMAD4和CDKN2A基因的典型突变[16]。
手术切除来源组织构建的类器官的优点：从患者标本中建立，表明了起源组织的特征如基因组和转录组特征，而且还可以维持原发肿瘤的表型反应。这种类器官移植到免疫缺陷小鼠体内，可以形成类似于原始肿瘤的异种移植瘤，并且可以在移植前进行修饰，如通过基因扰动、基因过表达基因修饰或荧光蛋白标记[17]。
手术切除来源组织构建的类器官也有不足：这种操作方式涉及肿瘤组织的机械或酶消化，并且通常源自单细胞类型（肿瘤细胞），缺乏特征性的肿瘤纤维化间质以及肿瘤相关成纤维细胞和血管，这是一个关键的药物传递障碍[18]，因此其预测临床治疗反应的能力有待提高；其次是正常（非肿瘤）细胞污染的风险，由于胰腺癌通常表现为弥漫性肿瘤，在利用手术切除组织构建胰腺癌类器官时，正常细胞的污染是一个较为突出的问题[19]，因此含有更高百分比的（肿瘤）上皮细胞的手术切除组织有更高的机会形成有效的类器官生长[20]；此外，组织的储存也会影响成功率，获得的组织材料应尽快储存在培养基中，并保持在4 ℃直至处理，以增加类器官生长的机会和频率[21]，这样才能更好地构建有效的类器官模型并用于临床研究，然而事实上，由于手术困难，肿瘤取样和组织提取之间的时间间隔为0.5～2 h，以及目前没有标准的培养基组成，导致手术切除胰腺癌组织构建胰腺癌类器官的成功率在不同实验室的结果不尽相同。
1.2 FNA获得的癌组织构建的胰腺癌类器官
近年来，使用FNA获得的癌组织构建胰腺癌类器官作为一种新型的类器官构建方法，可以在较短的时间范围内（甚至在治疗之前）对胰腺癌患者进行分子表征的研究。通过FNA的标本，构建胰腺癌类器官模型具有较高的成功率，尤其是在活检组织非常有限的胰腺癌患者中进行早期诊断和药物敏感性测试方面具有巨大的潜力，未来有望利用这一技术在胰腺癌个体化治疗过程中提供帮助。
在一项通过FNA获得的癌组织构建初级胰腺癌类器官培养的研究[22]结果显示，初始成功率为87%，随后由于各种未知原因的损耗，导致最终超过5次传代的胰腺癌类器官成功率为66%。这是一项相当重要的研究，在此之前胰腺癌类器官主要是从包含更多细胞的手术切除标本中构建的。在 Seppälä等[23]的一项研究中，手术切除样本的初始培养成功率只有77%，而FNA 样本成功率为78%。Dantes 团队[24]在利用超声内镜引导下FNA获取的癌组织构建胰腺癌类器官的过程中，为了提高成功率进行了额外的一次穿刺（该研究所有患者均根据慕尼黑工业大学IRB项目编号207/15和1946/07以及德累斯顿EK451122014招募、登记并签署知情同意书；所有动物实验和护理均按照机构委员会的指导方针进行，并经当地权威机构Regierung von Oberbayern批准，项目编号55.2-1-54-2532.0-54-2016。 ），以便在活检后30 min内开始处理癌组织，构建的胰腺癌类器官可传代超过5次，并经受至少1个冻融周期。
相比于手术切除组织构建类器官，FNA获得的癌组织构建的胰腺癌类器官具有以下优势：① 可以直接利用从床旁的患者或从获得的肿瘤组织（包括小至2 mm3的活检组织）分离培养肿瘤类器官，同时保留用于诊断的生长结构[25]。② 该技术可与超声结合或在计算机断层扫描引导下进行，从而精确地靶向病变部位，最大程度减少患者不适感[26]。③ 此种方法无需经过组织消化或细胞簇的胰蛋白酶消化，因此能够保留肿瘤组织的重要三维架构和细胞的高活力[27]。④ FNA可以产生完整的上皮细胞聚集体且避免了非肿瘤细胞的污染。
利用FNA获得的癌组织构建胰腺癌类器官也有不足：用于构建类器官的额外穿刺可能会增加不良事件的风险，包括出血和肿瘤播散，如Yane等[28]报道了3.4%的病例发生肿瘤播散，因此应减少穿刺次数，尤其是在可切除的胰腺癌患者中；此外，如果使用等分的组织样本来构建类器官，则可能会减少剩余样本的数量而对病理和基因诊断产生负面影响[29]。
1.3 hPSC构建胰腺癌类器官
hPSC具有持续的自我更新能力和高分化能力，因此可转化为几乎每个成人人体组织的各种细胞类型。利用源自hPSC的类器官，能够研究胰腺发育和胰腺癌类器官发病的过程和机制[30]。
与患者衍生的类器官相比，基于hPSC构建的胰腺癌类器官具有独特的优势：① 及时无限制地获取生物样本，即使是在单细胞水平上也能成功构建[31]；② 可由研究者制造特定的遗传环境；③ 使用hPSC具有通过体细胞制造、非侵入性收集的能力等优势[32]；④ 形态学上，患者来源的胰腺癌类器官只包含一个上皮层，没有间充质成分，而hPSC衍生的胰腺癌类器官包含多个上皮层和间充质，这有助于后续研究，因为不同细胞之间会发生一种称为串扰的现象，也就是不同细胞之间的通信；由于hPSC衍生的胰腺癌类器官具有基质间室，因此可以观察和调节细胞内的交叉信号，以发现胰腺癌发生的一些潜在机制和（或）更好地使用癌症靶向治疗（如化疗）[33]；⑤ 近年来使用hPSC衍生的胰腺癌类器官来研究肿瘤微环境，因为它具有显示上皮-间充质相互作用的能力，通过改变胰腺癌类器官的微环境，可以研究触发特定的基因突变以及治疗反应的潜在变化[34-35]。⑥ 未来，可以通过hPSC衍生的胰腺癌类器官研究特定基因突变对胰腺癌肿瘤微环境的影响。⑦ 利用最先进的基因编辑和体细胞重编程技术，可以直接提供具有可诱导癌基因和（或）敲除肿瘤抑制基因的hPSC，从而揭示细胞类型特异性模式以响应特定人类环境中的致癌压力，有助于验证胰腺癌类器官的发病机制[36-37]。
与患者来源的胰腺癌类器官相比，hPSC衍生的胰腺癌类器官的不足：需要更长的时间才能成熟，患者组织来源的上皮胰腺癌类器官可以在不到2周的时间内快速生成，而hPSC来源的胰腺癌类器官需要4～5周才能建立；此外，hPSC衍生的胰腺癌类器官的成熟过程更复杂，培养过程需要更加频繁地关注[38]。
2 胰腺癌类器官模型用于生物标志物的筛选
由于缺乏早期诊断的生物学标志物及早期症状不明显，大部分胰腺癌患者到了疾病晚期才被检查出来，使得胰腺癌患者手术切除率低于20%，这也是导致胰腺癌5年生存率一直无法得到明显提高的重要原因之一[39]。胰腺癌类器官保留了原发肿瘤的组织学、结构异质性等特点，可以利用胰腺癌类器官来进行胰腺癌生物学标志物的筛选。目前研究较多的胰腺癌生物学标志物主要有细胞外囊泡中的微小RNA（microRNA，miRNA）、glypican-1（GPC1）、膜联蛋白A6（annexin A6，ANXA6）以及蛋白质生物学标志物细胞角蛋白（cytokeratin，CK）7、CK20、细胞肿瘤抗原p53、Claudin-4、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等。
2.1 胰腺癌类器官与细胞外囊泡
细胞外囊泡是具有生物活性分子的膜包围结构，它们能将某些生物活性分子如miRNA、蛋白质、脂质以分泌物形式转移到靶细胞；可以通过基质细胞增加生长因子、细胞因子和血管生成因子的分泌[40]；此外，肿瘤衍生的细胞外囊泡会诱导上皮-间充质转化，降解基质，并上调内皮细胞黏附因子。这些效应可以直接或间接影响免疫细胞，通过激活巨噬细胞干扰内皮细胞，从而支持癌细胞的扩散和增殖，以进行微转移[41]。因此，细胞外囊泡被认为是癌诊断和预后的有价值的生物学标志物，可作为肿瘤治疗方法的靶标[42]。
三维类器官技术维持了体内组织的细胞和遗传异质性，并已被证明是迄今为止人类癌症的最佳离体模型[43]。类器官能够将细胞外囊泡释放到其周围的基质中，而这些囊泡是功能性的，它们经常负载有生物活性分子。例如，由胰腺癌衍生的类器官分泌的细胞外囊泡可以激活p38丝裂原活化蛋白激酶并控制肌管中F-box蛋白32和N-端规则泛素E3连接酶UBR2的表达[44]。一项关于直肠癌类器官的研究[45]显示，直肠癌患者衍生的类器官的培养上清液中可以检测到肿瘤衍生的携带蛋白质和miRNA的细胞外囊泡，并随着Apc突变和胶原蛋白沉积而观察到细胞外囊泡释放的增加，提示Apc突变是直肠癌起始和进展中的关键因素。此外，有研究[46]显示，由hPSC衍生的三维视网膜类器官释放的细胞外囊泡包含许多小的非编码RNA，包括miRNA、转运RNA和Piwi蛋白相互作用的RNA，可作为翻译后修饰的新调节剂和视网膜发育和疾病的生物标志物。Zeöld等[47]团队在比较源自不同胰腺癌患者胰腺癌类器官的细胞外囊泡时，发现只有一小部分miRNA重叠，表示不同胰腺癌患者之间的个体差异很大，而且所有类器官中常见的细胞外囊泡miRNA也存在于胰腺癌患者来源的血液细胞外囊泡中，与对照组相比，在胰腺癌患者血浆细胞外囊泡样品中miRNA-21和miRNA-195表达量更高，并且在胰腺癌类器官中显示了与循环细胞外囊泡的miRNA生物活性因子之间的重叠现象。
目前正在研究用于诊断目的的细胞外囊泡相关胰腺癌生物学标志物，包括表面标志物如GPC1[48]和ANXA6[49]，以及细胞外囊泡携带突变的遗传物质如突变体Kras+ DNA[50]和miRNA[51]。用细胞外囊泡进行胰腺癌筛查，将显著提高早期检出胰腺癌的敏感度和特异度。
2.2 胰腺癌类器官和人源化异种移植（patient-derived xenografts，PDX）与相应的原发性肿瘤具有相同蛋白质表达特征
Romero-Calvo等[30]使用免疫组织化学标志确定了胰腺癌类器官和PDX的相关蛋白质表达谱，选择CK7和CK20以及细胞肿瘤抗原p53、Claudin-4和CA19-9来评估胰腺上皮分化，因为它们在肿瘤性胰腺导管上皮中频繁表达[52-53]。将这些蛋白质表达模式与正常胰腺组织和胰腺癌组织进行比较，与现有的研究结果一致，CK7和CK20的蛋白质表达谱在胰腺癌类器官中得以维持[54]；正常胰腺上皮显示出低水平的p53表达，而在原发性肿瘤和相应的PDX和胰腺癌类器官模型中p53表达升高[55]；常在胰腺癌中过表达的Claudin-4在PDX和胰腺癌类器官模型中均升高[56]；所有研究的原发性肿瘤均表达CA19-9，并且PDX和胰腺癌类器官模型的CA19-9也呈阳性[57]。
为了研究PDX和类器官模型是否保留了其相应肿瘤的基因组和转录组特征，Romero-Calvo等[58]研究团队从原发肿瘤、外周血、PDX、类器官和二维细胞系中提取了7例患者的DNA，并对由已知的癌症相关基因组成的1 213个基因组进行了靶向测序，与先前的报道[59-60]一致，所有患者的原发性肿瘤均具有Kras和TP53突变，并在PDX、类器官和二维细胞系中复制。此外，个别患者的特异性突变如CDKN2A、NALCN、ZBTB16和PARP1也存在于相应的肿瘤模型中。为了进一步研究RNA表达谱，对肿瘤、PDX和二维细胞系RNAseq数据进行了途径分析，发现癌症相关的基因表达途径包括p53信号传导和细胞周期调控，在所有样本类型中都有类似的上调或下调，值得注意的是，上调的p53信号与观察到的TP53蛋白水平的增加一致；然后通过比较肿瘤、二维细胞系、类器官和PDX的维恩图显示，大多数差异表达的基因（1 815个基因）在3个模型和肿瘤样品之间重叠[30]。
总之，用于胰腺癌分析的常用蛋白质生物标志物在胰腺癌类器官和PDX模型与原发性肿瘤之间的表达具有较强的一致性。
3 胰腺癌个体化药物筛选和敏感性测试
近年来，得益于新辅助治疗和辅助治疗在内的综合治疗手段的应用，胰腺癌的5年生存率从5%提高到了10%左右[2]。有证据[61]表明，有效的化疗可使胰腺癌长期存活患者增加1倍。但在多数情况下，不符合手术条件的患者仍主要接受标准化的“一刀切”的非个体化、非特异性的综合化疗，化学药物的选择笼统而没有个体化。胰腺癌类器官可反映原发肿瘤的体内特性，并可在体外进行任意化学药物的测试，可针对不同胰腺癌患者特征制定个体化治疗方案，有望从根本上改善患者的预后[62]。
3.1 胰腺癌类器官模型预测药物反应及药物筛选
目前，治疗胰腺癌的有效手段主要依赖于原发肿瘤的完全手术切除和有效的全身化疗的使用，选择合适的化疗药物对于患者预后极其重要。在一项前瞻性研究[63]中，从16例胰腺癌患者中生成了胰腺癌类器官，并通过使用标准化疗药物进行系统药物筛选，对于从未接受过治疗患者的预测药物反应准确率为90%，对于接受过治疗的患者预测药物反应准确率为80%。胰腺癌类器官预测药物反应和药物筛选对患者的预后有明显影响，如纳米白蛋白结合型紫杉醇/吉西他滨或FOLFIRINOX（亚叶酸、氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂）治疗晚期胰腺癌患者。然而当使用胰腺癌类器官预测结果作为临床支持时必须考虑诸如实际患者需要立即治疗时，类器官相对较长的培养时间或在药物分型过程中获得亲本肿瘤的耐药性等限制。近年来，随着3D打印以芯片格式生成微流体系统技术的进步，实现了大规模标准化药物筛选，并在多个胰腺癌类器官线上并行自动读出[64]。由此可见，胰腺癌类器官可为临床预测药物反应和药物筛选提供指导。
3.2 利用胰腺癌类器官模型进行药物敏感性测试
类器官作为个体化的临床前模型，可以对每例患者进行药物敏感性测试，准确反映每个患者对于不同化疗药物的敏感性。Romero-Calvo等[30]将胰腺癌一线化疗药物吉西他滨用于2例不同胰腺癌患者的类器官，结果显示，2例患者之间存在明显的药物敏感性差异；进一步将联合化疗FOLFIRINOX方案及吉西他滨联合白蛋白紫杉醇方案分别用于同一患者的类器官及PDX，结果显示，肿瘤在体内与体外表现出的药物敏感性一致，并与患者临床实际情况相符合。有研究[65]在12例胰腺癌患者的类器官中测试了对吉西他滨、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康的活性代谢物SN-38、紫杉醇和其他药物的敏感性，在此基础上计算了49个剂量-反应曲线下的独立面积并标准化，通过在每个胰腺癌类器官上测试的每种药物的独立受试者操作特征曲线下面积评估进行比较，为每例患者制定出个体化治疗的排名，结果发现，胰腺癌患者的临床结果与胰腺癌类器官药物敏感性数据之间有高度相关性，强烈表明胰腺癌类器官模型中的药物敏感性具有预测临床反应的能力。Huang等[66]团队在5例胰腺癌患者的类器官中进行表观遗传调控因子组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂UNC1999的敏感性试验，结果显示，在5例胰腺癌患者的类器官中，有3例对UNC1999敏感，并且对应的原肿瘤组织中呈组蛋白H3乙酰化赖氨酸27三甲基化阳性，而不敏感的2例均为组蛋白H3乙酰化赖氨酸27三甲基化阴性，结果提示，类器官模型能够维持原肿瘤组织的特性，可以进行表观遗传学小分子化合物的筛选。
从类器官模型能够维持原肿瘤组织特性的研究结果及胰腺癌类器官药物敏感性数据与胰腺癌患者的临床结果之间存在高度相关性的结果提示，未来可参照胰腺癌类器官药物敏感性的数据，以避免无效化疗，以提高治疗应答率和减轻化疗毒性，也可用胰腺癌类器官模型中化疗的受试者操作特征曲线下面积合理选择胰腺癌患者的个体化治疗方案，延长患者生存时间和提高患者生存质量。
4 总结与展望
胰腺癌类器官为胰腺癌患者寻求新的潜在诊断生物标志物成为可能。胰腺癌类器官作为药物敏感性和耐药性检测平台，在胰腺癌的药物治疗研究中具有潜在的价值，可对患者样本进行离体药物测试，可用于临床治疗决策个体化药物选择。尤其随着基因编辑技术的发展，有望将该技术与类器官技术相结合，从而发现控制治疗敏感性的关键分子节点，并探索新的治疗方法或弥补现有治疗方法的缺陷，同时要加强基础研究向临床研究与治疗的转化，通过对原发性肿瘤和（或）转移性肿瘤进行活检，从无法切除的患者身上获取新鲜的肿瘤组织以构建类器官模型或利用基因编辑进行类器官模型重编辑与修饰，再应用于胰腺癌的发病机制研究，从而为胰腺癌患者提供个体化的治疗。
重要声明
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